環(huán)2-(4-三氟甲基)苯基吡啶釕亞硝酰配合物的合成與光敏NO釋放

李襄宏，吳秋俁，王藝榮，李珍

（中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，武漢 430074）

一氧化氮（NO）作為重要的生物活性分子之一，已被證實(shí)在高濃度（μmol·L-1～mmol·L-1）下可促使細(xì)胞凋亡壞死.隨著光熱及光動(dòng)力治療技術(shù)的發(fā)展，光敏型NO 供體分子包括硝基苯類［1-2］、N-亞硝胺類［3-4］、金屬亞硝酰配合物［5］等的設(shè)計(jì)、合成及性能研究受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注.釕亞硝酰配合物作為NO 分子供體，具有特殊的光敏性、較高的熱穩(wěn)定性、低的細(xì)胞毒性和較好的抗腫瘤活性［6-10］.因此，開發(fā)結(jié)構(gòu)新穎、合成較容易且功能優(yōu)異的新型釕亞硝酰配合物在抗腫瘤治療領(lǐng)域具有重要意義［5］.環(huán)金屬釕配合物以Ru—C 鍵替代Ru—N［11-12］，增加了配合物在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和親脂性，具有更好的生物相容性和對(duì)癌細(xì)胞更強(qiáng)的細(xì)胞毒性［13-14］.然而，基于環(huán)金屬釕亞硝酰配合物的NO 供體分子方面的研究卻比較少見［15-17］，合成新的環(huán)金屬釕類亞硝酰配合物仍然具有很大的挑戰(zhàn)性.

本文以2-（4-三氟甲基）苯基吡啶為C，N-配體，2，2′-二聯(lián)吡啶為N，N-配體，合成了其環(huán)金屬釕配合物［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6，隨后將其與NOBF4反應(yīng)制備得到了環(huán)2-（4-三氟甲基）苯基吡啶釕亞硝酰配合物［Ru（bpy）（4-CF3ppy）（CH3CN）NO］（PF6）2（配合物1，如圖1 所示），核磁、紅外、質(zhì)譜和循環(huán)伏安表征其結(jié)構(gòu)正確.紫外-可見吸收光譜以及EPR 表征說明該配合物可光敏釋放NO.相同條件下，其光敏NO 釋放量顯著高于［Ru（bpy）（ppy）（CH3CN）NO］2+和［Ru（bpy）（4-OCH3ppy）（CH3CN）NO］2+，這一結(jié)果與理論計(jì)算中Ru-N（NO+）的結(jié)合能大小一致.

圖1 釕亞硝酰配合物1的合成Fig.1 Synthesis of ruthenium nitroyl complex 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

甲苯、乙醇、乙腈、石油醚、二氯甲烷等有機(jī)溶劑、碳酸鈉、六氟磷酸銨等無機(jī)鹽（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑）；4-三氟甲基苯硼酸、2-溴吡啶、四（三苯基膦）鈀、對(duì)氨基苯磺酸、85%濃磷酸、N-（1-萘）乙二胺二鹽酸鹽、四丁基六氟磷酸（上海阿拉?。?；四氟硼酸亞硝鎓、NO 自由基捕獲劑2-（4-羧基苯基）-4，4′，5，5′-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物鉀鹽（c-PTIO）（上海麥克林）；［Ru（cymene）Cl2）］2（北京百靈威），所有試劑均為分析純.環(huán)金屬釕亞硝酰配合物［Ru（bpy）（ppy）（CH3CN）NO］2+和［Ru（bpy）（4-OCH3ppy）（CH3CN）NO］2+按文獻(xiàn)［17］方法合成并通過核磁表征；2-（4-三氟甲基苯基）吡啶參考文獻(xiàn)［18］方法合成并通過核磁表征.

核磁共振儀（Ascend Ⅲ TM 600 MHz，Bruker）；質(zhì)譜儀［autoflex TM speed MALDI-TOF，Bruker，以CHCA（α-氰-4-羥基肉桂酸）為基質(zhì)］；紫外-可見分光光度計(jì)（UV-1800PC，上海美析）；紅外光譜儀（Nexus470，Thermo Nicolet）；順磁共振波譜儀（EMX Plus，Bruker）；電化學(xué)工作站［CHI660C，以Ag+/Ag 做參比電極，玻碳電極做工作電極，Pt 絲做對(duì)電極，n-Bu4NBF6（0.1 mol·L-1）做支持電解質(zhì)，乙腈溶液中掃描速度為50 mV·s-1］；氙燈光源系統(tǒng)（CEL-HXF300-T3，中教金源科技）；光功率與能量計(jì)（PM100D，Thorlabs）.

