超聲凍融-復(fù)合酶解制備小麥多孔淀粉及其吸附特性

李彩妮，安鳳平，2，石 娟，孫帥豪，宋洪波，2

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2.福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點實驗室，福州 350002）

0 引言

多孔淀粉是一種新型的改性淀粉［1］，具有較高的吸附性能和良好的釋放性能，在食品、藥品等領(lǐng)域有著應(yīng)用潛力［2］。復(fù)合酶（α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶）是制備多孔淀粉的常用方法，該法制得的多孔淀粉比表面積和孔隙率較大［3］。有研究表明，超聲的空化作用導(dǎo)致淀粉內(nèi)部產(chǎn)生孔隙［4］，酶解前對淀粉進行超聲預(yù)處理，增加了淀粉微孔的數(shù)量和比例［5］。經(jīng)過微波超聲波輔助復(fù)合酶解得到的木薯多孔淀粉，其吸附性能較單純酶解制得多孔淀粉更好［6］。凍融可使淀粉顆粒產(chǎn)生小孔從而增加淀粉對酶水解的敏感性，因此凍融技術(shù)結(jié)合酶解有利于制備吸附性能更好的多孔淀粉［7］。

小麥是我國的主要農(nóng)作物之一［8］。國內(nèi)外對小麥多孔淀粉的研究較少，且制備方法較單一，制備的多孔淀粉吸附性能較差［9］。因此，本文以小麥淀粉為原料，對比研究超聲凍融、復(fù)合酶處理以及超聲凍融-復(fù)合酶解淀粉的理化性質(zhì)和吸附性能，為超聲凍融-復(fù)合酶解制備小麥多孔淀粉的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥淀粉、α-淀粉酶（2×104U/mL）、糖化酶（105U/mL），上海源葉生物有限公司；花生油，食品級，青島嘉里花生油有限公司；亞甲基藍（分析純）、色譜級溴化鉀，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；直鏈淀粉含量檢測試劑盒（BC4260-50T/48S），索萊寶試劑公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

KQ2200DV 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16 型高速離心機（四川蜀克儀器有限公司）；UV-1700 型紫外可見分光光度計［島津儀器（蘇州）有限公司］；Nova Nano SEM230 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（捷克FEI CZECH REPUBLICS.R.O 公司）；VERTEX70 型傅里葉變換紅外光譜儀［布魯克（北京）科技有限公司］；Ultima IV 型X-射線衍射儀（日本Rigaku公司）；asap2460 型比表面積及孔隙度分析儀（美國麥克公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲凍融小麥淀粉的制備

參考KEERATIBURANA 等［10］的方法并稍作修改。將小麥淀粉（NS）與蒸餾水按質(zhì)量比1：2混合攪拌3 h，-25 ℃冷凍6 h；以頻率為40 kHz、功率為500 W 于室溫超聲處理1 h；干燥后粉碎并過100 目篩得到超聲凍融淀粉（US-IR）。

1.3.2 小麥多孔淀粉的制備

參考ZHAO 等［11］的方法并在預(yù)試驗基礎(chǔ)上有所改動。分別將NS，US-IR 與乙酸緩沖溶液（0.5 mol/L，pH=4.6）按料液比1：3 混合均勻形成淀粉乳，55 ℃恒溫水浴15 min；加入復(fù)合物酶溶液（α-淀粉酶和糖化酶比為1：4，U：U），55 ℃恒溫水浴振蕩24 h；加入NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至11 結(jié)束水解反應(yīng)；加入2 倍無水乙醇使酶失活，用無水乙醇和蒸餾水反復(fù)洗滌3 次，抽濾后55 ℃烘干12 h；粉碎并過100 目篩，分別得到復(fù)合酶解多孔淀粉（ES）和超聲凍融-復(fù)合酶解多孔淀粉（CS）。

1.3.3 顆粒形態(tài)分析

取適量樣品均勻灑在導(dǎo)電膠表面，用洗耳球吹去多余淀粉并在真空條件下噴金，采用掃描電鏡以6 kV 加速電壓觀察樣品形貌。

1.3.4 低溫氮吸附測定

稱取200 mg 樣品，置于比表面積及孔隙度分析儀中于45 ℃脫氣24 h，在77.35 K 的液氮溫度下測定淀粉樣品的氮氣吸附-脫附等溫線。采用儀器自帶分析軟件，分別以BET（Brunauer-Emmett-Teller） 和BJH（Barrett-Joyner-Halenda）法計算淀粉樣品的比表面積和總孔體積。

