鹽脅迫和外源物對人工合成小麥發(fā)芽及生長生理影響

胡 文，萬洪深，何 娟，李 俊，楊武云，肖 春，雷建容，楊 晶，楊玉敏，3*

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，成都 610066；2.四川省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，成都 610066；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南地區(qū)小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，成都 610066）

土壤鹽堿化是土壤中積聚鹽分形成鹽堿土的過程，主要危害是造成土地退化、農(nóng)作物減產(chǎn)或絕收，影響植被生長并間接造成生態(tài)環(huán)境惡化[1]。目前，中國的土壤鹽堿化非常嚴重，據(jù)第2次全國土壤普查資料顯示，中國鹽堿土面積為3 455.3萬hm2，其中耕地面積為569.4 萬hm2，占到總耕地面積的16.5%[2]，嚴重威脅農(nóng)作物正常生長和產(chǎn)量。小麥作為我國最重要的口糧，是三大主要糧食作物之一，鹽堿化抑制了小麥的生長發(fā)育，降低了小麥的繁殖能力和產(chǎn)量，甚至絕產(chǎn)[3]。同時，鹽脅迫會阻礙小麥對于水分的吸收，降低養(yǎng)分吸收。因此，了解耐鹽遺傳機理是高鹽環(huán)境下提高小麥生產(chǎn)力的基礎(chǔ)。

近年來，國內(nèi)外耐鹽研究聚焦于篩選耐鹽材料及其相關(guān)機理研究。篩選耐鹽材料首先要解決耐鹽指標選擇的問題。小麥常用耐鹽參數(shù)有生長和生理生化指標。生長指標主要有種子發(fā)芽率、幼苗存活率、根長、苗高、苗重、分蘗數(shù)和籽粒產(chǎn)量等。萌發(fā)期耐鹽參數(shù)主要有種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)；苗期耐鹽主要比較幼苗存活率、生長量（苗長、根長和苗重）。耐鹽評價有時以田間全生育期的鑒定結(jié)果為依據(jù)，一般比較鹽脅迫條件下種子發(fā)芽率、苗期成活率、株高、生長量以及籽粒產(chǎn)量等指標[4]。愈傷組織生長或小麥胚芽鞘長度可作為耐鹽篩選的有用指標。耐鹽常用的生理生化指標主要有植株地上部分的K+/Na+比、葉綠素含量、葉片細胞膜透性、質(zhì)膜和液泡膜H+-ATPase 活性、SOD 酶活性、多胺含量、葉片游離脯氨酸含量、羥脯氨酸、糖蛋白中糖分含量、葉和根中甘氨酸甜菜堿含量、氣孔導(dǎo)度、根質(zhì)膜活性、液泡膜和液泡Na+/H+變化、K+通量測量等。

人工合成小麥遺傳變異豐富，具有豐富的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病和抗逆基因，對豐富小麥遺傳變異和利用其優(yōu)異基因具有重要意義。為利用兩長勢差異明顯的人工合成小麥S79 和S80，本研究評價了這2 份材料6 個不同鹽濃度和3 種外源物處理下種子萌發(fā)、苗期生長和苗期的生理生化響應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

材料S79 和S80，由相同硬粒小麥DOY1（2n=28，AABB）與不同節(jié)節(jié)麥（2n=14，DD）雜交產(chǎn)生。S79 系譜為DOY1/AT333，S80 的為DOY1/AT428，這兩份材料AB 基因組均來自相同供體DOY1，D基因組分別來自不同節(jié)節(jié)麥AT333 和AT428。材料S79和S80具有相同AB基因組和不同D基因組。

1.2 試驗設(shè)計

選籽粒飽滿、大小一致的種子，經(jīng)2.5%次氯酸消毒15 min，蒸餾水沖洗干凈。（26±1） ℃黑暗條件下設(shè)置3 種浸種處理，分別為：①蒸餾水；②0.5%H2O2；③50 mmol/L GA3，浸種20 h催芽。催芽后，選出露白一致的種子，置于鋪好濾紙的發(fā)芽盒內(nèi)，設(shè)置濃度為0、0.15%、0.30%、0.45%、0.60%和0.75%的6個NaCl溶液濃度，每個鹽濃度3次重復(fù)，每重復(fù)100粒種子，放在溫度為（26±1） ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。幼苗長至2 葉1 心時，選擇長勢一致的幼苗測生長指標、生理生化指標，計算鹽害指數(shù)。