1.2 配合物［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6的合成

氬氣氣氛下，2-（4-三氟甲基苯基）吡啶（0.174 g，0.78 mmol）、KPF6（0.294 g，1.60 mmol）、乙腈12 mL和三乙胺0.35 mL依次加入50 mL三頸瓶中.攪拌均勻后，再加入［Ru（cymene）Cl2）］2（0.300 g，0.5 mmol），在55 ℃下回流16 h.冷卻反應(yīng)液至室溫，旋蒸除掉溶劑得暗紅色固體.繼續(xù)向上述反應(yīng)體系中加入2，2′-二聯(lián)吡啶（0.250 g，1.57 mmol）和甲醇10 mL，回流12 h 后停止反應(yīng)并冷卻至室溫.旋蒸，以二氯甲烷/乙腈作為洗脫劑，通過硅膠柱層析純化，得黑色固體產(chǎn)物0.55 g，產(chǎn)率為70%.1H NMR（600 MHz，CD3CN）δ8.46（d，J=8.3 Hz，1H），8.39（d，J=8.1 Hz，1H），8.33（d，J=7.8 Hz，2H），8.12（d，J=8.0 Hz，1H），8.03～7.92（m，3H），7.88～7.77（m，4H），7.77～7.68（m，3H），7.65～7.61（m，1H），7.44～7.39（m，1H），7.27～7.17（m，3H），7.16（dd，J=8.1，1.3 Hz，1H），7.04～6.99（m，1H），6.69（s，1H）.13C NMR（151 MHz，CD3CN）δ194.87，166.54，158.18，157.43，157.19，155.68，154.74，151.28，150.92，150.76，150.35，149.74，137.18，136.58，135.87，134.88，134.76，131.42，131.40，127.65，127.12，126.98，126.86，124.34，124.10，124.04，123.84，123.76，123.71，120.47.MS（Maldi-TOF，CHCA）：m/z計(jì)算值636.09［M-PF6-］+，實(shí)驗(yàn)值636.23.

1.3 環(huán)金屬釕亞硝酰配合物1的合成與表征

氬氣氣氛下，向三口瓶中依次加入配合物［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6（0.101g，0.13 mmol）、乙腈12 mL和四氟硼酸亞硝鎓（0.076 g，0.65 mmol），在10 ℃下避光反應(yīng)1 h 后，濃縮反應(yīng)液體積至3 mL.室溫下，緩慢加入飽和六氟磷酸銨水溶液10 mL，待固體析出后過濾，用大量去離子水和乙醚洗滌產(chǎn)品，真空干燥后，將其溶解乙腈中，加入乙醚重結(jié)晶得到0.098 g 暗紅色晶體1，產(chǎn)率90%.1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ9.45（dd，J=6.6 Hz，1.2 Hz，1H），9.09～9.00（m，2H），8.89（d，J=8.0 Hz，1H），8.82（d，J=8.0 Hz，1H），8.72（td，J=8.0，1.4 Hz，1H），8.63（td，J=7.9，1.5 Hz，1H），8.49（d，J=8.2 Hz，1H），8.42（td，J=8.0，1.4 Hz，1H），8.24～8.20（m，1H），8.01～7.98（m，1H），7.73（dd，J=8.0，1.2 Hz，1H），7.62～7.58（m，1H），7.22（dd，J=6.6 Hz，1.2Hz，1H），6.71（d，J=1.2 Hz，1H），2.08（s，3H）.13C NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ161.29，155.85，153.32，152.91，150.43，147.13，146.64，143.85，143.79，142.91，130.34，130.02，129.39，128.63，126.77，126.64，126.09，125.38，124.96，124.24，123.64，122.43，118.08，1.15.IR（KBr，cm-1）：1911（νN≡O(shè)），839（νP-F）.MS（Maldi-TOF，CHCA）：m/z計(jì)算值696.01 ［M-PF6-］+，實(shí)驗(yàn)值：696.38，666.28 ［M-PF6-NO］+.

