橘皮精油/殼聚糖復(fù)合涂膜的制備及其對鮮切蘋果保鮮性能的研究

閆文婧，張安怡，譚樹良，何 其，何志妮

（南方醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，廣州 510515）

0 引言

功能性生物高分子聚合物作為石油化工塑料的替代材料［1］，引起越來越多的關(guān)注。在不同的生物聚合物中，殼聚糖（CH）是甲殼素脫乙酰基后得到的一種無毒、生物可降解的多糖，具有成膜性和抗菌性，被廣泛應(yīng)用于食品保鮮涂層［2］。然而，由于分子間的強氫鍵作用，高分子質(zhì)量的CH不溶于水，在一定程度上限制其廣泛應(yīng)用。同時，大量研究需要涂層擁有更顯著的抗菌和抗氧化性能，就要求對CH 進行改性，提高其溶解度，同時改善其綜合性能。

殼聚糖具有陽離子特性［3］。一些易產(chǎn)生陰離子的酸性成分，可以作為CH 的添加物，改善其性能。一些具有弱酸性、抗菌和抗氧化活性的植物提取物，被廣泛應(yīng)用于CH 復(fù)合材料的開發(fā)中，顯示出廣闊的應(yīng)用前景［4］。

橘皮精油（TPEOs）是柑橘類水果的重要提取物，主要成分是檸檬烯，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抑菌和抗氧化等多種生理功能［5］，受到廣泛關(guān)注［6］。

本文分別從3種不同種類的柑橘：椪柑（Citrus reticulata，CR）、苦橙（Citrus bigarradia，CB）和甜橙（Citrus sinensis，CS）中提取精油，作為CH 材料的功能性添加物，用于鮮切蘋果的保鮮。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

柑橘［CR，CB 和CS，重量（146±27）g］和蘋果［重量（239±33）g］購自當?shù)厥袌?，果實色澤飽滿，無明顯缺陷和腐爛；殼聚糖（脫乙酰度為75%～85%，CAS 9012-76-4），美國生命科學(xué)與高科技集團公司；所有其他試劑，中國生工生物技術(shù)有限公司。所有化學(xué)品都是分析級。

1.2 主要儀器設(shè)備

Clevenger 型蒸餾儀（北京科思佳有限公司）；6890-5975 型GC-MS 聯(lián)用儀（美國安捷倫科技公司）；Vector 33 型傅里葉紅外分析儀（德國布魯克公司）；Nova Nano 3700 型掃描電子顯微鏡（美國FEI 公司）；CR-300 型色度計（美國柯尼卡美能達公司）；293-230-30 型手持式數(shù)字千分尺（日本三豐公司）；UV-1800 型分光光度計（日本島津公司）；Brookfield-CT3 型質(zhì)構(gòu)分析儀（美國布魯克菲爾德公司）。

1.3 方法

1.3.1 TPEOs 提取和成分分析

柑橘橘皮在50 ℃的對流爐中干燥48 h，切碎，用蒸餾儀進行水蒸氣提取6 h，收集TPEOs。在硫酸氫鈉上干燥24 h，過濾，并于4 ℃儲存在棕色密封玻璃瓶中，直到測試。

采用QI 等［7］的方法，用聯(lián)用儀對TPEOs 的主要成分進行定量分析，系統(tǒng)采用HP-5 MS 熔融石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm 膜厚）。TPEOs 的主要成分使用Kovats 指數(shù)進行鑒定。

1.3.2 CH-TPEOs 薄膜的制備和微觀結(jié)構(gòu)分析

參考NOSHIRVANI 等［8］的研究，取1 g CH完全溶解在100 mL 體積分數(shù)為1%的乙酸水溶液中，在60 ℃攪拌4 h。將混合溶液分成4 組，其中3 組分別加入3 種不同的TPEOs，在60 ℃攪拌3 h；隨后超聲波處理（200 W，40 kHz）30 min。將得到的溶液涂布在無機玻璃板上（36 cm×24 cm），在60 ℃干燥12 h，制備薄膜，4 種制得的薄膜分別記為CH-O，CH-CR，CH-CB 和CH-CS。