1.3 測定指標與方法

①生長指標：培養(yǎng)3 d測胚芽鞘長度和發(fā)芽勢。培養(yǎng)6 天調(diào)查發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，以芽長等于種子長度的一半，根長等于種子長度為發(fā)芽標準，調(diào)查發(fā)芽數(shù)；培養(yǎng)8 d 調(diào)查發(fā)芽率，調(diào)查根長、根數(shù)、根重、苗高、苗重以及生長速率。②生理生化指標：脯氨酸含量、質(zhì)膜相對透性、α-淀粉酶活性、可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和膜脂過氧化酶（SOD、MDA、CAT、POD）。③調(diào)查鹽害：根據(jù)公式計算鹽/堿害指數(shù)/%=(對照發(fā)芽率-脅迫下發(fā)芽率)/對照發(fā)芽率×100。指標檢測參照王康君等[5]的實驗方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 進行整理，采用SPSS 24.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同浸種和不同鹽濃度處理對小麥萌芽的影響

發(fā)芽勢決定出苗的整齊度，反映種子生命力強弱。由圖1 數(shù)據(jù)可看出人工合成小麥S79 和S80 發(fā)芽勢隨著鹽濃度的提高發(fā)芽勢整體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，當NaCl 處理濃度為0.60%時S79 和S80 發(fā)芽勢均會出現(xiàn)一次增加，再次提升鹽濃度后降低。加入外源物質(zhì)H2O2和GA3后，6 個鹽處理濃度下均提高了發(fā)芽勢，與對照（NaCl濃度為0），鹽濃度處理下外源物質(zhì)H2O2和GA3提升發(fā)芽勢的效果更明顯。S79 和S80 發(fā)芽勢差異顯著，不同處理以及不同鹽濃度下S80 的發(fā)芽勢均顯著高于S79，由此可知，親本S80在鹽濃度下的發(fā)芽整齊度優(yōu)于S79。

圖1 不同浸種處理在不同鹽濃度下人工合成小麥的發(fā)芽Figure 1 Effects of different leaching treatments on the germination of synthetic wheat at different salt concentration

鹽濃度影響人工合成小麥的發(fā)芽率。隨鹽濃度的提高，兩人工合成小麥的發(fā)芽率先增后減。當鹽處理濃度為0.15%，發(fā)芽率達到頂峰；鹽處理濃度超過0.15%后開始下降。由此可看出，種子在萌發(fā)的過程中也需要Na+，但過量的Na+又會打亂其生理代謝，降低發(fā)芽率。由圖1 也可看出人工合成小麥S80 在蒸餾水、H2O2和GA33 種處理的6 個鹽濃度下發(fā)芽率都顯著優(yōu)于S79。

鹽濃度越高對兩個人工合成小麥萌芽產(chǎn)生的危害越嚴重，見表1。使用外源物質(zhì)H2O2和GA3可顯著緩解鹽對種子萌發(fā)及幼苗期的毒害。計算兩種外源物質(zhì)和兩個親本材料鹽害指數(shù)降低程度發(fā)現(xiàn)，添加外源物質(zhì)H2O2時S79和S80鹽害指數(shù)降低程度相近，S79在添加H2O2時鹽害指數(shù)降低程度優(yōu)于GA3，添加外源物質(zhì)GA3時S80 鹽害指數(shù)降低程度比S79 更明顯，由此可知，S79材料適合使用H2O2外源物質(zhì)緩解鹽害，S80材料適合使用GA3外源物質(zhì)緩解鹽害。

表1 不同浸種處理在不同鹽濃度下人工合成小麥的鹽害指數(shù)Table 1 Effects of different leaching treatments on the salt injury index of synthetic wheat at different salt content %

2.2 不同浸種和不同鹽濃度處理對小麥幼苗生長的影響

由圖2 可看出，鹽脅迫會影響人工合成小麥S79 和S80 幼苗期生長。與對照（NaCl 濃度為0）比較，在5個水平的鹽濃度下人工合成小麥S79和S80幼苗的根長、根數(shù)、根鮮重、苗高和苗鮮重都隨鹽濃度的增加而降低，生長速率也逐漸降低。尤其是鹽濃度增加到0.30%以后，生長嚴重受影響，除根數(shù)以外，根長、根鮮重、苗高和苗鮮重明顯下降。

圖2 不同浸種處理在不同鹽濃度下人工合成小麥幼苗的生長Figure 2 The growth of wheat seedlings artificially synthesized under different salt concentrations