1.4 理論計(jì)算

分子的幾何結(jié)構(gòu)使用Perdew-Burke-Ernzerhof（PBE）方法結(jié)合def2-SVP 基組，通過Gaussian16 軟件進(jìn)行了充分優(yōu)化，采用Grimme 的DFT-D3（BJ）經(jīng)驗(yàn)色散校正.在相同水平上計(jì)算了振動(dòng)頻率，以確認(rèn)所有結(jié)構(gòu)都不具有虛頻，即所優(yōu)化結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于勢能面上的局部極小值.在PBE0/def2-TZVP 級(jí)別上對(duì)Ru 和NO 之間的相互作用能進(jìn)行了計(jì)算，并使用Boys 和Bernardi 提出的counterpoise 方法對(duì)進(jìn)行了基組重疊誤差（BSSE）進(jìn)行了校正，其中相互作用能被定義為復(fù)合物的能量與NO 分子和不包括NO 的結(jié)構(gòu)的能量之差，其中后兩者的幾何結(jié)構(gòu)均凍結(jié)為其在復(fù)合物中的結(jié)構(gòu).在基態(tài)結(jié)構(gòu)下，采用TDPBE0-D3（BJ）/def2-TZVP 計(jì)算了體系的激發(fā)能.根據(jù)Multiwfn 的分析結(jié)果，采用VMD 1.9.3 繪制了HOMO（最高占據(jù)分子軌道）和LUMO（最低未占據(jù)分子軌道）.

1.5 吸收光譜及光敏NO釋放

將配合物1 用乙腈溶解，配成1.0 mmol·L-1儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋至20 μmol·L-1，在用氙燈照射0、10、30、60、120、180 min 后掃描吸收光譜，即得到1 在光照下的吸收光譜變化，光照強(qiáng)度為850 mW·cm-2.

將等體積的1%磺胺酸、5%磷酸和0.1%N-（1-萘）乙二胺二鹽酸鹽水溶液混合制備Griess試劑.將亞硝酸鈉水溶液（5～100 μmol·L-1）與Griess 試劑混合，掃描其吸收光譜，以產(chǎn)生的偶氮染料在540 nm處的吸光度A 為縱坐標(biāo)，NO2-濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.吸取配合物1、儲(chǔ)備液150 μL，Griess 試劑100 μL，配置1 的溶液（50 μmol·L-1）進(jìn)行測試，光照強(qiáng)度為850 mW·cm-2.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測算NO/NO2-的量，以確定配合物1 的光敏NO 釋放量.相同條件和方法測定［Ru（bpy）（ppy）（CH3CN）NO］2+和［Ru（bpy）（4-OCH3ppy）（CH3CN）NO］2+的NO釋放量.

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物的合成與表征

按照文獻(xiàn)［19］方法，首先合成了環(huán)金屬釕配合物［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6，氫譜［圖2（a）］、碳譜［圖2（b）］及質(zhì)譜［圖2（b）插圖］確認(rèn)了其結(jié)構(gòu).這里，圖2（b）碳譜中位于δ194.87 的信號(hào)歸屬于苯環(huán)上與中心釕（Ⅱ）結(jié)合的碳原子特征信號(hào)峰.而圖2（b）插圖質(zhì)譜中位于636.23 處的信號(hào)峰為配合物失去平衡陰離子PF6-后形成的分子離子碎片峰，與理論值636.09 ［M-PF6-］+相符.

圖2 ［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6的NMR譜和質(zhì)譜Fig.2 NMR and MS spectra of ［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6，respectively

隨后，將［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6在弱酸性條件下與亞硝酸鈉進(jìn)行反應(yīng)制備配合物1［16］.由于環(huán)金屬釕配合物中Ru-C在酸性溶液中不穩(wěn)定性［20］，盡管獲得了目標(biāo)配合物1，但產(chǎn)率極低，且副產(chǎn)物多，分離提純困難.因此，以NOBF4代替亞硝酸鈉作為NO 源，將其與［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6進(jìn)行反應(yīng)，后處理得到釕亞硝酰配合物1，產(chǎn)率高達(dá)90%.氫譜［圖3（a）］和碳譜［圖3（b）］中所呈現(xiàn)的氫信號(hào)及碳信號(hào)表明［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］+在與NOBF4的反應(yīng)中失去了一個(gè)bpy 分子從而空出兩個(gè)配位點(diǎn)，分別與NO+及溶劑分子CH3CN配位并最終形成六配位的配合物1.質(zhì)譜［圖3（b）插圖］中出現(xiàn)在696.38 的分子離子峰與［M-PF6-］+理論值696.01 接近，進(jìn)一步確認(rèn)該亞硝酰配合物的生成過程中失去了一個(gè)bpy 分子.值得一提的是，質(zhì)譜中也觀察到666.28 處的分子離子碎片峰，與失去一個(gè)NO 分子的分子離子碎片［M-PF6--NO］+（理論值666.02）一致.以上表征結(jié)果確認(rèn)了配合物1的結(jié)構(gòu).