用液氮對所制備的薄膜進行低溫斷裂處理并噴金。使用掃描電子顯微鏡觀察薄膜的表面和截面微觀結(jié)構(gòu)。

使用色度計測定薄膜的顏色參數(shù)。結(jié)果以L*（亮度）、a*（紅、綠）和b*（黃、藍）表示。

1.3.3 薄膜的抗氧化和抗菌活性

使用HE 等［9］的方法，通過2，2-二苯基-1-吡啶肼（DPPH）和2，2-疊氮基（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）酸自由基（ABTS+）的清除能力測定CH-TPEOs 的抗氧化活性。將DPPH（0.1 mmol/L）溶解在甲醇中制備DPPH 溶液。將等體積的ABTS（2 mmol/L）和高硫酸鉀（2.45 mmol/L）混合制備ABTS+溶液。將0.2 g CH-TPEOs 均質(zhì)于3.0 mL 甲醇中，離心作用取上清液，根據(jù)其在分光光度計517，734 nm 處吸光度計算抗氧化性。

使用金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌，測定CH-TPEOs 膜的體外抗菌活性。制備每種測試微生物懸浮液（～100 CFU/mL），并在MH 固體培養(yǎng)基板上擴散。將CH-TPEOs 膜的圓盤（6 mm）放置在接種板上，在37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.4 CH-TPEOs 涂層在鮮切蘋果表面的形成

蘋果去皮、去核，切成邊長約2 cm 的方塊，浸泡在200 mg/kg 的次氯酸鈉溶液中消毒2 min，后用蒸餾水清洗氯殘留。蘋果樣本分成5 組，其中，對照組在儲藏前不作涂膜處理。CH-O，CH-CR，CH-CB 和CH-CS 組分別用相應(yīng)的CH 材料涂膜（約60 μm 厚度）。所有處理后的蘋果在（1±0.3）℃儲存16 d，每隔4 d 取樣評估蘋果的貯藏品質(zhì)。

1.3.5 貯藏蘋果的感官特性

蘋果的感官評價由實驗室10 名訓(xùn)練有素的工作人員（5 女5 男，年齡20～50 歲）完成。樣品隨機抽取，用5 分制（0 分代表拒絕，5 分代表非常新鮮）對蘋果的顏色、氣味、質(zhì)地、味道和一般可接受度進行評分。

蘋果的硬度由配備有6 mm 圓柱形探針和Brookfield 分析軟件的質(zhì)構(gòu)分析儀測試。采用5 mm/s 的測試速度，5 g 的觸發(fā)載荷和2 次5 mm的壓縮，間隔時間為5 s。

蘋果的表面顏色根據(jù)上文中描述的方法進行測量。

1.3.6 貯藏蘋果的微生物分析

在整個儲藏過程中，蘋果的菌落總數(shù)（TBC）和厭氧菌落總數(shù)（TAC）采用HE 等［10］的方法進行測定。樣本提取物分別在含有10 g/L 氯化鈉的鐵瓊脂平板和平板計數(shù)瓊脂板上15 ℃培養(yǎng)3 d后，測定TBC 和TAC。

1.3.7 鮮切蘋果在儲藏期間的化學(xué)分析

根據(jù)ZHANG 等［11］的方法，對貯藏蘋果中的花青素含量進行測定。樣品用乙醇和質(zhì)量分數(shù)為15%的鹽酸進行提取。用分光光度計在535 nm處測量的吸光度計算結(jié)果。

用IBRAHIM 等［12］的方法，測定貯藏蘋果中的葉綠素α，β和類胡蘿卜素的含量。樣品用丙酮處理。葉綠素α，β和類胡蘿卜素的含量分別用分光光度計上440，644，662 nm 的吸光度值計算。

1.4 統(tǒng)計分析

每個試驗使用不同的樣本至少重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)以平均值±標準差（SD）表示。采用SPSS 17.0進行多重比較，采用Duncan 檢驗和單因素方差分析（ANOVA）。如果p＜0.05，則認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果和討論

