瑤藥黃鉆總三萜超聲輔助提取工藝優(yōu)化及抗氧化、抑菌性研究

郭 松，農(nóng) 斌，梁湘蘭，陳楊勻

（1.廣西科技師范學院 食品與生化工程學院，廣西來賓 546199；2.廣西科技師范學院 壯瑤藥品質生物學重點實驗室，廣西來賓 546199）

0 引言

瑤藥黃鉆基源植物為翼梗五味子（Schisandra henryi C.B.Clarke），屬五味子科五味子屬?，幩廃S鉆根莖部分可入藥，收錄于《中華人民共和國藥典》。黃鉆是瑤醫(yī)藥譜中“十八鉆”之一，有活血止血、祛風散寒和消腫止痛的功效［1］。藥物研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)的五味子屬藥材所含的可藥用化學成分多種多樣，其中目前已開發(fā)的藥用有效成分主要是三萜類、木脂素類和揮發(fā)油等［2］。

三萜類化合物是黃鉆中主要的藥用活性成分之一［3］，具有高度的結構多樣性和廣泛的生物活性［4］，可以分為多個不同種類，包括半夏酮、黃芩素、三七甙和肉桂酮等［5］。藥用三萜類天然產(chǎn)物具有多種藥理活性，包括降血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和抑菌等［6］。三萜類成分的提取分離常用的方法有超臨界流體萃取法、超聲輔助提取法等［7］。超聲輔助提取技術是一種基于聲波作用的無污染、高效的物質提取技術，近年來在中藥提取領域得到廣泛的應用［8］。超聲波作用使溶劑和被提取物質之間形成微小氣泡，破壞樣品細胞的細胞壁和細胞膜結構，使得生物活性物質更容易釋放［9-10］。因此，超聲輔助提取技術是一種方便且高效的提取方法，具有提高提取效率、節(jié)能環(huán)保和減少試驗成本等優(yōu)點，是一種具有很大潛力的提取方法［11］。

本文旨在優(yōu)化瑤藥黃鉆總三萜的超聲輔助提取工藝，對黃鉆總三萜的抗氧化和抗菌生物活性進行分析，以提高其提取效率和生物利用率，為瑤藥黃鉆的開發(fā)利用提供一定的科學參考。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器

R-1001VN 型旋轉蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿有限公司）；KH-100DE 型數(shù)控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；ATY224 型電子天平（島津菲律賓工廠）；H1850 型臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；WJX-100 型高速多功能粉碎機（永康市紅太陽機電有限公司）；V-5600 型可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；HH-4 型恒溫水浴鍋（常州天瑞儀器有限公司）。

1.2 試劑與材料

瑤藥黃鉆購置于廣西壯族自治區(qū)金秀瑤族自治縣瑤醫(yī)醫(yī)院，隨后保存于實驗室。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌ATCC 菌株，環(huán)凱生物集團；齊墩果酸標準品，上海麥克林生化科技股份有限公司；乙醇、香草醛、甲醇、高氯酸、冰乙酸、乙酸乙酯、二甲基亞砜等常規(guī)試劑均為分析純，成都市科隆化學品有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

2 試驗方法

2.1 試驗材料預處理

將黃鉆自然風干，切成小片，使用粉碎機進行細磨，過100 目篩網(wǎng)，存放在密封袋中，放置于陰涼干燥處備用。

2.2 齊墩果酸標準曲線的繪制

精確稱取0.020 0 g 齊墩果酸標準品，將樣品溶解于甲醇中，用100 mL 容量瓶稀釋至刻度線，制備出0.2 mg/mL 的標準品溶液。取6 支10 mL試管，分別加入0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL 的標準品溶液，將試樣放置于60 ℃的水浴中加熱，直至完全蒸干。冷卻至室溫后，加入0.2 mL 新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液（稱取0.250 0 g 香草醛，加入5 mL 冰乙酸溶解），以及0.8 mL 高氯酸。在60 ℃水浴中加熱15 min 后，試樣顯色。將試樣放入冰水浴中冷卻5 min，取出后加入冰乙酸至5 mL，相應試劑作空白對照，在560 nm 波長處測定吸光度，平行測定3 次，取平均值［12］。以吸光度值為縱坐標，齊墩果酸質量濃度為橫坐標，用Origin 作圖軟件繪制標準曲線。