圖3 配合物1的NMR譜和質(zhì)譜Fig.3 NMR and MS spectra of complex 1

此外，與［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6相比，圖4 FT-IR 譜圖中觀察到配合物1 在1911 cm-1處出現(xiàn)了一個(gè)中等強(qiáng)吸收峰，這歸屬于NO+中N—O特征伸縮振動(dòng)［15-17，21-22］，表明該配合物中存在RuⅡ-NO+特征結(jié)構(gòu).圖4 插圖為配合物1 的循環(huán)伏安圖，相關(guān)數(shù)據(jù)整理在表1 中（這里配合物1 所有的電位都相對(duì)于二茂鐵Fc+/0進(jìn)行修正，即圖示電位數(shù)據(jù)加36 mV）.如圖4 所示，歸屬于配合物1 的Ru（Ⅱ）→Ru（Ⅲ）氧化峰位出現(xiàn)在-0.015 VvsFc+/Fc0.與［Ru（bpy）（4-OCH3ppy）（CH3CN）NO］2+和［Ru（bpy）（ppy）（CH3CN）NO］2+分別位于-0.154 V 和-0.164 VvsFc+/Fc0的氧化峰位相比［17］，可知苯環(huán)上取代基的吸電子特性明顯增加了Ru（Ⅱ）的穩(wěn)定性，使得配合物1 的Ru（Ⅱ）/（Ⅲ）氧化電位更高［11］.值得注意的是，在-0.51～-0.91 VvsFc+/Fc0范圍內(nèi)，配合物1 經(jīng)歷了RuⅡNO+→RuⅡNO·和RuⅡNO·→RuⅡNO-的兩步連續(xù)還原過程［8，23］，進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)構(gòu)中RuⅡ-NO+的存在.此外，正電位區(qū)0.2 V 以上的氧化峰可歸因于碳陰離子配體的氧化，而發(fā)生在更負(fù)的電位上的還原峰則歸屬于聯(lián)吡啶配體的還原.

表1 三個(gè)環(huán)金屬釕亞硝酰配合物性質(zhì)比較Tab.1 Comparison of properties of the three cyclometalated ruthenium nitrosyl complexes.

圖4 配合物1和［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6的FT-IR紅外光譜Fig.4 FT-IR spectra of complex 1 and ［Ru（bpy）2（4-CF3ppy）］PF6

2.2 理論計(jì)算

圖5 列出了配合物1 的HOMO 及LUMO 軌道分布.由圖5 可見：其HOMO 軌道電子云主要分布在C^N 配體上；LUMO 軌道電子云則主要分布在Ru 原子和NO 上，這也說明Ru（Ⅱ）的d軌道與NO 分子的π*分子軌道之間有很強(qiáng)的相互作用.表1 給出了配合物1、［Ru（bpy）（ppy）（CH3CN）NO］2+和［Ru（bpy）（4-OCH3ppy）（CH3CN）NO］2+中Ru（Ⅱ）與NO 分子間 的Ru-NO 結(jié)合能，分別為-69.30、-98.28［17］和-101.17 kcal·mol-1［17］.這里，吸電子基團(tuán)—CF3的引入，使Ru—NO 結(jié)合能數(shù)值明顯降低，RuⅡ—NO+更容易發(fā)生斷裂.因此，可以推斷含吸電子基團(tuán)的釕亞硝酰配合物作為NO供體，其NO釋放更容易.

