嗜熱鏈球菌抑制法測定鮮乳中抗生素殘留檢驗(yàn)方法的優(yōu)化

◎ 張 艷，王琳帆，張文博，陳奕杉，賀珊珊

（富平縣檢驗(yàn)檢測中心，陜西 富平 711700）

抗生素不僅是人類治療疾病的常用藥物，還是治療動物疾病的常用藥物[1]。目前常用的抗生素主要有青霉素、鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素等。該類抗生素對大量的化膿性細(xì)菌，如葡萄球菌、鏈球菌等均有很好的抑制作用，從而可以治療奶牛的乳房炎等疾病。很多養(yǎng)殖戶為了治療或者預(yù)防奶牛乳房炎，存在抗生素用藥不當(dāng)或?yàn)E用的情況。抗生素容易在動物體內(nèi)及鮮乳中殘留，不僅影響鮮乳品質(zhì)，還會危害人類健康[2]?！妒称沸l(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 鮮乳中抗生素殘留檢驗(yàn)》（GB/T 4789.27—2008）第一法嗜熱鏈球菌抑制法，就是基于抗生素對鏈球菌屬的抑制原理來測定鮮乳中的抗生素殘留[3]。通過調(diào)研當(dāng)?shù)厝槠芳庸て髽I(yè)以及檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該檢驗(yàn)方法準(zhǔn)確度低，經(jīng)常出現(xiàn)假陰性結(jié)果，目前多用試劑盒免疫分析法進(jìn)行抗生素檢測。由于試劑盒法僅能作為企業(yè)內(nèi)檢，無法出具正式檢驗(yàn)報告，故需對該方法進(jìn)行優(yōu)化，提高靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

鮮羊乳，富平縣韋村奶山羊養(yǎng)殖戶。

嗜熱鏈球菌菌株（菌株標(biāo)準(zhǔn)編號：ATCC14485；批號：20210330），廣東省微生物菌種保藏中心；無抗生素脫脂牛乳粉（伊利脫脂奶粉，批號：20220310），New Zealand Nutritional Wellness Limited；2,3,5-氯化三苯四氮銼（TTC）（CAS NO：298-96-4；批號：211226），上海藍(lán)季生物；青霉素G 鉀標(biāo)準(zhǔn)品（CAS NO：113-98-4；批號：21070867），壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS NO：3810-74-0；批號：130308-201514），中國食品藥品檢定研究院；慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS NO：1405-41-0；批號：130326-201716），中國食品藥品檢定研究院；卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS NO：25389-94-0；批號：130319-201511），中國食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器設(shè)備

SPX-150B-Ⅱ恒溫培養(yǎng)箱，上海悅豐儀器儀表有限公司；HH-S8A 電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；天平、LS-100HG 立式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；BSC-1300-Ⅱ A2 生物安全柜，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；MX-S可調(diào)式混勻儀，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京股份有限公司；無菌刻度吸管（1 mL，具0.01 mL 刻度；10.0 mL，具0.1 mL 刻度）；移液槍（50～200 μL，200～1 000 μL）；無菌試管（18 mm×180 mm）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 檢驗(yàn)原理

樣品經(jīng)80 ℃殺菌后，添加定量的嗜熱鏈球菌菌液，經(jīng)過培養(yǎng)嗜熱鏈球菌開始增殖。這時加入代謝底物2,3,5-氯化三苯四氮唑（2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazolium Chloride，TTC），若樣品中不含有抗生素或者抗生素的濃度低于檢測限，嗜熱鏈球菌將繼續(xù)增殖，還原TTC 為紅色物質(zhì)[4]。相反，如果樣品中含有高于檢測限的抗生素，則嗜熱鏈球菌增殖受到抑制，TTC 不會被還原，保持原色。

1.3.2 試劑準(zhǔn)備

（1）滅菌脫脂乳。稱取9.00 g 無抗生素脫脂牛乳粉，加入50 ℃的蒸餾水90 mL，攪拌使其完全溶解，并分裝于試管中（9 mL/支），115 ℃滅菌20 min。

