響應(yīng)面耦合遺傳算法優(yōu)化超聲輔助酶法提取紅棗多酚工藝

李哲斌

（商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品工程學(xué)院，河南商丘 476100）

0 引言

紅棗是棗屬植物棗樹（Ziziphus jujuba Mill.）的成熟果實(shí)，已有4 000 多年的種植歷史。紅棗具有多種活性成分如多糖、多酚、膳食纖維和三萜酸等。紅棗多酚（Polyphenols from Jujube，PPJ）作為紅棗中主要的活性組分［1］，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎和保護(hù)心腦血管等功效［2］。因此，關(guān)于PPJ 的研究越來越受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。

利用高效環(huán)保的工藝提取活性成分是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。目前，紅棗中活性成分的提取分離主要依靠傳統(tǒng)工藝，如溶劑提取，該技術(shù)存在提取周期長、污染嚴(yán)重等諸多弊端［3］，很難滿足當(dāng)前紅棗加工行業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需求。超聲輔助技術(shù)是一種新型的綠色提取技術(shù)，基于超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)，能夠有效地促進(jìn)植物細(xì)胞壁的破壞，加速活性成分的擴(kuò)散，提升活性成分得率［4-5］。該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在植物多酚、黃酮和多糖等活性成分提取中得到廣泛的應(yīng)用［6-8］。細(xì)胞壁中絕大多數(shù)成分是纖維素和果膠，纖維素酶和果膠酶處理植物細(xì)胞壁，可以使植物細(xì)胞壁破裂降解，顯著加速細(xì)胞中的活性成分由內(nèi)向外擴(kuò)散，提高活性成分的提取效率。然而，超聲輔助酶法提取工藝在PPJ 提取領(lǐng)域未見報(bào)道。除提取技術(shù)外，PPJ 提取率還取決于許多其他因素（溶劑性質(zhì)、溫度、時(shí)間和超聲強(qiáng)度等）。因此，優(yōu)化PPJ 的提取工藝是提高PPJ 的提取效率，加速紅棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。響應(yīng)面法（Response Surface Method，RSM）是一種重要的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)工具，常被應(yīng)用于優(yōu)化活性物質(zhì)的提取工藝，但RSM 的缺陷在于對(duì)試驗(yàn)點(diǎn)的選擇有很高的要求。將RSM 與遺傳算法（Genetic Algorithm，GA）結(jié)合，即響應(yīng)面耦合遺傳算法（Response Surface Method Coupled Genetic Algorithm，RSMCGA），能在優(yōu)化提取工藝方面取得較好的預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)優(yōu)化效果。

因此，本文采用超聲輔助酶法提取技術(shù)對(duì)PPJ 進(jìn)行提取，探究超聲功率、提取溫度、乙醇濃度、果膠酶劑量和時(shí)間對(duì)PPJ 提取率的影響，并利用RSM 耦合GA 優(yōu)化PPJ 的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗產(chǎn)自新疆和田；沒食子酸購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、石油醚、碳酸鈉、福林酚試劑購于重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Scientz-T 型超聲波提取機(jī)（寧波新芝生物）；FD-1A-50 型真空冷凍干燥機(jī)（江蘇天翎儀器）；DF-8 型真空抽濾機(jī)（上海保玲儀器）；TGL-16.5M 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀）；DK-98-II 型電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器）；UV1800 型準(zhǔn)雙光束紫外/可見分光光度計(jì)（上海讓奇儀器）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

將新鮮的紅棗清凈后剔除棗核，切成均勻的小塊，放在60 ℃烘干機(jī)中干燥，以除去多余水分；然后將干燥的紅棗塊用粉碎機(jī)粉碎，過40 目篩，將獲得的紅棗粉末置于自封袋中密封，在4 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 超聲輔助酶法提取PPJ