圖5 配合物1的HOMO和LUMO軌道Fig.5 HOMO and LUMO orbitals of complex 1

2.3 吸收光譜及光敏NO釋放

研究了配合物1的乙腈溶液在黑暗和光照下的吸收光譜（見圖6）.黑暗條件下，配合物在可見光區(qū)幾乎沒有吸收，在314 nm 附近的譜帶歸屬于dπ（Ru）→π*（bpy）躍遷，在252 nm 和297 nm 附近的吸收帶歸于2-苯基吡啶和2，2′-二聯(lián)吡啶的π→π*躍遷.光照后，230～300 nm 間的吸收峰強(qiáng)度隨光照時(shí)間增加而增強(qiáng)（光照強(qiáng)度為850 mW·cm-2），該吸收譜帶歸屬于聯(lián)吡啶及C，N-配體到NO+的LLCT躍遷吸收.314 nm 附近的吸收峰強(qiáng)度下降的同時(shí)，430 nm 處出現(xiàn)新峰且峰強(qiáng)度隨著光照時(shí)間的增加而增加，這可歸屬于dπ（Ru）→π*（NO）的MLCT 躍遷［23-24］.以上吸收光譜的變化說明在光照條件下，配合物可能存在分子內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移過程，光敏NO 釋放是可能的，其光敏釋放NO 的過程可用下式描述［8，17，24］：

圖6 配合物1的乙腈溶液（20 μmol·L-1）在氙燈照射下隨時(shí)間變化的吸收光譜Fig.6 Time-dependent UV-vis absorption spectra of complex 1（20 μmol·L-1）in CH3CN under xenon lamp irradiation

（L）RuⅡ-NO++hv+solv→［（L）RuⅢ-（solv）+NO·］→RuⅡ-（solv）+NO·.

EPR 表征進(jìn)一步證實(shí)了配合物1 可光敏釋放NO.如圖7 所示：在DMSO 中混合等摩爾量的配合物1 和NO 自由基捕獲劑c-PTIO（二者濃度均為50 μmol·L-1），在黑暗條件下，EPR 中顯示了c-PTIO典型的五重峰信號(hào).氙燈照射1 h 后（光照強(qiáng)度為850 mW·cm-2），c-PTIO 的特征五重峰衰減并轉(zhuǎn)變?yōu)閷儆趤啺被趸颿-PTI 的特征七重峰.這可歸因于配合物1在光照下產(chǎn)生了NO自由基，與c-PTIO發(fā)生特征還原反應(yīng)，將c-PTIO還原為c-PTI［8，25-26］.

圖7 配合物1的EPR光譜Fig.7 EPR spectra of complex 1

基于配合物1在光照下的吸收光譜以及EPR 譜的變化，隨后利用Griess 試劑測定了配合物1 和［Ru（bpy）（ppy）（CH3CN）NO］2+、［Ru（bpy）（4-OCH3ppy）（CH3CN）NO］2+的光敏NO 釋放量.如表1 所示，隨著光照時(shí)間的增加，所有配合物的光敏NO 釋放量均增加.其中，配合物1 的光敏NO 釋放量增加尤其顯著.光照10 min 時(shí)，配合物1 釋放的NO 量為4.23 μmol·L-1；光照60 min 時(shí)，釋放NO 量則達(dá)到18.48 μmol·L-1.顯然，同等條件下，配合物1 的光敏NO 釋放量遠(yuǎn)大于其它兩個(gè)配合物（見表1），這可從Ru-N（NO）的結(jié)合能理論計(jì)算值得到合理解釋.

3 結(jié)語

合成了新的釕亞硝酰配合物［Ru（bpy）（4-CF3ppy）（CH3CN）NO］（PF6）2（配合物1），NMR 及MS確認(rèn)其結(jié)構(gòu)，并通過IR、CV 譜圖信息證實(shí)了結(jié)構(gòu)中存在RuⅡ-NO+.光照下的吸收光譜以及EPR 變化表明：該配合物可光敏釋放NO，其釋放量通過Griess試劑測定得到.通過比較同條件下配合物1、［Ru（bpy）（ppy）（CH3CN）NO］2+和［Ru（bpy）（4-OCH3ppy）（CH3CN）NO］2+的光敏NO 釋放量以及它們的Ru-NO結(jié)合能理論計(jì)算值發(fā)現(xiàn)，吸電子基團(tuán)的引入更有利于NO 的光敏釋放.這一結(jié)果為后續(xù)設(shè)計(jì)具有優(yōu)良光敏NO 釋放能力的釕亞硝酰配合物提供了數(shù)據(jù)支持.