基于AMPK信號通路探究櫻桃李多酚提取物對胰島素抵抗HepG2細胞糖代謝的作用*

蘇黑艷·帕爾哈提，張姣姣，王俊人，趙家琪，李艷紅

（新疆特殊環(huán)境物種多樣性應(yīng)用與調(diào)控實驗室，新疆特殊環(huán)境物種保護與調(diào)控生物學(xué)實驗室，新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054）

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種常見的代謝性疾病，在全球約5.37 億糖尿病病例中占90%［1］。T2DM 的主要發(fā)病機制是胰島素抵抗，胰島素抵抗會導(dǎo)致β 細胞損傷、凋亡和血糖水平升高，從而發(fā)展為T2DM［2-3］。胰島素抵抗主要發(fā)生在肝臟、脂肪和骨骼肌，其中肝臟作為糖脂代謝的樞紐，通過調(diào)節(jié)肝葡萄糖的利用或產(chǎn)生，在維持血漿葡萄糖水平方面起著至關(guān)重要的作用［4］。

AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是普遍存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被提議作為“燃料計”［5］。研究表明，AMPK 的激活在調(diào)節(jié)體重，全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)，脂質(zhì)代謝和線粒體生物發(fā)生過程中起著重要作用，暗示其可成為治療糖尿病的潛在靶點。AMPK 作為肝臟中調(diào)節(jié)糖、脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵激酶，激活后可促進葡萄糖和脂肪酸的攝取并抑制葡萄糖和脂質(zhì)合成，從而能夠有效緩解肝臟糖、脂代謝紊亂［6］。同時，AMPK 的激活可降低轉(zhuǎn)錄因子FoxO1 和PGC-1α 的表達，并進一步抑制糖異生途徑中G6Pase 和PEPCK 的表達，從而達到降低血糖水平的目的［7，11］。此外，糖原合成激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）位于幾個信號軸的匯合處，包括PI3K/AKT/mTOR、AMPK 和Wnt 通路，其影響蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成、葡萄糖和線粒體代謝［12］。

多酚作為天然植物中一類次生代謝物，在各項生命活動中發(fā)揮著重要作用［8］。目前，被報道的天然多酚種類較多，其中大多數(shù)黃酮類化合物在體內(nèi)和體外模型實驗中表現(xiàn)出能夠調(diào)節(jié)糖脂代謝和改善胰島素抵抗等作用。

櫻桃李（PrunuscerasiferaEhrh.）為薔薇科李屬，主要分布于新疆伊犁霍城縣。前期，課題組檢測發(fā)現(xiàn)櫻桃李果實含有豐富的多酚類物質(zhì)［9］，能夠通過激活A(yù)MPK 信號通路調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子來改善肥胖小鼠脂代謝紊亂［10］。櫻桃李多酚提取物是否具有調(diào)節(jié)糖代謝的作用未見報道。本研究利用高糖高胰島素誘導(dǎo)建立胰島素抵抗HepG2 細胞（IR-HepG2）模型，評價櫻桃李多酚提取物對IR-HepG2 細胞糖代謝的改善作用及可能機制，為進一步在動物水平深入研究櫻桃李多酚的降糖功能提供實驗基礎(chǔ)，同時為櫻桃李的開發(fā)利用提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細胞與實驗材料

HepG2 細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；高糖DMEM 培養(yǎng)液、低糖MEM 培養(yǎng)液、PBS 緩沖液、青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶購自HyClone；胎牛血清購自ABI；葡萄糖含量檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；胰島素、MTT、BCA 試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；Trizol、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；蛋白檢測所用Ⅰ抗、Ⅱ抗及顯色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TEMED、MTT 和PVDF 膜購自Sigma；所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

櫻桃李多酚提取物（PrunuscerasiferaEhrh. polyphenol extract，PCE），本課題組前期采用有機溶劑法提?。?］。

2 方法

2.1 胰島素抵抗模型的建立及鑒定 HepG2 細胞用含10%血清、1%雙抗的低糖MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，當(dāng)細胞融合到70%時，用含10 mg/L 胰島素的高糖DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h，檢測培養(yǎng)液中葡萄糖含量，確定HepG2細胞形成胰島素抵抗模型。

