miRNA-15a/16 調(diào)控Bmi-1 蛋白在卵巢癌順鉑化療耐藥中的作用

廉陽秧，岳紅萍，端 婭，胡紅文，羅 芳

（云南省第三人民醫(yī)院婦科，云南 昆明 650200）

在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病率中，卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，但在婦科腫瘤中，卵巢癌的病死率卻排在第一位[1]。卵巢癌順鉑化療耐藥性是治療中的一大難題，直接影響患者的生存期，需要找到解決化療耐藥的策略[2]。研究發(fā)現(xiàn)化療藥物的耐藥性與化療藥物作用靶點(diǎn)、DNA 損傷修復(fù)系統(tǒng)、細(xì)胞凋亡調(diào)控多方面等的異常有關(guān)[3-4]。

筆者前期[5]通過生物信息學(xué)分析中利用R 語言及Bioconductor 軟件包分析上皮性卵巢癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)miRNA-15a 和miRNA-16 在卵巢癌中存在差異表達(dá)，通過文獻(xiàn)挖掘發(fā)現(xiàn)在miR-15a 可通過抑制Bmi-1 表達(dá)水平，降低胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[6]。在抗藥性的卵巢癌化療中，兩者之間有沒有關(guān)聯(lián)，目前還有待考證。

該研究通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，利用miRNA-15a和miRNA-16 模擬物轉(zhuǎn)染人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株CoC1/DDP，檢測不同分組miRNA-15a/16、Bmi-1 蛋白表達(dá)的變化，同時(shí)檢測不同組細(xì)胞的存活和凋亡情況，分析miRNA-15a/16 與Bmi-1蛋白在卵巢癌耐細(xì)胞細(xì)胞株的水平變化關(guān)系，探討miRNA-15a/16 在逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥過程中可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株CoC1/DDP（中國典型培養(yǎng)物保存中心）、順鉑（索寶生物公司）、miRNA15a/16mimics/NC、Bmi-1 過表達(dá)質(zhì)粒（漢恒生物公司）、Bmi-抗體、Trizol 購自分子探針公司，DNA 損傷檢測試劑盒（Abcam）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA 熒光定量PCR 檢測試劑盒（索寶生物公司）、Lipofectiamine 2000（諾博萊德公司）、Annexin V/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天公司）、CCK-8 試劑盒、RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（GIBCO）。

1.1.2 主要儀器正倒置熒光顯微鏡（Nikon）、二氧化碳培養(yǎng)箱（Forma）、全自動酶標(biāo)儀（BIO-RAD）、紫外分光光度計(jì)（PE BIOSYTEM）、凝膠圖片分析儀（BIO-RAD）、熒光定量PCR 儀（BIO-RAD）、梯度PCR 儀（BIO-RAD）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)對象為人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株CoC1/DDP。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為RPMI1640培養(yǎng)基，含有1%青鏈霉雙抗和10%胎牛血清。將貼滿整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁的細(xì)胞傳代備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞RNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)按照Lipofectiamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，NC、miRNA-15a/16 模擬物、Bmi-1 質(zhì)粒各自加入培養(yǎng)基中，在室溫下孵育20 min。取對數(shù)生長期的順鉑濃度為5.0 μM/mL的CoC1/DDP 細(xì)胞，接種于12 孔板中，加入新鮮培養(yǎng)基放置37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中過夜，第2 天清洗細(xì)胞將模擬物溶液緩慢加入每個(gè)孔內(nèi)，輕搖均勻，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞樣本，分別為NC 組、轉(zhuǎn)染miRNA-15a 組、轉(zhuǎn)染miRNA-16 組、過表達(dá)的Bmi-1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的miRNA-15a 組和過表達(dá)Bmi-1 質(zhì)粒的miRNA-16 組，然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 CCK-8 法檢測細(xì)胞存活度取對數(shù)生長期的各組CoC1/DDP 細(xì)胞，接種 96 孔板，密度為每孔 200 針，轉(zhuǎn)染 48 h。CCK-8 在每個(gè)孔中加入CCK-8，經(jīng)過 5 d 的孵育后，再進(jìn)行 2 h 的孵育。然后在波長450 nm 的地方用分光度儀進(jìn)行吸光度的測定。重復(fù)做每組 3 次實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 流式Annexin/PI 檢測細(xì)胞凋亡根據(jù)Annexinv/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對細(xì)胞凋亡進(jìn)行流式術(shù)檢測。向轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)加入試劑緩沖液，并在室溫中黑暗孵育15 min，在1 h 內(nèi)通過流式細(xì)胞儀分析樣品。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 細(xì)胞總RNA 的提取及PCR 擴(kuò)增檢測Bmi-1、miRNA-15a、miRNA-16 的表達(dá)采集細(xì)胞，按照Trizol 試劑盒操作提取總RNA。熒光定量 PCR 檢測按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)出cDNA 第一鏈。加入PCR 混合物、引物，置入熒光定量PCR 儀觀察。miRNA-15a 上游引物5 ′-UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG-3 ′，下游引物5 ′-CAGGCCAUAUUGUGCUGCCUCA-3 ′ 。miRNA-16 上游 引物5 ′-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 ′，下游引物CCAGUAUUAACUGUGCUGCUGA。Bmi-1 上游引物5 ′-TCATCCTTCTGCTGATGCTG-3 ′，Bmi-1 下游引物5 ′-GCATCACAGTCATTGCTCCT-3 ′ 。以GAPDH 為內(nèi)參照基因，GAPDH 上游引物5 ′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ′，GAPDH 下 游引物5 ′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3 ′ 。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性15 s，95 ℃變性30 s，60 ℃退火15 s，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)。Bmi-1、miRNA-15a、miRNA-16 的相對表達(dá)水平以2-ΔΔCt表示。