1.3.5 直鏈淀粉含量測定

采用試劑盒測定直鏈淀粉含量，操作步驟和計算公式參照試劑盒說明書。

1.3.6 X 射線衍射分析

采用X 射線衍射儀測定樣品的晶體結(jié)構(gòu)。測定條件：40 mA，40 kV，Cu-Kα 射線，掃描速率為2（°）/min，衍射角（2 θ）范圍為5～35°。使用MDI Jade 6.0 軟件計算淀粉的相對結(jié)晶度［12］。

1.3.7 傅里葉紅外光譜分析

參考蔡文琪等［13］的方法并稍作修改。將樣品和溴化鉀研磨10 min，放入壓模中，抽真空壓片。儀器測定參數(shù)：掃描波數(shù)范圍在400～4 000 cm-1，分辨率為0.8 cm-1，掃描次數(shù)為32 次。

1.3.8 溶解度和膨脹力測定

參考趙安琪［14］的方法并稍作修改。將干燥的離心管和培養(yǎng)皿稱重，分別記為A1（g）和B1（g）；將0.4 g 樣品和20 mL 蒸餾水于離心管中混合均勻，80 ℃恒溫水浴振蕩30 min，5 500 r/min離心作用15 min；取上清液倒入培養(yǎng)皿中，稱得離心管與沉淀物的質(zhì)量為A2（g），將裝有上清液的培養(yǎng)皿105 ℃干燥至恒重，記為B2（g）。淀粉樣品的溶解度（SOL）和膨脹力（SP）分別按下式計算：

1.3.9 吸附性測定

（1）亞甲基藍吸附量的測定

取0.5 g 淀粉樣品和30 mL 亞甲基藍溶液（0.5 g/L）混合，25 ℃水浴振蕩器吸附2 h，倒入離心管中，以5 500 r/min 離心作用10 min，計算上層亞甲基藍溶液的體積；取1 mL 稀釋100 倍后的溶液于紫外可見分光光度計665 nm 波長處測定吸光值，根據(jù)預(yù)先繪制的亞甲基藍標準曲線計算游離亞甲基藍濃度。亞甲基藍吸附量（Qe）按下式計算：

式中 C0，C1—— 亞甲基藍初濃度和游離亞甲基藍濃度，mg/L；

V0，V1—— 加入的甲基藍體積和上層亞甲基藍溶液的體積，L；

m——淀粉質(zhì)量，g。

（2）吸油率和吸水率的測定

將0.5 g 樣品和5 mL 蒸餾水或花生油于已知質(zhì)量W0（g）的離心管中渦旋5 min，室溫靜置30 min；以5 500 r/min 離心作用10 min，除去淀粉表面水（或油）后得到沉淀物，稱重記為W1（g）。則淀粉樣品的吸油率/吸水率（AC）計算如下：

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗重復(fù)3 次，采用Microsoft Excel 2003 和DPS 18.10 對數(shù)據(jù)進行處理和方差分析，結(jié)果以平均值±標準偏差表示；采用Duncan 法進行檢驗，p＜0.05 為顯著水平；使用Origin 2018 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 顆粒形態(tài)分析

如圖1 所示，圖A 表明NS為球狀或橢狀的顆粒，表面較光滑。圖B 所示的US-IR 表面出現(xiàn)侵蝕和凹陷，說明經(jīng)超聲凍融處理的淀粉表面受到一定程度破壞，但顆粒完整性未被破壞，這是由于淀粉顆粒中的水分經(jīng)冷凍形成冰晶過程中產(chǎn)生的膨脹作用，以及超聲波強烈的振蕩和空穴效應(yīng)等對淀粉顆粒表面產(chǎn)生了一定侵蝕作用［15］。圖C 所示的ES 表面侵蝕明顯，沿赤道方向形成孔洞并產(chǎn)生一些破碎淀粉，此結(jié)果與YAIZA 等［16］采用糖化酶處理小麥淀粉的現(xiàn)象相似。圖D 顯示CS 呈現(xiàn)出空心狀結(jié)構(gòu)，表面分布著明顯的孔，說明超聲凍融處理造成淀粉表面被侵蝕，成為復(fù)合酶水解的薄弱點，促進復(fù)合酶水解，因此形成了多孔淀粉。

圖1 不同淀粉的掃描電子顯微鏡圖（×2 000 和×10 000）Fig.1 Scanning electron micrographs of different starch samples（×2 000 and ×10 000）