（2）4% 2,3,5-氯化三苯四氮銼水溶液。稱取1.00 g TTC 溶解于25 mL 蒸餾水中，115 ℃滅菌20 min。

（3）青霉素G 參照溶液。用無菌磷酸鹽緩沖液配制青霉素G 鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液約300 IU·mL-1（即190 mg·L-1），用滅菌無抗脫脂乳稀釋至0.06 IU·mL-1（即38 μg·L-1），繼續(xù)用滅菌無抗脫脂乳稀釋至0.006 IU·mL-1（即3.8 μg·L-1），備用。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.3 mg·L-1）。精確稱取30 mg 青霉素G 鉀標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL 容量瓶中，用無菌磷酸鹽緩沖液溶解并定容，配制成300 mg·L-1的青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用無菌磷酸鹽緩沖液稀釋成為0.3 mg·L-1的青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

（2）鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.0 mg·L-1）。精確稱取50 mg 鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL 容量瓶中，用無菌磷酸鹽緩沖液溶解并定容，配制成500 mg·L-1的鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用無菌磷酸鹽緩沖液稀釋成為5.0 mg·L-1的鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

（3）慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.0 mg·L-1）。精確稱取30 mg 慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL 容量瓶中，用無菌磷酸鹽緩沖液溶解并定容，配制成300 mg·L-1的慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用無菌磷酸鹽緩沖液稀釋至3.0 mg·L-1的慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

（4）卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.0 mg·L-1）。精確稱取50 mg 卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL 容量瓶中，用無菌磷酸鹽緩沖液溶解并定容，配制成500 mg·L-1的卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用無菌磷酸鹽緩沖液稀釋成為5.0 mg·L-1的卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.3.4 測試菌液準(zhǔn)備

（1）活化菌種。取一環(huán)嗜熱鏈球菌菌種，接種于9 mL 滅菌脫脂乳中，置于36 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h 后，放于冰箱冷藏備用。

（2）測試菌液。將活化后的菌種接種于9 mL 滅菌脫脂乳中，于36 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h 后，混勻，取1 mL 培養(yǎng)液加入9 mL 滅菌脫脂乳，混勻稀釋成測試菌液。

1.3.5 樣品準(zhǔn)備

以鮮乳為樣品，分別加入國標(biāo)中1 倍檢出限、10 倍檢出限、100 倍檢出限的青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成表1中不同加標(biāo)濃度、不同加標(biāo)物質(zhì)的12 種加標(biāo)樣品。

表1 樣品加標(biāo)濃度表

1.3.6 樣品處理及培養(yǎng)

分別取表1 中12 組加標(biāo)樣品9 mL 于試管中，每份樣品另做一份平行樣，同時再做陰性對照（9 mL 滅菌脫脂乳）和陽性對照（9 mL 0.06 IU·mL-1青霉素G 參照溶液）各一份，所有試管置于80 ℃水浴加熱5 min，冷卻至37 ℃以下，加入測試菌液1.0 mL，輕輕混勻試管，36 ℃水浴2 h，加4% TTC 水溶液0.3 mL，渦旋混勻，36 ℃避光水浴培養(yǎng)30 min，觀察顏色變化。若顏色沒有變化，于36 ℃避光水浴中繼續(xù)培養(yǎng)30 min觀察最終顏色變化（當(dāng)試管中樣品呈乳白色則為抗生素陽性結(jié)果，若試管樣品呈紅色則為抗生素陰性結(jié)果。陽性結(jié)表明樣品中含有高于檢出限的抗生素；陰性結(jié)果表示樣品中不含有抗生素或抗生素濃度低于檢出限），觀察要迅速，避免光照過久出現(xiàn)干擾[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 國標(biāo)法檢測結(jié)果

按照國標(biāo)法對加標(biāo)樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

表2 國標(biāo)法加標(biāo)樣品檢測結(jié)果表

由表2 可知，陽性對照結(jié)果為陽性，陰性對照結(jié)果為陰性，表明該檢驗(yàn)過程有效，不存在外在污染。加標(biāo)樣品檢出陽性結(jié)果的最低加標(biāo)濃度即為加標(biāo)抗生素（青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素）的最低檢出限[6]。結(jié)合表1、表2 結(jié)果，常見抗生素的最低檢出限分別為青霉素30 μg·L-1、鏈霉素5 000 μg·L-1、慶大霉素3 000 μg·L-1、卡那霉素5 000 μg·L-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明按照GB/T 4789.27—2008 檢驗(yàn)常見抗生素的最低檢出限高于國標(biāo)中最低檢出限，檢驗(yàn)方法的靈敏度低。

