正中神經(jīng)電刺激對缺血性腦卒中大鼠突觸可塑性的影響

張成才 ，寧 蓉 ，陳 娜 ，彭藝晨 ，周 麗 ，楊晰宸 ，盧靜怡 ，張彭躍 ，李 蕊

（1）云南中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，云南 昆明 650500;2）昆明市第二人民醫(yī)院康復醫(yī)學科，云南 昆明 650032）

腦卒中是一種由于腦出血或腦梗塞導致神經(jīng)功能缺損的急性腦血管病，其中缺血性腦卒中約占總腦卒中的四分之三以上[1]。缺血性腦卒中發(fā)生后會觸發(fā)一系列的神經(jīng)功能障礙，包括炎癥反應、能量衰竭、興奮毒性以及神經(jīng)細胞的凋亡、自噬及壞死等[2]，是導致殘疾和死亡的主要原因，給患者、家庭、社會帶來了沉重的負擔。因此，找到促進腦卒中后神經(jīng)修復的方法至關重要。正中神經(jīng)電刺激（median nerve electrical stimulation，MNES）是一種具有廣泛應用前景的神經(jīng)調制技術[3]，正中神經(jīng)被認為是聯(lián)系中樞神經(jīng)系統(tǒng)的外周門戶，作用于正中神經(jīng)上的電刺激可沿著上行傳導通路誘發(fā)脊髓和大腦皮層的神經(jīng)可塑性，從而影響神經(jīng)網(wǎng)絡重塑和功能修復[4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，MNES 治療過程中腦雙側前額氧合血紅蛋白濃度升高，該部位神經(jīng)活動發(fā)生變化，最終改善腦卒中后患者的認知功能[5]，但其作用機制仍尚不明確，且在治療劑量、頻率、療程的選擇上仍缺少臨床指南，尚無確切最佳的電刺激治療處方規(guī)范。因此，本研究通過動物實驗探討正中神經(jīng)電刺激治療對腦卒中的作用機制，為臨床上正中神經(jīng)電刺激的優(yōu)化和推廣以及缺血性腦卒中的防治提供基礎實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

由湖南斯萊克實驗動物有限公司[SCXK（湘）2019-0004]提供的健康雄性SD 大鼠，體重（250±20）g，于云南中醫(yī)藥大學實驗動物中心[SYXK（滇）K2022-0004]適應性喂養(yǎng)，本研究通過昆明市第二人民醫(yī)院倫理委員會2021（06）號批準，所有實驗操作步驟都嚴格按照動物倫理和相關實驗動物的實驗要求規(guī)范執(zhí)行。將SD 大鼠隨機分成造模組和假手術組（Sham），在造模24 h 后對腦缺血大鼠進行神經(jīng)行為學評分，剔除死亡及不合格者，然后將造模成功的大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分成中動脈閉塞模型組（middle cerebral artery occlusion，MCAO）和正中神經(jīng)電刺激干預組（median nerve electrical stimulation，MNES），每組各6 只。

1.2 主要試劑耗材

異氟烷：瑞沃德生命科技有限公司（中國深圳）；線栓：西濃科技有限公司（中國北京）；抗體：艾博抗（Abcam）貿易有限公司（中國上海），BDNF：ab108319，TrkB：187041，synI：ab254349，PSD95：ab238315。

1.3 主要儀器

外周神經(jīng)電刺激儀（SY-708A，中國江蘇）；氣體麻醉機：眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司（中國北京）；轉棒疲勞儀：移數(shù)信息科技有限公司（中國上海）；高速冷凍離心機：Hettich 公司（德國）；電泳儀：BIO-RAD；全自動研磨儀：賽維爾生物科技有限公司（中國武漢）；化學發(fā)光成像系統(tǒng)：勤翔科學儀器有限公司（中國上海）；冷凍切片機：賽默飛世爾儀器有限公司（中國上海）。

1.4 實驗方法

1.4.1 缺血性腦卒中大鼠模型的建立采用線栓法建立大鼠左側大腦中動脈腦梗塞模型，假手術組動物除不插入和拔出線栓，其余各步驟均相同。缺血60 min 后取出線栓，縫合好傷口，置于30℃電熱毯上維持體溫，待大鼠蘇醒后，放回鼠籠內飼養(yǎng)。