2.2 低溫氮吸附分析

不同淀粉樣品的氮氣吸附-脫附等溫線如圖2 所示。

圖2 不同淀粉樣品的氮氣吸附-脫附等溫線Fig.2 Nitrogen adsorption-desorption isotherms of different starch samples

根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）分類方法可知，4 個樣品的氮氣吸附等溫線為Ⅱ型，吸附和脫附等溫線均不重合，滯后環(huán)為H3型，這是多層吸附的介孔材料的典型特征［17］。US-IR 的吸附等溫線在NS 上方，說明超聲凍融提高淀粉對氮氣的吸附量。與NS 和US-IR 相比，ES 和CS 在相對壓力接近1 時急劇升高，是因為發(fā)生毛細凝聚現(xiàn)象［18］。

各樣品的比表面積及總孔體積如圖3 所示。NS，US-IR，ES 和CS 的比表面積和總孔體積均依次顯著增大（p＜0.05）。特別是CS 的比表面積和總孔體積值均最大，這是因為超聲凍融處理使淀粉表面積增大，增加復(fù)合酶與淀粉的接觸面積，促進復(fù)合酶對淀粉的水解。這與圖1 所示的各樣品的外觀形貌特征具有一致性。

圖3 不同淀粉樣品的比表面積和總孔體積Fig.3 Specific surface area and total pore volume of different starch samples

2.3 直鏈淀粉含量和X 射線衍射分析

淀粉樣品的X 射線衍射圖譜見圖4。

圖4 不同淀粉樣品的X 射線衍射圖Fig.4 XRD of different starch samples

NS 在15，17，18，23°（2 θ）處出現(xiàn)尖峰衍射特征峰，這是A 型晶型的典型特征，與ZHANG 等和CHI 等的報道一致［19-20］。4 種淀粉呈現(xiàn)相似的X 射線衍射圖譜，說明超聲凍融、復(fù)合酶解和超聲凍融-復(fù)合酶解均未改變小麥淀粉的晶型。與NS 和US-IR 相比，ES 和CS 在大約20°（2 θ）處的衍射峰更尖銳，是因為復(fù)合酶解增加了直鏈淀粉的相對含量，從而促進直鏈淀粉與脂質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成直鏈淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物所致［21-22］。

淀粉樣品的直鏈淀粉含量以及相對結(jié)晶度如表1 所示。與NS 的直鏈淀粉含量為23.25%相比，US-IR 的含量顯著降低（p＜0.05），一方面可能是由于超聲波對淀粉的無定形區(qū)部分降解；另一方面是冷凍過程中冰晶生長導(dǎo)致直鏈淀粉從無定形區(qū)部分滲出造成。相反，ES 中的直鏈淀粉含量明顯增加（p＜0.05），可能是由于支鏈淀粉的非還原性末端更多，有助于酶水解成更多的直鏈淀粉。CS 的直鏈淀粉含量為21.73%，明顯低于ES（p＜0.05），可能是超聲凍融促進復(fù)合酶對淀粉無定形區(qū)的水解，并在洗脫過程中除去了部分直鏈淀粉。

表1 不同淀粉樣品的直鏈淀粉含量和相對結(jié)晶度Tab.1 Amylose content and relative crystallinity of different starch samples %

US-IR 較NS 的相對結(jié)晶度顯著降低（p＜0.05），可能是因為冷凍過程中冰晶生長的膨脹作用以及超聲波的振蕩作用，一定程度破壞了淀粉顆粒結(jié)晶結(jié)構(gòu)的有序性。ES 的相對結(jié)晶度進一步顯著降低，是因為酶解先作用于淀粉顆粒的無定形區(qū)，再作用于亞結(jié)晶區(qū)和結(jié)晶區(qū)。NS 的支鏈淀粉與直鏈淀粉相比，具有更多的非還原性末端［23］。CS 的相對結(jié)晶度高于ES，是因為超聲凍融增加了酶對淀粉無定形區(qū)域的可及性，復(fù)合酶優(yōu)先在US-IR 的無定形區(qū)域進行水解。

2.4 傅里葉紅外光譜分析

淀粉短程有序又被稱為雙螺旋有序，與淀粉的相對結(jié)晶度相關(guān)［24］。1 047 cm-1處的吸光度是淀粉結(jié)晶區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，1 022 cm-1處的吸光度與無定形區(qū)有關(guān)。一般來說，淀粉的紅外光譜圖在1 047 cm-1和1 022 cm-1處吸光度的比值，一定程度上表示淀粉的相對結(jié)晶度［25］。995 cm-1處的吸收峰與C-6 處羥基的氫鍵有關(guān)［26］，1 022/955 cm-1的比值與晶體內(nèi)部雙螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)［27］，該比值越小，淀粉的雙螺旋分子越有序。