1.2.6 Western blot 檢測Bmi-1 蛋白的表達(dá)情況接種24 孔板，培養(yǎng)24 h，取不同組的細(xì)胞，在數(shù)個(gè)生長期內(nèi)接種。取50 μg 蛋白樣品，電泳、轉(zhuǎn)膜、密閉過夜、孵育，最后加入發(fā)光底物X 線曝光顯示目的蛋白條，以目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量與內(nèi)標(biāo) Ia 的比值表示。

1.2.7 γ-H2AX 免疫熒光檢測DNA 損傷程度根據(jù)γ-H2AX 免疫熒光試劑盒進(jìn)行細(xì)胞DNA 損傷程度測定，γ-H2AX 采用雙抗體夾心法測定，單位為ng/L。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有研究數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件。全部的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組之間的均數(shù)比較采用方差分析的方法，利用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本間的均數(shù)比較。以P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度順鉑對CoC1/DDP 細(xì)胞處理的細(xì)胞活度情況

通過CCK-8 法對不同濃度順鉑干預(yù)的細(xì)胞進(jìn)行存活度檢測，見圖1，選定順鉑濃度為5.0 μM/mL 時(shí)細(xì)胞活度為80%，選定該濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度順鉑處理的細(xì)胞活度Fig.1 Cell activity was treated at different concentrations of cisplatin

2.2 CoC1/DDP 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物鑒定

使用熒光定量PCR 對CoC1/DDP 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物鑒定是否轉(zhuǎn)染成功。結(jié)果顯示分別檢測正常培養(yǎng)CoC1/DDP 細(xì)胞組、5.0 μM/mL 順鉑處理組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染miRNA-15a 組和轉(zhuǎn)染miRNA-16 組的各組的miRNA-15a 和miRNA-16 組的表達(dá)水平，見圖2、圖3。其中miRNA-15a、miRNA-16 模擬物轉(zhuǎn)染組的miRNA-15a、miRNA-16 表達(dá)高于正常對照組和陰性對照組（P＜ 0.05），正常對照組和陰性對照組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。說明轉(zhuǎn)染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物的CoC1/DDP 細(xì)胞中miRNA-15a、miRNA-16 表達(dá)增加，轉(zhuǎn)染成功。

圖2 miRNA-15a 在各組細(xì)胞中的表達(dá)水平Fig.2 The expression level of miRNA15a in each group of cells

圖3 miRNA-16 在各組細(xì)胞中的表達(dá)水平Fig.3 The expression level of miRNA16 in each group of cells

2.3 CoC1/DDP 細(xì)胞的 Bmi-1 表達(dá)水平與miRNA-15a、miRNA-16 表達(dá)水平的關(guān)系

使用熒光定量PCR 檢測正常培養(yǎng)CoC1/DDP細(xì)胞組、5.0 μM/mL 順鉑處理組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染miRNA-15a 組、轉(zhuǎn)染miRNA-16 組和過表達(dá)的Bmi-1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染miRNA-15a 和miRNA-16 組各組細(xì)胞的Bmi-1 的表達(dá)情況，見圖4。同時(shí)采用Western blot 分別檢測上述各組的Bmi-1蛋白表達(dá)水平，見圖5，結(jié)果表明CoC1/DDP 細(xì)胞中Bmi-1 的表達(dá)水平升高，與正常培養(yǎng)細(xì)胞組、5.0 μM/mL 順鉑處理組、陰性對照組和過表達(dá)的Bmi-1 質(zhì)粒組相比較轉(zhuǎn)染miRNA-15a 和miRNA-16 模擬物組的Bmi-1 水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。研究表明Bmi-1 蛋白在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株CoC1/DDP 中的表達(dá)升高，上調(diào)細(xì)胞中miRNA-15a、miRNA-16 表達(dá)水平，Bmi 蛋白下降。