2.2 實驗分組 將HepG2 細胞分為對照（control，Con）組、胰島素抵抗（insulin resistance，IR）模型組、二甲雙胍（metformin，Met）組（IR+Met）、IR+PCE 組，除對照組外，其他組細胞均進行胰島素抵抗模型構(gòu)建，櫻桃李多酚提取物組細胞分別用100、200、400 mg/L 的PCE 進行干預(yù)，二甲雙胍組用2 mmol/L 的二甲雙胍進行處理。

2.3 MTT 法測定細胞活力 收集對數(shù)期細胞，接種至96孔板，每孔約5×103個細胞，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度（50、100、200、400、600、800、1000、1 200 和1 500 mg/L）的PCE 200 μL，處理24 h（每個處理6 個復(fù)孔），對照孔加入等體積的培養(yǎng)液，24 h 后，每孔加入20 μL 5 g/L 的MTT 溶液反應(yīng)4 h，加入150 μL DMSO，用酶標儀測570 nm 處的吸光度（A），根據(jù)公式計算細胞相對活力。細胞相對活力（%）=A570，加藥/A570，空白×100%

2.4 葡萄糖消耗的測定 收集對數(shù)期細胞，接種至96孔板，每孔約5×103個細胞，培養(yǎng)24 h后，分別加入50、100、200和400 mg/L的PCE處理24 h（每個處理6個復(fù)孔），空白對照孔加入等體積的培養(yǎng)液，陽性對照孔加入2 mmol/L 二甲雙胍，收集培養(yǎng)液，按照試劑盒說明書操作，根據(jù)公式計算培養(yǎng)液中葡萄糖的消耗量。葡萄糖消耗量（mmol/L）=空白對照孔培養(yǎng)液葡萄糖濃度-陽性對照孔或藥物處理孔培養(yǎng)液葡萄糖濃度。

2.5 Real-time PCR 檢測基因的表達 分別以100、200 和400 mg/L 的PCE 處理24 h 后，離心收集細胞，采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)基因序列設(shè)計特異性引物，引物序列見表1。以β-actin為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

2.6 Western blot 檢測蛋白的表達 分別以100、200 和400 mg/L 的PCE 處理24 h 后，離心收集細胞，加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA 法定量蛋白濃度，12% SDS-PAGE 分離蛋白，再以濕法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉溶液封閉，并先后加入Ⅰ抗、Ⅱ抗進行孵育。采用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，化學(xué)發(fā)光儀拍照，ImageJ 軟件對蛋白條帶進行灰度分析，計算蛋白的相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。采用GraphPad Prism 8.0 和SPSS 23.0 軟件進行分析。各組均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PCE對HepG2細胞活力的影響

檢測不同濃度的PCE 處理HepG2細胞后的細胞活力，確定PCE 對HepG2 細胞的毒性作用。結(jié)果顯示，與對照組相比，50、100、200和400 mg/L的PCE對HepG2 細胞活力無顯著影響（P＞0.05），而600、800、1 000、1 200 和1 500 mg/L 的PCE 可顯著降低HepG2細胞活力（P＜0.01），見圖1。因此，后續(xù)實驗選用50、100、200和400 mg/L的濃度進行處理。

Figure 1. Effect of different concentrations of PCE on HepG2 cell activity. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs Con group.圖1 不同濃度PCE對 HepG2細胞活力的影響

2 PCE對IR-HepG2細胞葡萄糖消耗的影響

檢測不同濃度PCE 處理HepG2細胞后的葡萄糖消耗量，確定PCE 對IR-HepG2 細胞葡萄糖消耗的改善作用。與Con 組相比，IR 組的葡萄糖消耗量顯著降低（P＜0.01），表明其胰島素抵抗模型建模成功，可用于后續(xù)實驗。Met 能顯著升高胰島素抵抗HepG2細胞的葡萄糖消耗（P＜0.01）。PCE 干預(yù)細胞后，葡萄糖消耗量逐漸升高，呈劑量依賴性，說明PCE 可減輕胰島素抵抗。但濃度為50 mg/L 時，與IR 組相比，無顯著性差異（P＞0.05），見圖2。因此，后續(xù)選擇100、200和400 mg/L的PCE進行實驗。

Figure 2. Effect of PCE on glucose consumption of IR-HepG2 cells. Mean±SD. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs Con group； ##P＜0.01 vs IR group； △P＜0.05，△△P＜0.01 vs IR+Met group.圖2 PCE對IR-HepG2細胞葡萄糖消耗的影響

