UPLC-MS/MS 法測定豬肉中氯霉素殘留量的不確定度分析

◎ 宋春雪

(盤錦檢驗檢測中心，遼寧 盤錦 124000）

氯霉素是抗生素的一種，用來治療水產(chǎn)以及畜禽等動物與細菌相關(guān)的各種疾病，藥性較好，作用顯著，但其會殘留在動物體內(nèi)。人們長期食用含有此類藥物的食品，可能罹患血液疾病[1]。因此，與氯霉素相關(guān)的藥物已成為獸藥殘留必檢的項目[2]。目前，檢測氯霉素的方法有液相色譜法、氣相色譜法、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）[3]。其中，檢測相同濃度的氯霉素時，使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測具有靈敏度、準確度和精密度更高的特點[4]。由于動物源性食品成分復(fù)雜，為使檢測結(jié)果更可信，對不確定度進行測量評定非常有必要[5]。本文深入探討使用UPLC-MS/MS 檢測豬肉中氯霉素殘留量時的各種影響因素，并對這些影響因素進行分析，為其他相關(guān)聯(lián)獸藥殘留量測量提供相關(guān)資料。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

AB4000QTRAP 液質(zhì)聯(lián)用儀（AB 公司）；FA2004N電子天平（上海精密儀器有限公司）；VORTEX-6 型旋渦儀（其林貝爾公司）；HSC-24B 氮吹儀（恒奧科技發(fā)展有限公司）；RV10 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA）；Z36HK型高速離心機（其林貝爾公司）。

1.2 材料與試劑

豬肉為當?shù)厥惺凵唐?，來源于新發(fā)地批發(fā)市場。

LC-Si 固相萃取柱（200 mg，3 mL，逗點公司）；微孔濾膜（0.22 μm，Agilent）；正己烷（色譜純，F(xiàn)isher）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher）；丙酮（色譜純，F(xiàn)isher）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher）；正丙醇（分析純，國藥）；標準品：氯霉素（純度為99.3%，不確定度為0.03%，k=2，德國Dr）、氯霉素-D5（濃度為100 μg·mL-1，不確定度為1.2%，k=2，德國Dr）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

根據(jù)國標GB/T 22338—2008 中3.4 部分進行樣品制備與保存，3.5 部分進行樣品提取與凈化。

1.3.2 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣體積：5 μL；流動相：A 相為乙腈，B 相為10 mmol·L-1乙酸銨溶液。梯度洗脫程序：0 min，10% A；1.00 min，10% A；2.50 min，90% A；5.50 min，90% A；5.51 min，10% A；7.00 min，10% A。

（2）質(zhì)譜條件。電離方式：ESI-；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測；離子電壓：-4 500 V；離子源溫度：550 ℃；其掃描采集參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據(jù)測定過程，分析了影響結(jié)果的各種分量的來源，主要包括4 方面內(nèi)容。①重復(fù)性測量。②樣品稱量過程。③樣品定容過程（包括定容過程中溫度變化）。④標準物質(zhì)的純度、標準溶液配制及標準曲線擬合。

2.2 不確定度的評定

2.2.1 測量結(jié)果重復(fù)性引入的相對標準不確定度urel(rep)

對樣品進行6 次平行測量，測得氯霉素含量xi分別為1.92 μg·kg-1、1.90 μg·kg-1、1.94 μg·kg-1、1.89 μg·kg-1、1.84 μg·kg-1和1.86 μg·kg-1，平行測定結(jié)果的平均值為1.89 μg·kg-1。

單次測定的標準偏差為

測量結(jié)果重復(fù)性引入的相對標準不確定度為

2.2.2 樣品稱量過程引入的相對標準不確定度urel(m)

用分析天平稱取5.000 g 樣品，稱量的最大允許誤，則樣品稱量過程引入的相對標準不確定度為差為0.1 mg，按均勻分布處理

2.2.3 樣品定容過程引入的相對標準不確定度urel(V)

用A 級刻度吸管吸取5 mL 丙酮-正己烷（體積比為1∶9），其允差為±0.025 mL，按均勻分布處理，其相對標準不確定度為

樣品最終用1 mL A 級刻度吸管定容并上樣分析，其允差為±0.008 mL，按均勻分布處理其相對標準不確定度為

綜上，可得樣品定容過程引入的相對標準不確定度為

2.2.4 標準物質(zhì)的純度、標準溶液配制及標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(C)

（1）標準物質(zhì)的純度引入的不確定度。由標準物質(zhì)信息可知氯霉素外標純度引入的不確定度為0.03%（k=2）；氯霉素內(nèi)標純度引入的不確定度為1.2%（k=2），則氯霉素外標、內(nèi)標純度引入的相對標準不確定度分別為