圖4 Bmi-1 在各組細(xì)胞中的表達(dá)水平Fig.4 The expression level of Bmi-1 in each group of cells

圖5 Bmi-1 蛋白在各組的條帶的IA 值水平Fig.5 IA values of Bmi-1 protein in bands of each group

2.4 轉(zhuǎn)染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物對CoC1/DDP 細(xì)胞存活、凋亡影響

使用CCK-8 法和流式Annexin/PI 法對正常培養(yǎng)CoC1/DDP 細(xì)胞組、5.0 μM/mL 順鉑處理組、陰性對照組組、轉(zhuǎn)染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物組和過表達(dá)的Bmi-1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染miRNA-15a和miRNA-16 組進(jìn)行細(xì)胞活度和凋亡率檢測。細(xì)胞存活度檢測，見圖6，miRNA-15a、miRNA-16模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活度低于正常培養(yǎng)CoC1/DDP細(xì)胞組、5.0 μM/mL 順鉑處理組、陰性對照組和過表達(dá)的Bmi-1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染miRNA-15a 和miRNA-16 組（P＜ 0.05），5.0 μM/mL 順鉑處理組和陰性對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），過表達(dá)的Bmi-1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染miRNA-15a 和miRNA-16 組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。各組細(xì)胞凋亡率，見圖7、圖8。miRNA-15a、miRNA-16 模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率高于正常培養(yǎng)CoC1/DDP 細(xì)胞組、5.0 μM/mL 順鉑處理組、陰性對照組、過表達(dá)的Bmi-1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染miRNA-15a 和miRNA-16 組（P＜ 0.05）。5.0 μM/mL 順鉑處理組、陰性對照組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），過表達(dá)的Bmi-1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染miRNA-15a 和miRNA-16 組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。提示轉(zhuǎn)染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物后的CoC1/DDP細(xì)胞有更高的凋亡率，細(xì)胞活度更低，過表達(dá)的Bmi-1 質(zhì)?？商岣呒?xì)胞活度，降低細(xì)胞凋亡率，提示過表達(dá)Bmi-1 可逆轉(zhuǎn)miRNA-15a、miRNA-16 模擬物對細(xì)胞的影響。

圖6 各組細(xì)胞的細(xì)胞存活度Fig.6 Cell survival of each group

圖7 各組細(xì)胞的凋亡率水平Fig.7 The apoptosis rate of cells in each group

圖8 各組細(xì)胞的凋亡率圖譜Fig.8 Apoptotic rate atlas of each group

2.5 轉(zhuǎn) 染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物對CoC1/DDP 細(xì)胞DNA 損傷的影響

為了確定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染miRNA-15a、miRNA-16模擬物對CoC1/DDP 細(xì)胞DNA 造成的損傷，使用γ-H2AX 免疫熒光法測定正常培養(yǎng)CoC1/DDP細(xì)胞組、5.0 μM/mL 順鉑處理組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物組和過表達(dá)的Bmi-1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染miRNA-15a 和miRNA-16組細(xì)胞的γ-H2AX 含量，見圖9。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miRNA-15a、miRNA-16 模擬物組γ-H2AX含量發(fā)生升高（P＜ 0.05），5.0 μM/mL 順鉑處理組和陰性對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），過表達(dá)的Bmi-1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染miRNA-15a 和miRNA-16 組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。提示上調(diào)細(xì)胞中miRNA-15a、miRNA-16 表達(dá)水平，細(xì)胞DNA 損傷更嚴(yán)重。

圖9 各組細(xì)胞的γ-H2AX 含量Fig.9 γ-H2AX content in each group

3 討論

卵巢癌起病隱匿，約75%就診時(shí)已屬晚期，手術(shù)往往不能完全清除病灶，術(shù)后復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差，患者的5 a 生存率始終一直在30%左右[7]。卵巢癌腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)后聯(lián)合化療是其的重要治療方式，而化療耐藥是影響卵巢癌患者預(yù)后不良的主要原因，克服化療耐藥是一種有前途的治療策略，也是目前研究的趨勢。miRNA 是內(nèi)源性非編碼小分子RNA[8]，近年來研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA 在各種腫瘤組織表達(dá)水平的變化，通過調(diào)控靶基因的表達(dá)水平，影響了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，從而影響組織對化療藥物的敏感性，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及對化療藥物反應(yīng)的重要影響因素[9-11]。