準(zhǔn)確稱取5.0 g 紅棗粉末，添加到具塞燒瓶中，按照料液比1：30 g/mL 加入不同濃度的乙醇，與樣品充分混合；然后再按照不同劑量加入果膠酶，用超聲波提取儀處理混合體系并完成提取過程，于7 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心作用15 min。抽濾后獲得濾液，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中對(duì)濾液進(jìn)行濃縮，溫度控制在40 ℃，濃縮液凍干后得到PPJ 粉末。

1.3.3 PPJ 提取率測(cè)定

參考HUANG 等［9］的測(cè)定方法，計(jì)算不同提取條件下PPJ 的提取率。取1 mL 提取所得PPJ于25 mL 具塞試管中，分別加入2 mL 10%福林酚試劑和10 mL 10%碳酸鈉溶液，加入純水定容到25 mL，混合均勻；然后置于50 ℃水浴鍋中避光反應(yīng)1 h，以蒸餾水作對(duì)照，在波長為766 nm 處測(cè)定樣品吸光值，并通過下式計(jì)算PPJ 的提取率（β）：

式中 C——PPJ 濃度，g/mL；

V——PPJ 體積，mL；

m——干燥的紅棗固體粉末重量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

選擇超聲輔助酶法作為提取PPJ 的方法，在超聲功率、提取溫度、乙醇濃度、果膠酶劑量和提取時(shí)間5 個(gè)因素條件下開展單因素試驗(yàn)，討論各個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)樣品多酚提取率的影響。超聲功率分別為100，200，300*，400，500 W；提取溫度分別為30，35，40*，45，50 ℃；乙醇濃度分別為40%，50%，60%*，70%，80%；果膠酶劑量分別為0.10%，0.15%，0.20%*，0.25%，0.30%；提取時(shí)間分別為10，20，30*，40，50 min。其中“*”代表在研究其他試驗(yàn)因素對(duì)PPJ 提取率影響時(shí)，保持不變的試驗(yàn)因素。

1.3.5 響應(yīng)面法試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以超聲功率（α1）、提取溫度（α2）、乙醇濃度（α3）和果膠酶劑量（α4）為自變量，以β為響應(yīng)值。根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)并開展組合試驗(yàn)。

利用響應(yīng)面分析法得到二次回歸模型，如下式所示：

式中 b0，bi——分別為截距、線性回歸系數(shù)；

bii，bij——分別為二次項(xiàng)、交互項(xiàng)的回歸系數(shù)；

αi，αj——自變量。

1.3.6 遺傳算法設(shè)計(jì)遺傳算法依據(jù)達(dá)爾文進(jìn)化論演變而來，具有全局尋優(yōu)的功能，可以經(jīng)過無數(shù)次迭代逼近最優(yōu)結(jié)果，適用于優(yōu)化不同參數(shù)下獲得目標(biāo)成分的最大提取率［10］；可以避免試驗(yàn)因素水平選擇不當(dāng)，得不到理想的優(yōu)化結(jié)果。具體優(yōu)化參數(shù)程序：根據(jù)單因素試驗(yàn)所得的結(jié)果，設(shè)置α1，α2，α3，α4試驗(yàn)因素作為決策變量，即：

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選擇各試驗(yàn)因素水平的取值范圍，PPJ 提取率最佳的約束條件：200 W ≤α1≤400 W；30 ℃≤α2≤40 ℃；50%≤α3≤70%；0.15%≤α4≤0.25%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）來表示試驗(yàn)結(jié)果；采用SPSS8.0 軟件對(duì)每組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和試驗(yàn)結(jié)果的顯著性差異分析；利用Origin9.0 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)PPJ 提取率的影響