2.3 黃鉆總三萜得率的計算

經(jīng)試驗得到的黃鉆總三萜超聲提取液按照試驗操作步驟，測定樣液吸光度值，并將吸光度值代入標準曲線回歸方程計算總三萜含量［13］。按照下式計算總三萜得率：

式中 Y——總三萜得率，%；

M—— 樣品吸光度值在標準曲線上所對應的總三萜質量，mg；

n——稀釋倍數(shù)；

m——樣品質量，g。

2.4 超聲輔助提取黃鉆總三萜單因素試驗

2.4.1 溶劑種類對黃鉆總三萜提取率的影響

取3 份1.000 0 g 的黃鉆粉末以1：50 的料液比分別與甲醇、乙醇、乙酸乙酯混合均勻，在超聲波清洗機中40 ℃水溫超聲輔助提取30 min，所得提取液經(jīng)過8 000 r/min 離心作用15 min，取上清液0.2 mL 各3 管，60 ℃水浴揮干，冷卻后加入0.2 mL 新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液、0.8 mL的高氯酸做顯色劑［14］，將樣品在60 ℃水浴鍋中顯色15 min，取出后進行5 min 冰水浴冷卻，加入冰乙酸至5 mL 刻度線，用相應試劑做空白對照，在560 nm 波長處測定吸光度值。

2.4.2 料液比對黃鉆總三萜提取率的影響

根據(jù)單因素試驗結果，選擇甲醇作為后續(xù)的試驗溶劑。準確稱取1.000 0 g 的樣品，與100%甲醇分別按照1：10，1：20，1：30，1：40，1：50 的比例混合制成混合物；然后在40 ℃的超聲輔助下提取30 min；最后測定吸光度值并計算黃鉆總三萜提取率。

2.4.3 溶劑濃度對黃鉆總三萜提取率的影響

精確稱取1.000 0 g 黃鉆粉末，溶劑種類與料液比按上文確認，分別與60%，70%，80%，90%，100%的甲醇混合，40 ℃超聲輔助提取30 min，提取后測定其吸光度值，并計算黃鉆總三萜提取率。

2.4.4 超聲時間對黃鉆總三萜提取率的影響

精確稱取1.000 0 g 黃鉆粉末，溶劑種類、料液比和溶劑濃度按上文確認，分別超聲輔助提取20，30，40，50，60 min，提取后測定吸光度值，并計算黃鉆總三萜提取率。

2.5 Box-Behnken 響應面試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，利用響應面設計軟件的Box-Behnken 對黃鉆的超聲輔助提取條件進行優(yōu)化。因子編碼及水平見表1。

表1 因素水平編碼表Tab.1 Factor level coding table

2.6 黃鉆總三萜總抗氧化能力的測定

2.6.1 總三萜的提取

根據(jù)上述的試驗結果，以最佳工藝條件進行總三萜的提取。設定提取目標為1.000 0 g 的三萜類化合物，開始進行超聲提取3 次，并計算提取率。將所得提取液倒入旋蒸瓶旋蒸，當瓶中溶液開始濃稠時，移入提前稱好空瓶重量的小號旋蒸瓶繼續(xù)旋蒸。直至提取物呈現(xiàn)膏狀，適當降低旋蒸溫度后繼續(xù)旋蒸，當瓶中溶劑蒸干后停止。用10 mL 的20%二甲基亞砜將提取物溶解，將旋蒸瓶瀝干后稱量瓶壁固體物和瓶體的總重量，確定提取物的質量。

2.6.2 總抗氧化能力標準曲線的制作

標準品：10 mg FeSO4·7H2O 加入0.9 mL 蒸餾水和20 μL 濃硫酸，配制成40 μmol/mL FeSO4標準溶液備用。

混合液：將試劑盒中的試劑一、試劑二、試劑三按7：1：1 的比例混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。使用前置于37 ℃恒溫水浴鍋中預熱10 min［15］。

按照試劑盒使用方法，在593 nm 波長下測定吸光度值，并繪制標準曲線。

2.6.3 總抗氧化能力的測定

將提取物配制成梯度濃度的樣品溶液。取5支離心管，在每支管中各加入180 μL 的混合液和18 μL 的樣品溶液，接著加入90 μL 的蒸餾水，混勻后避光反應10 min，593 nm 波長處測定吸光度值，以VC 為對照，比較總抗氧化能力。