2.1 TPEOs 中的成分分析

水蒸餾后得到3 種TPEOs，分別標識為CR-T，CB-T，CS-T。如表1 所示，精油中主要鑒定成分分別占總成分的92.02%，96.82%，95.02%，其中檸檬烯和γ-松油烯占總成分80%以上。

表1 TPEOs 中的主要效應(yīng)組成Tab.1 Composition of main effects in the TPEOs

2.2 制備薄膜的微觀結(jié)構(gòu)分析

CH-O，CH-CR，CH-CB，CH-CS 的膜厚分別為（69±8），（71±5），（67±3），（70±7）μm，說明精油的添加沒有顯著影響薄膜的厚度［26］。同時，如圖1 所示，不同膜之間沒有顯著的外觀差異。

圖1 CH-O，CH-CR，CH-CB，CH-CS 膜表面輪廓的SEM 圖Fig.1 SEM images of the surface contours of CH-O，CH-CR，CH-CB and CH-CS films

2.3 制備膜的抗氧化和抗菌活性

DPPH 和ABTS+都是評估樣品抗氧化活性的常用方法［27］，雖然基于相同原理，但結(jié)果通常有差異，其原因可歸因于側(cè)鏈中雙鍵通過共振穩(wěn)定了DPPH 自由基的立體結(jié)構(gòu)。

表2 揭示不同CH 膜的抗氧化活性。含有CS 精油的CH 膜具有更高的抗氧化性。這可能是由于CS 精油中萜類和烯類化合物含有雙鍵，可通過加成-OH 形成二級基團，由此清除體系中的大部分-OH，從而達到抗氧化的目的。

表2 CH-O，CH-CR，CH-CB，CH-CS 膜的抗氧化和抗菌活性Tab.2 Antioxidant activity and antibacterial activity of CH-O，CH-CR，CH-CB and CH-CS films

TPEOs 的另一個值得注意的活性是抗菌能力。表2 同時顯示對不同微生物種類的抑菌能力。在薄膜中加入TPEOs 后，其抗菌能力顯著增加（p＜0.05），CH-CR 膜對不同微生物均具有最強的抗菌能力。這可能是由于CR-T 中的某些成分可以作用于微生物外膜上的蛋白質(zhì)顆粒，抑制其功能，特別是葡萄糖等小親水分子的被動轉(zhuǎn)運功能，從而實現(xiàn)抗菌的目的。

2.4 CH-TPEOs 涂層的鮮切蘋果的感官特性

感官特性可以簡單而有效地評估保鮮食品材料的總體新鮮度。在貯藏開始時，蘋果新鮮，顏色淺，組織牢固，氣味清新。儲藏過程中，蘋果逐漸腐敗，外觀變暗，質(zhì)地變軟，氣味變淡。如圖3所示，所有樣品的初始感官評分都接近5 分。經(jīng)過12 d的貯藏，對照組的各種感官評分降低至2 分左右，而CH-O 涂層樣品的數(shù)值保持在3 分左右。CHTPEOs 涂層樣品仍然在4 分左右，表明CH-TPEOs涂層可以明顯延緩蘋果樣品感官品質(zhì)下降。

圖3 CH-TPEOs 涂層保存的鮮切蘋果樣品的感官評價Fig.3 Sensory evaluation of fresh-cut apple samples preserved with CH-TPEOs coating

圖4 顯示蘋果樣品的硬度變化。在整個貯藏期間，對照樣品的硬度從15.5 g 下降到8.5 g，而涂有CH-TPEOs 的樣品仍然保持在13～14 g。氣候性水果收獲后軟化主要可歸因于細胞壁的酶水解［28］，CH-TPEOs 涂層提供了一個弱酸性環(huán)境，可能會降低酶水解的活性。

圖4 CH-TPEOs 涂層保存的鮮切蘋果樣品的硬度Fig.4 Hardness of fresh-cut apple samples preserved with CH-TPEOs coating

褐變是影響鮮切蘋果銷售的主要外部質(zhì)量問題［29］。在貯藏期間，對照組出現(xiàn)明顯的褐變，而涂膜組沒有觀察到明顯的變化。如圖5 所示，在整個貯藏過程中，所有樣品的a*和b*值都呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，而L*值的變化趨勢持續(xù)下降，這些變化在涂膜樣本中得到明顯抑制。