其次，添加外源物質(zhì)H2O2和GA3后，6個鹽處理濃度下S79和S80兩份小麥材料的根長、根數(shù)、苗高以及單株根重和苗重均有所提高。與蒸餾水處理相比較，H2O2處理下兩種試驗小麥的根長、單株根數(shù)、單株根重、苗高、單株苗重和生長速率分別提高了5.22%、4.57%、5.31%、5.05%、17.32%和17.51%（6個鹽濃度下的平均值）；GA3處理下兩種試驗小麥的根長、單株根數(shù)、單株根重、苗高、單株苗重和生長速率分別提高了12.82%、9.45%、17.84%、7.06%、36.73%和36.73%。由此可看出，H2O2和GA3均可減緩鹽脅迫對小麥生長的影響，GA3的效果明顯強于H2O2，可作為緩解鹽脅迫對人工合成小麥萌發(fā)和幼苗生長毒害的物質(zhì)之一。

另外，根據(jù)圖2 也可看出，S79 和S80 兩份小麥材料在不同鹽濃度下，其幼苗生長的響應(yīng)差異較大，在蒸餾水、H2O2和GA33 個處理以及6 個鹽濃度下，S80小麥的所有生長指標均顯著高于S79。其中以根鮮重、苗鮮重和生長速率表現(xiàn)最明顯，蒸餾水處理下S80 根鮮重、苗鮮重和生長速率平均比S79高34.89%、20.11%和20.11%（6 個鹽濃度下的平均值），H2O2處理下S80 根鮮重、苗鮮重和生長速率平均比S79 高30.03%、20.70%和20.70%，GA3處理下S80 根鮮重、苗鮮重和生長速率平均比S79 高33.34%、20.03%和20.03%。由此可以看出，S80 在不同鹽濃度處理下幼苗的生長優(yōu)于S79，S80的耐鹽性顯著優(yōu)于S79。

2.3 不同浸種和不同鹽濃度處理對小麥幼苗生理生化指標的影響

鹽脅迫主要是通過破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能來影響作物生長[6]，由圖3 可看出，鹽脅迫導(dǎo)致了人工合成小麥S79 和S80 的質(zhì)膜相對透性提高，且隨著鹽濃度的增加，質(zhì)膜相對透性呈顯著提高趨勢，說明此時S79和S80小麥已經(jīng)遭受了鹽害。植物在逆境環(huán)境下會積累脯氨酸來應(yīng)對不良環(huán)境造成的危害，數(shù)據(jù)顯示，鹽脅迫下人工合成小麥幼苗體內(nèi)分泌的脯氨酸增加，且隨著鹽濃度的提高，脯氨酸含量呈上升的趨勢。在蒸餾水處理以及鹽濃度為0時，S80 體內(nèi)脯氨酸含量略低于S79體內(nèi)的含量，當進行鹽處理或添加外源物質(zhì)時，S80 體內(nèi)脯氨酸含量超過了S79 體內(nèi)的含量，說明S80 對外界環(huán)境變化的響應(yīng)度更高，在受到鹽害時會分泌更多的脯氨酸來保護生長，具有更強的耐鹽性。

圖3 不同浸種處理在不同鹽濃度下人工合成小麥幼苗的生理生化指標Figure 3 Physiological and biochemical indicators of artificially synthesized wheat seedlings at different salt concentrations

鹽脅迫也影響了小麥體內(nèi)ɑ-淀粉酶、可溶性糖以及可溶性蛋白的含量，由圖3也可看出，隨著鹽濃度的提高，S79 和S80 小麥幼苗體內(nèi)ɑ-淀粉酶活性和可溶性蛋白逐漸降低，可溶性糖逐漸升高。添加外源物質(zhì)H2O2和GA3后，S79 和S80 幼苗體內(nèi)ɑ-淀粉酶、可溶性蛋白含量有所增加，可溶性糖含量有所減少，且與蒸餾水處理相比，GA3處理后小麥幼苗體內(nèi)ɑ-淀粉酶、可溶性蛋白平均含量分別增加了16.05%、11.26%（6個鹽濃度下的平均值），可溶性糖平均含量降低了7.74%，均高于H2O2，可見添加GA3的效果更加顯著。另外，在3種處理下，當鹽濃度較低時（0～0.3%）S79和S80小麥幼苗體內(nèi)ɑ-淀粉酶、可溶性糖以及可溶性蛋白的含量差異不明顯，甚至出現(xiàn)S79高于S80；當鹽濃度較高時（≥0.45%），S80小麥幼苗體內(nèi)ɑ-淀粉酶、可溶性糖以及可溶性蛋白的含量顯著高于S79，可見S80小麥耐鹽性優(yōu)于S79。