2.2 方法優(yōu)化

2.2.1 原因分析

常見抗生素的最低檢出限過高可能是嗜熱鏈球菌添加量過大，所添加的低濃度抗生素?zé)o法完全抑制嗜熱鏈球菌的增殖，從而顯示陰性。

2.2.2 解決方案

為了檢出低濃度的抗生素殘留，對檢驗(yàn)方法進(jìn)行優(yōu)化。配制添加國標(biāo)最低檢出限濃度的青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的加標(biāo)樣品，作為樣品中抗生素殘留量，通過調(diào)節(jié)嗜熱鏈球菌添加量來驗(yàn)證檢出濃度。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)方法

（1）測試菌液制備。將經(jīng)活化的嗜熱鏈球菌菌株接種到9 mL 滅菌脫脂乳中，置于36 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h，取1 mL 培養(yǎng)液加入9 mL 滅菌脫脂乳，混勻成為測試菌液，備用。

（2）樣品準(zhǔn)備。①樣A：100 mL 容量瓶中加入1.0 mL 0.3 mg·L-1青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用鮮乳樣品定容至刻度，制成青霉素殘留濃度為3.0 μg·L-1的加標(biāo)樣品。②樣B：100 mL 容量瓶中加入1 mL 5.0 mg·L-1鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用鮮乳樣品定容至刻度，制成鏈霉素殘留濃度為50 μg·L-1的加標(biāo)樣品。③樣C：100 mL 容量瓶中加入1 mL 3.0 mg·L-1慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用鮮乳樣品定容至刻度，制成慶大霉素殘留濃度為30 μg·L-1的加標(biāo)樣品。④樣D：100 mL 容量瓶中加入1 mL 5 mg·L-1卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用鮮乳樣品定容至刻度，制成卡那霉素殘留濃度為50 μg·L-1的加標(biāo)樣品。

（3）樣品處理及培養(yǎng)。分別取2.2.3（2）樣品各9 mL于試管中，每份樣品取10 份，同時再做陰性對照（9 mL滅菌脫脂乳）和陽性對照（9 mL 0.006 IU·mL-1青霉素G 參照溶液）各5 份，所有試管置于80 ℃水浴加熱5 min，冷卻至37 ℃以下，分別加入50 μL、100 μL、300 μL、500 μL、1 mL 測試菌液，輕輕混勻試管，36 ℃水浴2 h，加4% TTC 水溶液0.3 mL，渦旋混勻，36 ℃避光水浴培養(yǎng)30 min，觀察顏色變化，如顏色沒有變化，于36 ℃避光水浴中繼續(xù)培養(yǎng)30 min 作最終觀察，觀察要迅速，避免光照過久出現(xiàn)干擾。

2.3 優(yōu)化方法的結(jié)果與分析

方法優(yōu)化后，按照國標(biāo)添加量1 mL 的0.05 倍、0.1 倍、0.3 倍、0.5 倍和1.0 倍添加不同量測試菌液，檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 添加不同量測試菌液檢驗(yàn)結(jié)果表

由表3 可知，當(dāng)加50 μL 測試菌液時，陰性對照檢測結(jié)果為陽性，實(shí)驗(yàn)失敗。而當(dāng)加100 μL 測試菌液時，加標(biāo)樣品均能檢出陽性，陰性、陽性對照符合要求。當(dāng)測試菌液加量后均檢出陰性結(jié)果。當(dāng)添加菌量為100 μL 時，常見抗生素的最低檢出限分別為青霉素3.0 μg·L-1、鏈霉素50 μg·L-1、慶大霉素30 μg·L-1、卡那霉素50 μg·L-1。表明可以通過適當(dāng)減少嗜熱鏈球菌的添加量來提高該檢驗(yàn)方法的靈敏度。

3 結(jié)論

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，按照GB/T 4789.27—2008 檢驗(yàn)方法的靈敏度低，可以通過適當(dāng)減少嗜熱鏈球菌的添加量來提高該檢驗(yàn)方法的靈敏度。