1.4.2 干預方法造模成功后第3 天對 MCAO 大鼠進行損傷側前肢 MNES 干預。異氟烷氣體麻醉大鼠，使用外周神經(jīng)電刺激儀（SY-708A，中國，江蘇）在前肢距腕關節(jié)上5 mm 處兩肌腱之間，以45°傾斜角度插入一根毫針，插入深度為 1 mm，接入電極見圖1。刺激參數(shù)為：刺激參數(shù)為：0.6 mA，5 min；1 mA，10 min；1.5 mA，5 min；總刺激時間為 20 min，隔天干預，連續(xù) 7 次。干預結束后消毒并放入飼養(yǎng)籠中。MCAO 組在相同位置插入刺激針，但不予與電流，其余操作同干預組。Sham 組不作任何處理。

圖1 大鼠腦卒中后正中神經(jīng)電刺激示意圖Fig.1 Median nerve electrical stimulation after stroke in rats

1.5 檢測指標

1.5.1 HE 染色干預結束后取干預側和假手術組右側正中神經(jīng)，固定于4%多聚甲醛，OCT 包埋，冰凍切片（10 μm），用蘇木精-伊紅染色法進行染色，置于顯微鏡下觀察病理變化。

1.5.2 神經(jīng)功能缺損評分（neurological severity score，NSS）采用7 分制評分法測試動物整體神經(jīng)功能缺失狀況，用于評估神經(jīng)功能恢復情況，見表1。

表1 神經(jīng)功能缺損評分Tab.1 Neurological severity score

1.5.3 踏錯實驗（Foot-fault test）采用踏錯實驗評估大鼠的運動協(xié)調能力，用錄像機記錄大鼠損傷側前肢抓住橫梯的狀態(tài)，然后進行評分，見表2。

表2 踏錯實驗評分Tab.2 Foot-fault test scores

1.5.4 轉棒測試（Rota-rod test）轉棒實驗評估缺血性腦卒中大鼠患側運動功能以及運動耐力的恢復情況，將大鼠放置在運轉的轉棒上，共測試3 輪，每2 輪之間間隔5 min，將轉棒設置為10 s后勻速增加至10 r/min，持續(xù)5 min；記錄跑動時間，取3 輪的平均成績作為最終成績。

1.5.5 尼式染色干預結束后將大鼠用 3%戊巴比妥鈉麻醉后，取出完整大腦，用4%多聚甲醛進行固定后，蔗糖脫水，OCT 包埋，進行冰凍切片（10 μm），根據(jù)硫堇染色法染色步驟進行染色，光鏡下觀察缺血半影區(qū)神經(jīng)元的損傷修復情況。

1.5.6 Western blot在干預結束后1 h，使用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取出大腦，分離損傷側大腦皮層，立即于干冰中速凍后轉入-80℃冰箱保存至檢測。樣品收集完成后進行總蛋白提取、定量，然后依次進行80 V 電壓下 SDS-PAGE 凝膠電泳40 min 后換電壓為120 V 至溴酚藍即將跑出分離膠、電流300 mA 轉膜85 min、5%脫脂奶粉封閉2 h、一抗孵育（BDNF 1∶3 000、TrkB 1∶1 000、synI 1∶3 000、PSD95 1∶3 000）4℃冰箱過夜、二抗孵育（goat anti-rabbit IgG 1∶5 000）1 h 后進行顯影和結果分析。

1.5.7 透射電鏡大鼠深度麻醉后處死，取右側半球額頂區(qū)皮質（缺血周邊區(qū)），大小約1 mm×1 mm×2 mm，經(jīng)2.5%戊二醛、1%鋨酸固定，用酒精和丙酮脫水，用環(huán)氧樹脂包埋后，進行半薄切片定位，超薄切片（60 nm），以醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色后，置透射電鏡下觀察目標區(qū)域軸突結構、突觸連接狀況及突觸數(shù)量變化。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 9 進行統(tǒng)計分析并作圖，所有實驗數(shù)據(jù)均采用“均數(shù)±標準誤”（Mean±SEM）表示，2 組間比較使用單因素方差分析（oneway ANOVA）后進行事后多重比較（Followup tests），P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 正中神經(jīng)電刺激對腦卒中大鼠的正中神經(jīng)未造成損傷

干預結束后，取干預組右側和假手術組右側正中神經(jīng)進行HE 染色，見圖2。與假手術相比，正中神經(jīng)電刺激干預后，對正中神經(jīng)并未造成損傷，其神經(jīng)被膜結構完整，無明顯炎性細胞浸潤。

圖2 正中神經(jīng)電刺激對腦卒中大鼠的正中神經(jīng)未造成損傷Fig.2 Median nerve electrical stimulation did not cause damage to the median nerve in rats after stroke