膜質(zhì)過氧化酶（SOD、POD、CAT、MDA）活性的高低與植物抗逆能力有關(guān)。通過圖3 可以看出，隨著鹽處理濃度的提高，導(dǎo)致S79 和S80 幼苗體內(nèi)SOD、POD 和CAT 活性逐漸降低，MDA 含量逐漸增高。使用外源物質(zhì)GA3處理后小麥幼苗體內(nèi)SOD、POD、CAT 平均活性分別為42.43、32.57 和32.19 U/g，高于蒸餾水處理的36.62、28.30 和28.73 U/g 以及H2O2處理的40.19、31.26 和30.69 U/g；MDA 含量為9.19 μmol/g，低于蒸餾水處理的10.36 μmol/g 以及H2O2處理的9.57 μmol/g。由此可見外源物質(zhì)GA3緩解鹽脅迫對小麥幼苗體內(nèi)膜質(zhì)過氧化酶影響的效果優(yōu)于H2O2。通過對比S79和S80品種間的差異發(fā)現(xiàn)，S80 小麥幼苗體內(nèi)的SOD、POD、CAT 活性以及MDA含量均要高于S79。

3 討論與結(jié)論

鹽脅迫會產(chǎn)生離子過量、離子虧缺和滲透脅迫[7]，因此會造成離子平衡失調(diào)或離子毒害、體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除發(fā)生代謝紊亂，造成細胞氧化損傷以及膜系統(tǒng)傷害，葉綠素和光合作用下降，進而抑制作物的正常發(fā)育，導(dǎo)致產(chǎn)量、品質(zhì)下降[8]。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度的鹽（0.15%）會促進人工合成小麥種子的萌芽，高濃度鹽（>0.15%）會抑制小麥種子萌芽，與前人研究結(jié)果一致[9-10]。同時，鹽處理下，人工合成小麥幼苗體內(nèi)的SOD、POD、CAT抗氧化酶活性顯著降低，MDA 含量顯著增加，導(dǎo)致幼苗生長受到顯著影響，根長、根鮮重、苗高和苗鮮重明顯下降，形成鹽害，最終造成產(chǎn)量減少。植物在鹽脅迫環(huán)境下，會激發(fā)自我保護機制來保證自身的生長發(fā)育，為了應(yīng)對鹽脅迫，植物會激活滲透作用、光合作用、離子吸收、激素分布等生理生化機制，以減輕高濃度鹽帶來的危害[11-14]。而不同植物或者同一植物不同品種間適應(yīng)鹽堿環(huán)境的能力也存在較大差異[15]，存在基因型差異。本次研究中，通過對比人工合成小麥S79和S80發(fā)現(xiàn)，S80小麥在鹽脅迫下種子萌芽、幼苗生長以及生理代謝都要優(yōu)于S79，由此說明S80 人工合成小麥緩解鹽害的能力更強，適合進一步作為小麥耐鹽遺傳改良或精細定位基礎(chǔ)材料，解析耐鹽材料的遺傳差異。

在鹽脅迫環(huán)境下，外源物質(zhì)可以通過調(diào)控植物生理生化、活性氧、代謝酶等來保持離子平衡、增強光合作用、滲透調(diào)節(jié)作用及抗氧化酶活性改善種子萌芽和幼苗生長[16]。試驗結(jié)果表明，H2O2和GA3兩種外源物質(zhì)均在不同程度緩解了鹽脅迫對小麥種子萌芽和幼苗生長的影響，有效降低了小麥MDA含量及鹽害指數(shù)，增加了幼苗抗氧化酶活性以及生長速率，結(jié)果一致。對比兩種外源物質(zhì)效果發(fā)現(xiàn)，GA3的效果更優(yōu)，緩解人工合成小麥鹽害的能力更好。

4 結(jié)論

鹽脅迫會顯著降低人工合成小麥S79和S80的幼苗期的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、根長、根重、苗高和苗重，增加脯氨酸含量、質(zhì)膜相對透性、可溶性糖和MDA含量，降低了ɑ-淀粉酶活性、可溶蛋白質(zhì)含量以及SOD、POD和CAT活性。鹽脅迫下，使用H2O2和GA3可有效地緩解鹽脅迫對人工合成小麥在萌發(fā)期和幼苗期導(dǎo)致的生長和生理危害，GA3的效果更優(yōu)。人工合成小麥S79和S80在耐鹽性的表現(xiàn)存在顯著差異，S80小麥具有更強的耐鹽能力。