根據(jù)4 個樣品的紅外光譜圖，可得1 047/1 022 cm-1和1 022/995 cm-1比值，列于表2 中。其中，NS，US-IR，CS 的1 047/1 022 cm-1比值分別為0.88，0.87，0.86，說明淀粉經(jīng)過超聲凍融或復(fù)合酶解后，雙螺旋有序結(jié)構(gòu)遭到破壞，相對結(jié)晶度降低。CS 的1 047/1 022 cm-1比值顯著大于ES（p＜0.05），是因為經(jīng)超聲凍融處理后，復(fù)合酶可以進一步水解淀粉的無定形區(qū)域，從而導(dǎo)致結(jié)晶區(qū)與無定形區(qū)的比值增大，這與X 衍射結(jié)果的變化趨勢一致。NS，US-IR，ES，CS 的1 022/995 cm-1比值依次增加（p＜0.05），說明超聲凍融和復(fù)合酶解均降低淀粉雙螺旋結(jié)構(gòu)分子的有序性，其中超聲凍融結(jié)合復(fù)合酶水解的作用最明顯。

表2 不同淀粉樣品的紅外特征比值Tab.2 Infrared characteristic ratios of different starch samples

2.5 溶解度和膨脹力分析

從表3 可以看出，US-IR 的溶解度和膨脹力較NS 顯著增大（p＜0.05），是因為淀粉經(jīng)超聲凍融處理，分子有序結(jié)構(gòu)被破壞和游離羥基的短鏈含量增加所導(dǎo)致［28］。SUJKA 等［29］認為，淀粉晶體結(jié)構(gòu)的破壞、水分子與直鏈淀粉或支鏈淀粉的游離羥基結(jié)合均可造成淀粉的溶脹性增加。NS和US-IR 經(jīng)復(fù)合酶水解后，所制備ES 和CS 的溶解度和膨脹力均顯著增加（p＜0.05），特別是CS的溶解度和膨脹力顯著大于ES，是因為超聲凍融增加了酶對淀粉無定形區(qū)域的可及性，有助于水分子進入淀粉的無定形區(qū)。此外，CS 的比表面積和總孔體積大于ES，因此CS 具有更好的溶脹性。

表3 不同淀粉樣品的溶解度和膨脹力Tab.3 Solubility and swelling power of different starch samples

2.6 吸附性

不同淀粉的亞甲基藍吸附量、吸油率和吸水率如圖5 所示。與NS 相比，US-IR 的亞甲基藍吸附量和吸水率顯著增大（p＜0.05），是由于超聲波處理對淀粉表層侵蝕，且使淀粉顆粒結(jié)構(gòu)變得松散，暴露更多的親水基團［30］。然而，US-IR 的吸油率反而顯著降低（p＜0.05），是因為超聲凍融處理減少淀粉中直鏈淀粉的含量所致。王玫玫［28］認為，直鏈淀粉分子與極性脂肪物質(zhì)可以形成螺旋結(jié)構(gòu)，直鏈淀粉的減少降低淀粉對油的結(jié)合能力。ES 和CS 的亞甲基藍吸附量、吸油率和吸水率較NS 和US-IR 有明顯的提高（p＜0.05），特別是CS 達到最大值，這得益于超聲凍融處理結(jié)合復(fù)合酶水解形成豐富的孔，提高溶脹能力，以及降低雙螺旋結(jié)構(gòu)的有序性。

圖5 不同淀粉樣品的吸附性Fig.5 Adsorption capacities of different starch samples

3 結(jié)語

對比研究超聲凍融、復(fù)合酶（α-淀粉酶和糖化酶）處理以及超聲凍融-復(fù)合酶水解小麥淀粉的理化性質(zhì)和吸附性能。小麥淀粉為A 型淀粉，超聲凍融、復(fù)合酶解和超聲凍融-復(fù)合酶解均未改變小麥淀粉的晶型；經(jīng)超聲凍融處理，淀粉表面被侵蝕且分子有序性降低，復(fù)合酶水解則可形成少量孔洞的多孔淀粉，因此超聲凍融結(jié)合復(fù)合酶水解制得的多孔淀粉的比表面積和總孔體積最大，淀粉的相對結(jié)晶度較低、雙螺旋分子結(jié)構(gòu)的有序性最低，使得溶脹性和吸附性顯著增大。