3 PCE 對IR-HepG2 細胞糖異生相關(guān)因子mRNA及蛋白表達的影響

采用real-time PCR 和Western blot檢測糖異生途徑中PGC-1α、FoxO1、G6Pase 和PEPCK mRNA 及蛋白的表達水平，確定PCE 對IR-HepG2 細胞糖異生的作用。在mRNA 及蛋白水平，與Con 組相比，IR 組的FoxO1、PGC-1α、G6Pase 和PEPCK 的表達量顯著提高（P＜0.05）；與IR 組相比，100、200 和400 mg/L PCE和Met 處理后，除100 mg/L PCE 處理的IR-HepG2 細胞FoxO1 蛋白表達量顯著升高，其他組IR-HepG2 細胞的FoxO1、PGC-1α、G6Pase 和PEPCK mRNA 和蛋白的表達量均顯著降低（P＜0.05），見圖3、4。

Figure 3. Effect of PCE on mRNA expression of PGC-1a，F(xiàn)oxO1，G6Pase and PEPCK in IR-HepG2 cells. Mean±SD. n=5. *P＜0.05，**P＜0.01 vs Con group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs IR group； △P＜0.05，△△P＜0.01 vs IR+Met group.圖3 PCE對 IR-HepG2細胞糖異生相關(guān)因子mRNA表達的影響

Figure 4. Effect of PCE on expression of gluconeogenesis-related proteins （PGC-1a，F(xiàn)oxO1，G6Pase and PEPCK） in IR-HepG2 cells. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs Con group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs IR group； △P＜0.05，△△P＜0.01 vs IR+Met group.圖4 PCE對IR-HepG2細胞糖異生相關(guān)蛋白表達的影響

4 PCE 對IR-HepG2 細胞糖原合成相關(guān)因子mRNA及蛋白表達的影響

檢測糖原合成途徑GSK3β mRNA 及蛋白的表達，確定PCE 對IR-HepG2 細胞糖原合成的促進作用。與Con 組比較，IR 組HepG2 細胞中GSK3β mRNA 和蛋白表達量均顯著上調(diào)（P＜0.01）；與IR 組比較，100、200 和400 mg/L PCE 和Met 處理細胞后，細胞中GSK3β mRNA和蛋白表達量均顯著降低且接近于正常組（P＜0.05），見圖5。

Figure 5. Effect of PCE on mRNA （A） and protein （B） expression of GSK3β in IR-HepG2 cells. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs Con group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs IR group； △P＜0.05，△△P＜0.01 vs IR+Met group.圖5 PCE對IR-HepG2細胞糖原合成相關(guān)因子GSK3β mRNA及蛋白表達的影響

5 PCE 對IR-HepG2 細胞AMPK mRNA 及蛋白表達的影響

與Con 組相比，IR 組HepG2 細胞AMPK mRNA水平及p-AMPK/AMPK 比值顯著降低（P＜0.01）。與IR 組相比，200、400 mg/L PCE 處理組和IR+Met 組的AMPK mRNA 水平及p-AMPK/AMPK 比值均顯著升高（P＜0.05），見圖6。

Figure 6. The effect of PCE on AMPK mRNA （A） and protein （B） expression in IR-HepG2 cells. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs Con group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs IR group； △△P＜0.01 vs IR+Met group.圖6 PCE對IR-HepG2細胞AMPK mRNA及蛋白表達的影響

討 論

胰島素抵抗是代謝障礙人群發(fā)展為2 型糖尿病的主要病因之一［13］。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，肝臟胰島素抵抗是肥胖、非酒精性脂肪肝等代謝性疾病的共同特征［14］。因此，研發(fā)改善胰島素抵抗的藥物并探討其發(fā)病機制，對代謝性疾病的治療具有重要的現(xiàn)實意義。二甲雙胍是治療2 型糖尿病常用的口服降糖藥，但伴隨著明顯的副作用，如胃脹等［15-16］。相較于西藥，天然活性物質(zhì)在改善胰島素抵抗方面具有一定的優(yōu)勢。故本研究利用高糖高胰島素誘導(dǎo)胰島素抵抗細胞模型，檢測細胞活力及葡萄糖消耗量。結(jié)果顯示，IR 模型組的葡萄糖消耗量顯著低于Con組，說明胰島素抵抗模型構(gòu)建成功。隨著PCE 濃度的增加，葡萄糖消耗量逐漸增加且呈劑量效應(yīng)；高濃度的PCE 對細胞生長增殖有抑制作用，但整體仍表現(xiàn)對葡萄糖消耗的促進作用。