2.7 黃鉆總三萜抑菌能力研究

2.7.1 培養(yǎng)基的制備

配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方：氯化鈉5.000 0 g、牛肉膏3.000 0 g、蛋白胨10.000 0 g 和瓊脂粉20.000 0 g。將這些成分溶解在蒸餾水中，定容至1 000 mL。pH 值調整至7.2～7.4，充分混合后，置于高壓蒸汽滅菌鍋中進行121 ℃滅菌20 min。待冷卻后，將培養(yǎng)基倒入平板中制成培養(yǎng)基平板，并在4 ℃下保存?zhèn)溆茫?6］。

液態(tài)培養(yǎng)基的制備方式與固態(tài)培養(yǎng)基相同，只是在培養(yǎng)基配方中不加入瓊脂粉，進行121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min［17］，取出冷卻，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7.2 抑菌圈測定

當具有抑菌作用的樣品在固體培養(yǎng)基上擴散時，會在培養(yǎng)基表面形成1 個圓形區(qū)域，殺死周圍的細菌或抑制其生長，該區(qū)域被稱為抑菌圈［18］。通過測量抑菌圈的大小可以評估樣品的抑菌能力［19］。

金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別屬革蘭氏陽性和陰性菌。在陽性對照中選擇氨芐青霉素鈉，在陰性對照中選擇硫酸鏈霉素鹽［20］。首先將總三萜樣品用無菌水稀釋成10 mg/mL 的溶液；然后將經(jīng)過滅菌處理的直徑為6 mm 的干燥濾紙片浸泡在其中；接著制備0.01 mg/mL 的抗生素溶液并同樣將濾紙片浸泡其中；最后吸取200 μL 的菌懸液涂布在固體培養(yǎng)基上，使其均勻分布，將泡于樣品溶液、抗生素溶液、無菌水中的濾紙片取出，揮干后放在培養(yǎng)基表面，做好標記，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后取出，用尺子測量抑菌圈直徑，當抑菌圈＞6 mm 時，說明樣品具有一定的抑菌能力。

2.7.3 最小抑菌濃度測定

將樣品溶液配制成4 個不同的梯度：100，50，25，12.5 mg/mL，同時準備0.1 mg/mL 的抗生素溶液。取6 支玻璃培養(yǎng)試管，各加入4 mL 的液體培養(yǎng)基，200 μL 的菌懸液，按梯度分別加入200 μL的樣品溶液，同時進行1 組陽性對照試驗（不加樣品溶液，加抗生素溶液）和空白試驗（只有菌懸液）?；旌暇鶆蚝笥帽ｕr膜密封在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后觀察溶液的渾濁度。當1 支試管內的溶液澄清，上一梯度濃度的試管溶液混濁，則該梯度的總三萜濃度即為最小抑菌濃度（MIC）［21］。

2.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復3 次，采用Excel 2016 和Origin 2018 進行試驗數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖。

3 結果與分析

3.1 標準曲線的建立

圖1 為齊墩果酸標準曲線，其線性回歸方程為y=0.002 9x+0.124 3，R2=0.996 4，線性關系良好，表明該方程可用于計算所提取的黃鉆總三萜質量。

圖1 齊墩果酸標準曲線Fig.1 Standard oleanolic acid curve

3.2 單因素試驗結果分析

3.2.1 不同溶劑對提取率的影響

以甲醇、乙醇、乙酸乙酯為溶劑提取時，甲醇作為溶劑對黃鉆總三萜的提取率均高于乙醇和乙酸乙酯。同時，醇類有機溶劑的提取率優(yōu)于乙酸乙酯。

3.2.2 不同單因素對提取率的影響

由圖2 可知，當料液比達到1：30 時，提取率達到最大值。當溶劑濃度較低時，黃鉆樣品與溶劑接觸面小，導致提取效果不佳；料液比達到最佳比例時，溶劑與黃鉆樣品充分混合，在超聲輔助提取時，兩者有效碰撞面積最大，提取率達到最大值；若繼續(xù)增大料液比，會導致在超聲輔助提取時，樣品與溶劑的有效碰撞面積逐漸減少，導致最終的總三萜提取率降低［22］。綜合考慮試驗簡便性、高效性和資源節(jié)約等因素，選擇黃鉆樣品與溶劑1：30 的料液比進行后續(xù)試驗。