前期筆者通過對卵巢癌生物芯片的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-15A 和miRNA-16 在上皮性卵巢癌中存在差異表達(dá)。通過文獻(xiàn)挖掘發(fā)現(xiàn)在miR-15a 可通過抑制Bmi-1 表達(dá)水平，降低胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[6]。miRNA-15a/16 多次被報(bào)告在抑制腫瘤生長和調(diào)節(jié)化療藥物敏感性的不同癌癥中發(fā)揮作用[12-13]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在耐他莫昔芬的ER（+）乳腺癌細(xì)胞系中miRNA-15a、miRNA-16 為低表達(dá)，通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)可通過過表達(dá)E2F7 而下調(diào)miRNA-15a/16 而產(chǎn)生耐藥[14]。有研究表明miRNA-15a 和miRNA-16 在卵巢癌組織及卵巢癌OVSAHO 和CP20 細(xì)胞系中被發(fā)現(xiàn)為低表達(dá)，通過過表達(dá)miRNA-15a/16 水平，降低Bmi-1 蛋白水平，增加卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，提高卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性[15]。

本研究中結(jié)果也顯示，在卵巢癌CoC1/DDP細(xì)胞中 miRNA-15a 和 miRNA-16 低表達(dá)，miRNA-15a 和miRNA-16 模擬物可成功上調(diào)miRNA-15a 和miRNA-16 的表達(dá)，在過表達(dá)miRNA-15a 和miRNA-16 水平時(shí)，檢測出卵巢癌CoC1/DDP 細(xì)胞存活度降低，細(xì)胞凋亡率和DNA 損傷升高，提示細(xì)胞的增殖能力降低，從而增加卵巢癌耐藥細(xì)胞株對順鉑的敏感性。

已有研究表明，Bmi-1 蛋白在卵巢上皮性腫瘤中呈高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，是卵巢癌患者獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，并且細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)也顯示基因沉默Bmi-1 后，可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的生長[16-17]。有研究表明，卵巢癌SKOV3/DDP 中Bmi-1 明顯高于SKOV3 細(xì)胞，過表達(dá)miRNA-132 可降低SKOV3/DDP 細(xì)胞中Bmi-1 水平，細(xì)胞對順鉑的敏感性提高，降低細(xì)胞的侵襲和增殖能力[18]。也有研究比較HGSC 和mOC 細(xì)胞系中Bmi-1 的表達(dá)水平，其中在HGSC細(xì)胞系的Kuramochi 中Bmi-1 表達(dá)增加細(xì)胞對卡鉑產(chǎn)生耐藥反應(yīng)，Bmi-1 有可能作為一種潛在的治療靶點(diǎn)[19]。

在本研究中，卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株CoC1/DDP 中Bmi-1 蛋白高表達(dá)，而miRNA-15a和miRNA-16 模擬物轉(zhuǎn)染組CoC1/DDP 細(xì)胞的Bmi-1 蛋白水平顯著降低，而細(xì)胞凋亡率和DNA損傷升高，細(xì)胞存活度降低。在過表達(dá)的Bmi-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染miRNA-15a 和miRNA-16 組細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率和DNA 損傷、細(xì)胞存活度基本恢復(fù)到未轉(zhuǎn)染細(xì)胞水平。由此推測，Bmi-1 可能為miRNA-15a/16 的靶蛋白，高表達(dá)miRNA-15a/16 通過降低Bmi-1 蛋白的水平提高卵巢癌耐藥細(xì)胞株CoC1/DDP 對順鉑的敏感性，從而逆轉(zhuǎn)卵巢癌的耐藥性，為卵巢癌耐藥性患者提供新的治療理念。另外，該研究只是在細(xì)胞水平完成的實(shí)驗(yàn)，至于是否能將miRNA-15a 和miRNA-16 逆轉(zhuǎn)卵巢癌對順鉑的化學(xué)治療耐藥性在體內(nèi)高表達(dá)達(dá)到類似效果，還有待動物進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。綜上所述，高表達(dá)miRNA-15a 和miRNA-16 通過降低Bmi-1 可增加順鉑對卵巢癌細(xì)胞的敏感性，為克服卵巢癌鉑類耐藥提供新的靶點(diǎn)。