糖異生在糖代謝方面發(fā)揮著重要作用，尤其是氨基酸等非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖的過程，其中PEPCK 和G6Pase 是調(diào)節(jié)糖異生的兩個關(guān)鍵酶，F(xiàn)oxO1 和PGC-1α 是兩個重要的轉(zhuǎn)錄因子，間接調(diào)節(jié)糖異生途徑［17］。已有研究表明，當(dāng)細胞處于胰島素抵抗時，F(xiàn)oxO1 和PGC-1α 轉(zhuǎn)錄活性就會增強，從而增加了PEPCK 和G6Pase 的活性，促進糖異生［18］。Xia 等［19］研究表明多酚類物質(zhì)可以逆轉(zhuǎn)這種結(jié)果的發(fā)生，通過抑制FoxO1 和PGC-1α 轉(zhuǎn)錄活性來抑制PEPCK 和G6Pase 酶的活性。以上研究提示FoxO1、PGC-1α、PEPCK 和G6Pase在調(diào)節(jié)糖代謝中發(fā)揮著重要作用。本研究使用不同濃度的PCE 干預(yù)胰島素抵抗HepG2 細胞，檢測其糖異生相關(guān)因子mRNA 及蛋白的表達，結(jié)果顯示PCE 能通過降低轉(zhuǎn)錄因子FoxO1、PGC1-α 的表達，抑制G6Pase、PEPCK 酶的表達，從而抑制糖異生的發(fā)生，并改善HepG2細胞的胰島素抵抗。

除了調(diào)節(jié)糖異生之外，調(diào)節(jié)糖原的合成也可以維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)。GSK3β 是抑制糖原合成的限速酶，參與血糖調(diào)節(jié)、胰島素匱乏和胰島素抵抗［20］。Zhang 等［21］研究表明，二芳基庚烷（DPH5）減輕胰島素抵抗HepG2 細胞的作用機制與PI3K/AKT 和Nrf2/HO-1 介導(dǎo)的GSK3β 信號通路調(diào)節(jié)有關(guān)。Guo 等［22］通過體外模型，證明了肝細胞中GSK3β的磷酸化，能控制胰腺β 細胞增殖，從而減輕胰島素抵抗。Wang等［23］研究表明，棕櫚酸酯通過降低胰島素抵抗HepG 2 細胞GSK3β 蛋白表達，增加p-GSK3β 的表達來改善胰島素抵抗。本研究結(jié)果顯示，PCE 能夠顯著降低GSK3β基因及蛋白的表達水平，促進糖原的合成，改善糖代謝。

AMPK 信號通路是細胞能量穩(wěn)態(tài)的主要因素之一，被認為是預(yù)防和治療肥胖和糖尿病的關(guān)鍵靶點［24］。AMPK 在肝臟、骨骼肌組織、脂肪組織和下丘腦中都有作用，能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)和葡萄糖代謝［25-28］。Hao 等［29］研究表明，虎杖苷可通過增加AMPK 和GSK-3β 的磷酸化水平，以及增加肝糖原的生成來調(diào)節(jié)糖代謝。Zhou 等［30］通過體內(nèi)和體外實驗證明，白楊素通過激活A(yù)MPK 途徑調(diào)節(jié)GSK3β、G6Paes、PEPCK 的表達水平，進一步改善糖原合成并抑制糖異生。隨著AMPK 活性的增加，它會抑制多種參與葡萄糖代謝的因子，包括PGC-1α、FoxO1、PEPCK、G6Pase和GSK3β［31-33］。以上研究提示，AMPK 信號通路是改善胰島素抵抗的關(guān)鍵因素。本研究研究顯示，PCE 能激活A(yù)MPK 蛋白的表達，提高AMPK 磷酸化，調(diào)節(jié)下游轉(zhuǎn)錄因子及糖代謝相關(guān)酶的表達，進而調(diào)節(jié)胰島素抵抗HepG 2細胞糖代謝。

綜上所述，櫻桃李多酚提取物能夠提高細胞葡萄糖消耗量，同時能夠通過激活A(yù)MPK 信號通路調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子FoxO1、PGC-1α 及PEPCK、G6Pase、GSK3β 的表達量來減少糖異生和糖原的合成，改善胰島素抵抗狀態(tài)。