圖2 不同單因素對提取率的影響Fig.2 Influence of different single factors on extraction rate

適當?shù)挠袡C溶劑濃度有利于總三萜的溶出，過高或過低會導致競爭性成分溶出，或總三萜溶出減少，從而導致提取率降低［23］。當甲醇濃度達到70%時，黃鉆總三萜提取率最大。甲醇濃度較低時提取效果不佳，若甲醇濃度繼續(xù)增加，黃鉆總三萜提取率下降。綜合試驗結果，選擇甲醇濃度為70%的溶劑做后續(xù)的提取條件。

在超聲時間達到40 min 時，有最佳的總三萜提取率。研究表明，提取時間過長或過短都會導致總三萜提取率變低［24］。因此，選擇40 min 的超聲時間作為后續(xù)試驗的提取條件。

3.3 響應面結果分析

根據(jù)單因素試驗結果，選擇料液比（A）、甲醇濃度（B）、超聲時間（C）為3 個自變量，總三萜提取率為響應值（Y），設計3 個水平，以隨機順序進行15 次試驗。對試驗結果進行擬合分析，建立黃鉆總三萜提取率與自變量的關系模型。該模型表達式：Y=1.26-0.092 5A+0.113 7B+0.058 8C-0.022 5AB+0.062 5AC-0.03BC-0.376 7A2-0.299 2B2-0.234 2C2。

對模型進行方差分析，如表2 所示。模型P＜0.000 1＜0.01，表明模型極顯著；失擬項表明模型與試驗結果之間的擬合程度，失擬項的P＞0.050，方差不顯著，說明模型與試驗的擬合程度良好，試驗誤差小。計算得模型的CV=4.06%，說明模型可信度較高，可用以預測黃鉆總三萜的提取率；相關系數(shù)R2=0.995 7，表明試驗與預測值之間的擬合程度良好，即黃鉆總三萜得率的變化99.57%來自于所選試驗條件；經(jīng)計算校正系數(shù)Radj2=0.987 8，說明模型可以解釋98.78%的黃鉆總三萜提取率的變化［25-27］。

表2 方差分析表Tab.2 Variance analysis table

由回歸方程各項方差可知，一次項A，B，C 對試驗結果的影響極顯著（P＜0.01）；交互項AC 顯著（P＜0.05），AB，BC 不顯著（P＞0.05）；二次項A2，B2，C2都極顯著（P＜0.01）。以上各項的顯著性都表明，各試驗因素與黃鉆總三萜提取率之間不是簡單的線性關系。表中各項試驗因素的F值表示該因素對響應值的影響大小，F(xiàn)值越大表明該因素對響應值的影響越大，因此影響總三萜提取率的因素順序為甲醇濃度＞料液比＞超聲時間。

為確定各個因素及其交互作用對黃鉆總三萜提取率的影響，根據(jù)回歸方程繪出相應的響應面圖，如圖3 所示。等高線排列緊密且形狀呈橢圓形，表明圖中所示的2 個因素交互作用顯著；排列疏松且呈現(xiàn)圓形，則表明2 個因素交互作用不顯著。響應面圖中曲線的坡度反應交互作用的影響，曲面坡度越大說明影響越顯著，曲面坡度越平緩說明圖中2 個因素對提取率的影響越不顯著。圖中的顏色深淺反應總三萜提取率的變化情況。

圖3 各因素間交互作用的響應面圖Fig.3 Response surface plots showing the interactions of various factors

料液比與超聲時間的響應面圖坡面陡峭程度最大，具有最高的提取率點；等高線相較于其他2 組，呈更為規(guī)整的橢圓狀，達到顯著水平（P＜0.05）。通過分析料液比與甲醇濃度、甲醇濃度與超聲時間的等高線與響應面圖，發(fā)現(xiàn)其兩兩之間的交互作用不強，對提取率影響不顯著（P＞0.05），且甲醇濃度與超聲時間的交互作用強于料液比與甲醇濃度，這與方差分析表中的結果相符合。

結合方程進行預測，黃鉆總三萜的超聲輔助提取工藝的最佳條件：料液比1：28.79 g/mL，甲醇濃度71.89%，超聲時間40.97 min，預測的最大提取率為1.282%?？紤]實際操作簡便性，最終確定提取工藝條件：料液比1：29 g/mL，甲醇濃度72%，超聲時間41 min，根據(jù)此條件進行3 次驗證試驗，黃鉆總三萜平均提取率為1.275%，與模型預測值相接近，說明模型具有實際指導意義。