圖5 CH-TPEOs 涂層保存的鮮切蘋果樣品的表面顏色Fig.5 Surface color of fresh-cut apple samples preserved by CH-TPEOs coating

2.5 CH-TPEOs 涂層的鮮切蘋果的微生物特性和化學(xué)特性

圖6 顯示貯藏過程中蘋果的TBC 和TAC 持續(xù)增加的趨勢。

圖6 CH-TPEOs 涂層保存的鮮切蘋果樣品的微生物計數(shù)Fig.6 Microbial counts of fresh-cut apple samples preserved by CH-TPEOs coating

涂層減少了樣品中的微生物數(shù)量。最初各組樣品的TBC 和TAC 分別為2.9，2.1 log CFU/g。在整個貯藏過程中，對照組樣品的TBC 和TAC 分別增加到7.6，5.4 log CFU/g，而CH-O 樣品的相應(yīng)數(shù)值分別增加到6.2，4.3 log CFU/g。同時，CHTPEOs 涂層組的TBC 仍保持在4.2～4.5 log CFU/g，TAC 仍保持在2.9～3.3 log CFU/g。TPEOs 對CH涂膜抗菌性增強的機制可以用Lewis 酸堿理論來描述。TPEOs 包括萜類化合物和多分子烯烴，因此TPEOs 在水中的溶解可以產(chǎn)生大量的H+作為電子受體，可以導(dǎo)致CH 中的正電荷密度增加，增強聚陽離子對帶負電的菌體細胞膜的破壞，提高抗菌活性。

貯藏過程中，蘋果化學(xué)性質(zhì)的變化如圖7所示。

圖7 CH-TPEOs 涂層保存的鮮切蘋果樣品的化學(xué)性質(zhì)Fig.7 Chemical properties of fresh-cut apple samples preserved by CH-TPEOs coating

如圖7（a）所示，初始花青素為199 mg/kg。在貯藏過程中，所有樣品中的花青素呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，是由于細胞破裂后，細胞中的花青素釋放出來，然后逐漸分解。這一過程在一定程度上被TPEOs 所抑制。

如圖7（b）所示，所有樣品中的類胡蘿卜素初始含量為4.7 mg/g，在儲存期間含量呈下降趨勢。涂有CH-TPEOs 的蘋果與對照組相比，下降幅度明顯降低，是由于TPEOs 涂層可以抑制儲藏期間胡蘿卜素的分解。

圖7（c）（d）揭示了樣品中葉綠素α，β的上升趨勢。對照組的葉綠素α（1.6～4.0 mg/g）和葉綠素β（3.0～13.7 mg/g）最高，CH-O 樣品緊隨其后，其葉綠素α在儲藏期間增加到3.4 mg/g，葉綠素β增加到10.8 mg/g。CH-TPEOs 樣品的葉綠素含量最低，葉綠素α，β分別增加到2.7，7.9 mg/g。

3 結(jié)語

通過橘皮精油改善殼聚糖的性能，用于保鮮鮮切蘋果。結(jié)果顯示，TPEOs 的引入沒有使殼聚糖薄膜的微觀圖像發(fā)生明顯的變化，但明顯改變了膜的顏色參數(shù)，同時顯著提升了膜的抗氧化和抗菌活性。CH-TPEOs 作為保鮮涂層顯著抑制鮮切蘋果的感官劣變，降低鮮切蘋果樣品中的微生物數(shù)量，使TBC 從7.6 log CFU/g 降至4.2～4.5 log CFU/g，使TAC 從5.4 log CFU/g 降至2.9～3.3 log CFU/g，并抑制花青素、胡蘿卜素和葉綠素在貯藏過程中的變化。研究表明，CH-TPEOs 薄膜作為抗氧化劑和抗菌劑涂層在儲藏鮮切食品方面具有廣闊的發(fā)展?jié)摿?，為新型可食用包裝材料開發(fā)提供借鑒，有著良好的應(yīng)用前景。