各因素對(duì)PPJ 提取率的影響見圖1。當(dāng)α1在100～300 W 時(shí)，隨著α1的增加，PPJ 提取率顯著提升（P＜0.05）。當(dāng)α1為300 W 時(shí)，PPJ 提取率達(dá)到最大值（0.66%±0.005%）。主要原因在于α1的增加會(huì)增強(qiáng)超聲空化效應(yīng)，PPJ 易由內(nèi)向外擴(kuò)散，能夠有效促進(jìn)PPJ 的提?。?1］。當(dāng)α1＞300 W 時(shí)，α1的增加會(huì)顯著降低PPJ 提取率（P＜0.05）。歸因在較大的α1條件下，PPJ 的化學(xué)結(jié)構(gòu)可能會(huì)被破壞，并且雜質(zhì)溶解較多，導(dǎo)致PPJ提取率下降［12］。這與曹艷華等［13］研究超聲提取洋蔥多酚結(jié)果類似。因此，后續(xù)試驗(yàn)在α1為200，300，400 W 下進(jìn)行。

圖1 不同試驗(yàn)因素對(duì)PPJ 提取率的影響Fig.1 Effect of different experimental factors on jujube polyphenol extraction rate

隨著α2的升高，PPJ 提取率先顯著增加后顯著降低（P＜0.05），當(dāng)α2為40 ℃時(shí)，PPJ 提取率達(dá)到最高值（0.69%±0.004%）。其原因是隨著α2的升高，一方面增加PPJ 在溶劑中的溶解度，降低傳質(zhì)阻力，促進(jìn)PPJ 的擴(kuò)散；另一方面有利于提高果膠酶催化活力，加速植物細(xì)胞壁的破壞，促進(jìn)多酚從細(xì)胞內(nèi)溶出，提高多酚提取率［14］。但當(dāng)α2過高時(shí)，可能降低果膠酶活性甚至使其完全失活，還可能破壞多酚結(jié)構(gòu)，從而降低PPJ 的提取率［15］。因此，后續(xù)試驗(yàn)在α2為30，35，40 ℃下進(jìn)行。

隨著α3的增加，PPJ 的提取率先顯著增加后顯著降低（P＜0.05），當(dāng)α3為60%時(shí)，PPJ 提取率取得最大值（0.68%±0.008%）。其原因是當(dāng)α3為60%時(shí)，PPJ 極性與乙醇極性相似，此時(shí)PPJ 溶解性最強(qiáng)，能夠達(dá)到最大的提取率［16］。當(dāng)α3超過60%，高濃度的乙醇會(huì)促使其他醇溶性雜質(zhì)或色素等被溶進(jìn)反應(yīng)體系。此外，α3越高，越容易破壞細(xì)胞膜的完整性，阻礙PPJ 的溶出，導(dǎo)致PPJ提取率下降［17］。因此，后續(xù)試驗(yàn)在α3為50%，60%，70%下進(jìn)行。

當(dāng)α4在0.10%～0.15%時(shí)，PPJ 提取率隨α4增加顯著增加（P＜0.05）。其原因是隨著α4增加，果膠酶催化能力增強(qiáng)，使植物細(xì)胞壁發(fā)生降解，有利于PPJ 的擴(kuò)散，使PPJ 的提取率提升［18］。但當(dāng)α4超過0.15%時(shí)，隨著α4的增加，PPJ 提取率顯著降低（P＜0.05）。該結(jié)果與TAN 等［19］采用超聲輔助酶法提取葡萄皮花色苷結(jié)果一致。因此，后續(xù)試驗(yàn)在α4為0.15%，0.20%，0.25%下進(jìn)行。

當(dāng)α5在10～30 min 時(shí)，PPJ 提取率隨α5延長顯著增加（P＜0.05）。這是由于在提取的初期，空化效應(yīng)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多酚逐漸向外擴(kuò)散，使得PPJ 提取率不斷提高［20］。但當(dāng)α5超過30 min 時(shí)，由于細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)PPJ 已經(jīng)溶出，再延長時(shí)間對(duì)PPJ 提取率的變化無顯著影響（P＜0.05）。因此，后續(xù)試驗(yàn)將α5設(shè)置為30 min。

2.2 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 模型建立與顯著性檢驗(yàn)

表1 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.1 Experimental design and results of response surface method