3.4 抗氧化能力結果與分析

3.4.1 總三萜浸膏的獲取

通過膏浸物的溶解，算出提取到的總三萜物質純化物為0.700 0 g，考慮到旋蒸及溶解過程中的損失，該數(shù)值合理。取1 mL 溶解所得到的溶液，分別用20%的二甲基亞砜稀釋到測定總抗氧化能力所需的濃度梯度，以備后續(xù)試驗。

3.4.2 總抗氧化能力測試

采用試劑盒法測定待測物質還原Fe3+離子的能力，從而評估物質的總抗氧化能力。按照方程：y=20.753x-0.005 8，R2=0.999 3，計算黃鉆總三萜的總抗氧化能力。如圖4 所示，三萜類物質雖具有抗氧化能力，但其抗氧化能力與VC 對照品相差較大，處于相同濃度梯度上的樣品與VC 呈現(xiàn)2 種不同變化狀態(tài)。VC 總抗氧化能力隨著濃度的增加而明顯變大，而該梯度范圍內的樣品總抗氧化能力保持在2～4 μmol/mL。

圖4 總抗氧化能力和與VC 的對比Fig.4 Total antioxidant capacity and comparison with VC

3.5 抑菌能力結果分析

3.5.1 對大腸桿菌抑菌能力結果分析

圖5 為大腸桿菌抑菌圈測定結果。樣品溶液的濾紙片周圍出現(xiàn)較為明顯的抑菌圈，但較抗生素濾紙片周圍的抑菌圈小，即總三萜樣品對大腸桿菌有抑制作用，但弱于抗生素。圖6 為總三萜對大腸桿菌的最低抑菌濃度測定結果。6 號空白對照管混濁有菌生長；5 號陽性對照管澄清透明，抑菌效果顯著；4 號管為無抑菌效果；其上一梯度樣品溶液所代表的3 號管內澄清透明，抑菌效果明顯，故3 號管樣品濃度25 mg/mL 為黃鉆總三萜對大腸桿菌的MIC。

圖5 大腸桿菌抑菌圈試驗組Fig.5 Experimental group of E.coli bacteriostatic zone

圖6 大腸桿菌最低抑菌濃度試驗組Fig.6 Experimental group of minimum inhibitory concentration of E.coli

3.5.2 對金黃色葡萄球菌抑菌能力結果分析

圖7 是金黃色葡萄球菌抑菌圈試驗結果。樣品濾紙片的培養(yǎng)基表面沒有出現(xiàn)明顯的抑菌圈。陽性對照組的抑菌圈效果明顯優(yōu)于試驗組，說明總三萜對金黃色葡萄球菌并無明顯的抑制作用。由于在金黃色葡萄球菌的抑菌圈試驗中，總三萜對金黃色葡萄球菌沒有抑制效果，所以后續(xù)不再對金黃色葡萄球菌進行MIC 測試。

圖7 金黃色葡萄球菌抑菌圈試驗組Fig.7 Experimental group of S.aureus bacteriostatic zone

4 結語

通過優(yōu)化黃鉆中總三萜的提取方法，為傳統(tǒng)醫(yī)藥材的現(xiàn)代化科學利用提供相應的研究辦法，同時也為黃鉆有效成分的提取提供一種更新、更好的選擇。通過對料液比、甲醇濃度、超聲時間3個因素的研究分析，建立超聲輔助提取黃鉆總三萜的數(shù)學模型，得到響應面圖。方差分析表明，模型可信度高，具有實際可操作性，可用于對樣品提取率的預測。黃鉆總三萜最佳提取工藝條件：料液比1：29 g/mL，甲醇濃度72%，超聲時間41 min，此時提取率為1.275%。通過對黃鉆總三萜的總抗氧化能力進行測定，結果表明，黃鉆總三萜具有良好的抗氧化能力，但弱于VC。對黃鉆總三萜的抑菌活性進行研究，發(fā)現(xiàn)對大腸桿菌有較為明顯的抑制作用；25 mg/mL 的總三萜溶液即可阻礙大腸桿菌生長。對于金黃色葡萄球菌，并未發(fā)現(xiàn)有明顯的抑制作用。