2.2 正中神經(jīng)電刺激改善缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)功能和患側前肢的運動協(xié)調能力

干預結束后通過神經(jīng)功能缺損評分、Footfault test、Rota-rod test 對大鼠的神經(jīng)功能、運動協(xié)調能力及運動耐力進行評估，見圖3。與Sham組相比，MCAO 組表現(xiàn)出嚴重的神經(jīng)功能缺損（P＜0.001）；與MCAO 組相比，MNES 組的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)明顯改善（P＜ 0.05）。與Sham 組相比，MCAO 組大鼠的運動協(xié)調功能明顯下降（P＜ 0.05）；與MCAO 組相比，MNES 組大鼠的運動協(xié)調能力明顯改善（P＜ 0.05）。Rota-rod test 的結果表明：與Sham 組MCAO 組大鼠的運動時間明顯減短（P＜0.05）；與MCAO 組相比，MNES 組大鼠的運動時間明顯增加（P＜ 0.05）。

圖3 正中神經(jīng)電刺激改善缺血性腦卒中大鼠受損的神經(jīng)功能和運動協(xié)調能力Fig.3 Median nerve electrical stimulation improves nerve function and motor coordination in ischemic stroke rats

2.3 正中神經(jīng)電刺激減輕缺血性腦卒中大鼠腦梗死體積

干預結束后，取各組腦組織進行冰凍切片尼式染色以評估腦缺血損傷情況，染色結果和梗死體積統(tǒng)計結果，見圖4。與Sham 組相比，MCAO組大鼠腦梗死明顯（P＜ 0.001），且尼式小體核固縮現(xiàn)象增多，染色較深；與MCAO 組相比，MNES組大鼠的梗死體積明顯減?。≒＜ 0.05），尼式小體核固縮現(xiàn)象減少，染色變淺。

圖4 正中神經(jīng)電刺激減輕缺血性腦卒中大鼠的腦梗死體積Fig.4 Median nerve electrical stimulation reduced volume of cerebral infarction in ischemic stroke rats

2.4 正中神經(jīng)電刺激上調缺血性腦卒中大鼠大腦皮層中與神經(jīng)可塑性相關蛋白的表達水平

Western blot 實驗檢測損傷側大腦皮層中與神經(jīng)可塑性相關蛋白：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)營養(yǎng)因子（BDNF）、絡氨酸激酶受體（TrkB）、突觸素相關蛋白I（synI）、突觸后致密蛋白（PSD95）的表達水平。與MCAO 組相比，MNES 組大鼠大腦皮層中BDNF、TrkB、synI、PSD95 的表達水平均明顯上調（P＜0.05），見圖5。

圖5 正中神經(jīng)電刺激上調缺血性腦卒中大鼠大腦皮層中與神經(jīng)可塑性相關蛋白的表達水平Fig.5 Median nerve electrical stimulation up-regulated the expression level of neuroplasticity-related proteins in cerebral cortex of ischemic stroke rats

2.5 正中神經(jīng)電刺激對缺血性腦卒中大鼠突觸可塑性的影響

通過電鏡觀察損傷側大腦皮層突觸結構的變化。與Sham 組相比，MCAO 組突觸數(shù)量變少（P＜0.05），密度變低，與MCAO 組相比，MNES 組突觸數(shù)量增多（P＜ 0.01），密度增高，見圖6。

圖6 正中神經(jīng)電刺激對缺血性腦卒中大鼠突觸可塑性的影響Fig.6 Effect of median nerve electrical stimulation on synaptic plasticity in ischemic stroke rats

3 討論

腦卒中是由于腦血管發(fā)生急性血流中斷或血管性病變引起的，盡管在腦卒中發(fā)作后的幾個小時內通過靜脈溶栓或機械取栓可及時恢復血流，但許多患者因錯過治療時間窗而導致嚴重的神經(jīng)功能障礙[6]。由于神經(jīng)系統(tǒng)具有可塑性，大腦有能力在殘留的神經(jīng)元之間重組新的連接，以補償或修復受損的神經(jīng)元[7]。研究發(fā)現(xiàn)，在腦卒中后3 個月內對患者及時進行康復訓練可顯著增強神經(jīng)系統(tǒng)可塑性并促進神經(jīng)功能修復[8]。本研究在大鼠腦缺血再灌注損傷后第3 天開始進行正中神經(jīng)電刺激治療，治療后腦卒中大鼠受損的神經(jīng)功能及運動功能顯著改善，由此可見，在早期制定有效的康復方案以促進神經(jīng)系統(tǒng)可塑性對腦卒中患者的功能修復具有重要意義。同時，筆者發(fā)現(xiàn)在治療7 次后即大鼠腦缺血損傷后第17 天，MCAO 組損傷側皮層中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達量與Sham 組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），這也提示，在缺血損傷后，神經(jīng)系統(tǒng)具有自我修復能力。