對(duì)回歸方程系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，其結(jié)果見表2。由表2 可知，回歸系數(shù)R2=0.890 7，F(xiàn)=8.15，P=0.000 2。由于失擬項(xiàng)P=0.374 6＞0.05，說明模型的失擬項(xiàng)不顯著，表明通過RSM 方法建立的數(shù)學(xué)模型能夠較好地?cái)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表2 PPJ 工藝優(yōu)化回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)報(bào)告Tab.2 Significance test report of regression model coefficient of jujube polyphenol process optimization

F 值是判斷試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值影響是否顯著的有利工具。F（α1）=11.39，F(xiàn)（α2）=0.030，F(xiàn)（α3）=20.95，F(xiàn)（α4）=7.475×10-3，即各試驗(yàn)因素對(duì)PPJ提取率的影響順序?yàn)棣?＞α1＞α2＞α4。

對(duì)RSM 模型進(jìn)行充分性檢驗(yàn)。由圖2（a）可知，試驗(yàn)得到的PPJ 提取率的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值基本一致。說明RSM 模型可以用來測(cè)算各提取工藝條件下的PPJ 提取率。圖2（b）顯示，PPJ 提取率均滿足正態(tài)分布，且未出現(xiàn)偏離方差。由圖2（c）可看出，各個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的學(xué)生化外殘差范圍均控制在±3 范圍內(nèi)。圖2（d）顯示，簡(jiǎn)化多項(xiàng)式模型的Cook’s 距離均分布在1.0 以內(nèi)。充分性檢驗(yàn)可以進(jìn)一步驗(yàn)證采用GA 法優(yōu)化超聲輔助酶法提取PPJ 的可行性。

圖2 RSM 模型充分性檢驗(yàn)圖Fig.2 RSM model adequacy test diagram

2.2.2 交互項(xiàng)分析

各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖如圖3所示。結(jié)合圖3 和表2 的結(jié)果可知，α1α2，α1α3，α1α4，α2α4，α3α4的兩兩交互作用均對(duì)β無明顯影響（P＞0.05），故不進(jìn)行深入分析。由圖3（a）可知，β存在極值點(diǎn)；圖3（b）的等高線圖呈橢圓形，表明α2α3的交互作用會(huì)顯著影響β（P＞0.05）。由此可知，各因素對(duì)β的影響順序?yàn)棣?＞α1＞α2＞α4，與方差分析的結(jié)果相符。

圖3 各試驗(yàn)因素交互作用的響應(yīng)面和等高線Fig.3 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors

2.2.3 PPJ 提取工藝參數(shù)優(yōu)化

利用Matlab R2018b 軟件中的GA 優(yōu)化工具箱分析優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)，迭代143 次，PPJ 提取率達(dá)到最高值，此時(shí)α1，α2，α3，α4水平編碼分別為1，-1，1，-1，對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)水平分別為400 W，30 ℃，70%，0.15%，在此條件下，所得β的理論值為0.94%。

2.2.4 試驗(yàn)驗(yàn)證

為驗(yàn)證GA 法的可靠性，在以上試驗(yàn)所得到的各試驗(yàn)因素水平上進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，所得PPJ 提取率為0.90%±0.01%，試驗(yàn)數(shù)值和理論數(shù)值之間的相對(duì)誤差為4.26%。說明GA 可較好地測(cè)算PPJ 提取率，同時(shí)也證明采用RSMCGA 優(yōu)化PPJ 提取的技術(shù)工藝可行。

3 結(jié)語

本文通過RSMCGA 優(yōu)化超聲輔助酶法提取PPJ 工藝，在超聲功率為400 W，提取溫度為30 ℃，乙醇濃度為70%，果膠酶劑量為0.15%，提取時(shí)間為30 min 的工藝參數(shù)條件下，具有最佳的提取效果，PPJ 的提取率達(dá)到0.90%±0.01%。表明RSMCGA 可較好地測(cè)算PPJ 提取率，通過RSMCGA 優(yōu)化PPJ 的提取工藝參數(shù)可行。研究結(jié)果將會(huì)為PPJ 的提取和相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供一種綠色高效的解決方案。