（2）標準溶液配制過程引入的不確定度。①1 mg·mL-1氯霉素配制過程：準確稱取氯霉素標準品物質(zhì)0.010 07 g，用甲醇溶解、定容至（10±0.02）mL容量瓶。標準物質(zhì)的稱量和定容引入的相對標準不確定度分別為

1 μg·mL-1氯霉素-D5標準儲備液配制過程為精密吸取氯霉素-D5內(nèi)標（100±1）μL 于（10±0.02）mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。標準物質(zhì)的吸取和定容引入的相對標準不確定度分別為

②標準中間液引入的不確定度。1 μg·mL-1氯霉素標準中間液配制過程為精密吸取氯霉素標準儲備液（100±1）μL 于（100±0.10）mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。標準物質(zhì)的吸取和定容引入的相對標準不確定度分別為

③標準工作液引入的不確定度。100 ng·mL-1氯霉素標準工作液配制過程為精密吸取氯霉素標準中間液（1 000±10）μL 于（10±0.02）mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。標準物質(zhì)的吸取和定容引入的相對標準不確定度分別為

100 ng·mL-1氯霉素-D5標準工作液配制過程為精密吸取氯霉素D5標準儲備液（1 000±10）μL 于（10±0.02）mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。標準物質(zhì)的吸取和定容引入的相對標準不確定度分別為

④混合標準工作液引入的不確定度。準確吸取100 ng·mL-1氯 霉素標準工 作液（200±2）μL，100 ng·mL-1氯霉素-D5標準工作液（500±5）μL，用空白基質(zhì)液稀釋、定容至（10±0.02）mL 容量瓶中，配成標準工作液的濃度為2 ng·mL-1，內(nèi)標為5 ng·mL-1。

則吸取（200±2）μL 氯霉素標準工作液引入的相對標準不確定度為

將（200±2）μL 氯霉素標準工作液定容到（10±0.02）mL 容量瓶引入的相對標準不確定度為

吸?。?00±5）μL 氯霉素-D5標準工作液引入的相對標準不確定度為

將（500±5）μL 氯霉素-D5標準工作液定容到（10±0.02）mL 容量瓶引入的相對標準不確定度為

（3）溫度變化引入的不確定度。上述標準溶液配制過程中用到了10 mL 和100 mL 容量瓶，在使用容量瓶過程中，溫度的變化也會導(dǎo)致容量瓶體積的微量變化，導(dǎo)致不確定度的引入。假設(shè)室溫有3 ℃差異（ΔT=3），液體膨脹系數(shù)ρ=1.18×10-3/℃，則溫度變化引入的相對標準不確定度分別為

（4）標準曲線擬合引入的不確定度（最小二乘法擬合）。用配制的混合標準工作液上機測定3 次，得到的峰面積比分別為0.673、0.664、0.654，則平均峰面積比為0.664，標準曲線為y=0.332x，r=0.999 9。標準曲線剩余標準差計算為

式中：yi為各個標準溶液濃度對應(yīng)的響應(yīng)值；y為根據(jù)標準曲線算出的理論響應(yīng)值；n為標準曲線的點數(shù)（由于每個點測3 次，n=3）。

標準曲線擬合引入的標準不確定度為

則標準曲線擬合引入的相對標準不確定度為

綜上，標準物質(zhì)的純度、標準溶液配制及標準曲線擬合引入的相對標準不確定度為

2.2.5 合成不確定度

將各不確定度分量匯總，合成不確定度為

2.2.6 擴展不確定度及結(jié)果表示

3 結(jié)論

本文使用UPLC-MS/MS 法檢測了豬肉中氯霉素的殘留量，建立了特定的數(shù)學(xué)模型，并用此模型對不確定度進行了計算、模擬和評估。在整個的實驗過程中，能夠引入不確定度的過程很多，包括稱量、提取、凈化、質(zhì)譜測定等。本實驗從標準系列溶液配制、樣品前處理、樣品重復(fù)測定、標準曲線擬合這4 個方面分析評定引入的不確定度。結(jié)果表明，標準溶液配制、標準曲線擬合這2 個步驟引入的不確定度分量最大，其次是體積量取和測量重復(fù)性這2 個過程。因此，可以通過提高標準品純度、對前處理各步驟進行優(yōu)化、增加測定重復(fù)次數(shù)、提高UPLC-MS/MS 靈敏度、對所用到的儀器定期進行檢定以及不斷提高化驗員的實驗水平等方式對測量不確定度進行控制，以確保檢測結(jié)果的準確性。