突觸是神經(jīng)細胞間進行電信號和化學信號傳遞的關鍵部位，是學習、記憶等高級神經(jīng)功能的生物學基礎。當神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后，突觸會在結構和功能上發(fā)生變化，從而維持神經(jīng)功能的相對穩(wěn)定，這些變化也被稱為突觸可塑性[9]。研究發(fā)現(xiàn)，百會穴和神庭穴電針可通過調節(jié)海馬CA1區(qū)突觸-樹突可塑性，來改善缺血性腦卒中大鼠的認知障礙，并控制樹突棘的數(shù)量、大小和形狀[10]。突觸可塑性相關蛋白的表達異常與腦卒中后神經(jīng)功能的修復密切相關，在分子水平研究突觸可塑性的改變，對深入了解腦卒中的發(fā)病機制以及探尋有效治療腦卒中的關鍵靶點具有重要意義。在興奮性突觸的成熟和突觸接觸的穩(wěn)定過程中，突觸素相關蛋白I（SynI）和突觸后致密蛋白（PSD95）發(fā)揮了關鍵作用，它們被認為是突觸可塑性的重要指標[11]。在本研究中，SynI 和PSD95的表達在給予腦卒中大鼠正中神經(jīng)電刺激治療后顯著上調，同時半影區(qū)的突觸數(shù)量增多，提示缺血性腦卒中后正中神經(jīng)電刺激促進了部分神經(jīng)網(wǎng)絡的重新連接。

正中神經(jīng)電刺激是一種在周圍神經(jīng)系統(tǒng)施加電流的物理因子治療技術，具安全性高、簡便易操作、經(jīng)濟易推廣等的優(yōu)點，已廣泛應用于臨床上顱腦外傷昏迷促醒、腦卒中認知功能改善、帕金森病治療等[12]。眾所周知，手部特別是大拇指在大腦皮層運動代表區(qū)的面積遠大于軀體其他部位，而支配大拇指的神經(jīng)就是正中神經(jīng)，正中神經(jīng)也被認為是與中樞神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系的外周門戶[13]，因此對正中神經(jīng)進行電刺激，可以在大腦皮層引發(fā)廣泛的神經(jīng)反應，進一步產(chǎn)生明顯的治療效果。正中神經(jīng)電刺激在治療腦卒中上展現(xiàn)出巨大潛力，臨床研究發(fā)現(xiàn)，對腦卒中后認知功能障礙患者進行正中神經(jīng)電刺激治療后，患者的神經(jīng)功能和認知功能顯著改善，患者的生活質量顯著提高[14]。另有學者將正中神經(jīng)電刺激與中醫(yī)理論結合起來，從解剖位置上看，內關穴在正中神經(jīng)的走形上，Lee 等[15]將內關穴作為插入針灸針進行正中神經(jīng)電刺激標準位置，建立了內關穴正中神經(jīng)電刺激的動物模型，并發(fā)現(xiàn)其治療神經(jīng)性疼痛方面的效果強于單獨內關穴刺激組和通過內關穴并未刺激正中神經(jīng)組。本課題組前期臨床研究也發(fā)現(xiàn)，在B 超引導下直接對正中神經(jīng)進行電刺激是安全有效的，可促進腦卒中患者上肢運動功能的恢復，同時檢測到患者血清中的 BDNF 表達上調[16]，但其作用機制仍不清楚，且在治療劑量、頻率、療程的選擇上仍有待探索。

綜上所述，本研究通過大腦中動脈閉塞動物模型證明了正中神經(jīng)電刺激是改善腦卒中后受損神經(jīng)功能安全有效的治療措施，其作用機制與促進突觸可塑性有關。但本實驗主要從動物行為學檢測及腦組織形態(tài)學檢測進行驗證，后續(xù)仍需深入探究正中神經(jīng)電刺激促進缺血性腦卒中大鼠突觸可塑性的相關分子機制，以期為臨床上正中神經(jīng)電刺激改善腦卒中患者功能障礙及正中神經(jīng)電刺激的應用推廣提供理論依據(jù)。