生防細(xì)菌HK11-9 對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防病能力及其鑒定

張林林 沈虎生 楊冰 何夢(mèng)菡 樸鳳植 申順善

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，鄭州 450002；2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，鄭州 450002）

黃瓜棒孢葉斑病又名黃瓜靶斑病，是由多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）引起的一種世界性病害，該病原菌寄主范圍廣，危害黃瓜（Cucumis sativusL.）、番茄（Solanum lycopersicum）和茄子（Solanum melongenaL.）等上百種蔬菜，在黃瓜上發(fā)病尤為嚴(yán)重，主要侵染寄主植物的葉片，形成大小不等的近圓形病斑，也可侵染根、莖、花和果實(shí)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起落葉、落果，直至整株死亡，導(dǎo)致絕產(chǎn)［1］。目前，黃瓜棒孢葉斑病的防治以化學(xué)防治為主，常用殺菌劑有吡唑萘菌胺（isopyrazam）、氟氯醚菌唑（mefentrifluconazole）、嘧菌酯（azoxystrobin）、咪唑菌酮（fenamidone）、氟啶胺（fluazinam）等［2-4］，但是化學(xué)藥劑大量使用會(huì)使植物產(chǎn)生抗藥性，引起環(huán)境污染和人畜中毒等問題，尋求綠色安全的防治手段備受關(guān)注，而生物防治是減少和替代化學(xué)農(nóng)藥的最有效方式之一［5］。

利用生防微生物防治植物病害在多種病害的防治上取得了良好的效果，目前已有利用生防微生物防治棒孢葉斑病的研究報(bào)道，如李新宇等［6］從30份根際土壤樣品中分離篩選出10 株對(duì)黃瓜棒孢葉斑病菌平板抑制率大的菌株，其中解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZF57 抑制效果最佳，對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防效達(dá)到60%左右。趙昱榕等［7］篩選的貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）ZF2 具有廣譜的拮抗作用，其對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果能達(dá)到90.81%。張曉云等［8］分離的貝萊斯芽孢桿菌HMB28521 對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果達(dá)80.5%，李翠霞［9］從20 株植物促生根際細(xì)菌中篩選出的CZGJXJ?2 菌株對(duì)多主棒孢菌的抑菌率達(dá)到70.51%，對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防效達(dá)到 46.80%。另外，也有報(bào)道枯草芽孢桿菌（B. subtilis）NBF809、死亡谷芽孢桿菌（B. vallismortis）NBIF?001 和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）YC2140 對(duì)多主棒孢霉具有抑菌活性，能夠防治番茄和煙草棒孢葉斑?。?0-12］。但是，目前在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的防治黃瓜棒孢葉斑病的微生物制劑較為欠缺，因此，需要繼續(xù)篩選優(yōu)良生防菌，創(chuàng)制高效穩(wěn)定的微生物制劑。

本研究在河南信陽雞公山采集的金雞菊（Coreopsis drummondiiTorr. et Gray）植物根際篩選獲得黃瓜棒孢葉斑病生防細(xì)菌HK11?9，研究該菌株對(duì)多主棒孢霉的抑菌活性，評(píng)價(jià)其對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果，研究其在黃瓜葉部的定殖能力及對(duì)黃瓜葉部防御酶活性的影響等，探討其生防潛力，為黃瓜棒孢葉斑病的生物防治提供具有潛力的優(yōu)良生防資源。

1 材料與方法

1.1 材料

生防細(xì)菌 HK11?9 為從河南信陽雞公山采集的金雞菊根際土壤分離篩選獲得，采用逐步提高誘導(dǎo)濃度的方法獲得穩(wěn)定抗利福平（100 μL/mL）的菌株，并保存在?80℃超低溫冰箱。黃瓜棒孢葉斑病菌多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害生物防治研究室分離鑒定并保存。供試黃瓜品種為‘寒育6 號(hào)’（河南豫藝種業(yè)科技發(fā)展有限公司）。供試化學(xué)藥劑為35%氟菌·戊唑醇懸浮劑（拜爾股份公司）。供試培養(yǎng)基為TSA 培養(yǎng)基（Tryptic Soy Broth 30 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL）、PDA 培養(yǎng)基（土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL）和PDK 培養(yǎng)基（Potato Dextrose Broth 20 g，蛋白胨10 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL）。

1.2 方法

1.2.1 HK11?9 對(duì)多主棒孢霉菌的抑制活性測(cè)定HK11?9 對(duì)多主棒孢霉菌絲生長(zhǎng)的抑制活性測(cè)定采用平板對(duì)峙法。將多主棒孢霉菌餅放在PDK 培養(yǎng)基平板中央，在距離菌餅25 mm 處接種HK11?9，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d 后調(diào)查抑菌帶大小。HK11?9對(duì)多主棒孢霉孢子萌發(fā)的抑制活性測(cè)定采用懸滴法。取等量的HK11?9 菌懸液（108CFU/mL）和多主棒孢霉分生孢子懸浮液混合均勻，取50 μL 滴到凹玻片上，置28℃恒溫培養(yǎng)箱里保濕培養(yǎng)，每隔2 h 在顯微鏡下觀察分生孢子萌發(fā)情況，每次共觀察3 個(gè)視野，每個(gè)視野大概100 個(gè)分生孢子，以無菌水和多主棒孢霉分生孢子懸浮液混合作對(duì)照。

孢子萌發(fā)率/%= 萌發(fā)孢子數(shù)/調(diào)查孢子總數(shù)×100%

孢子萌發(fā)抑制效果/%=（對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率）/對(duì)照萌發(fā)率×100%

1.2.2 HK11?9 對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果測(cè)定

1.2.2.1 HK11?9 的菌懸液、發(fā)酵液和上清液的配制 將HK11?9 單菌落接種于5 mL 滅菌TSB 培養(yǎng)液中恒溫振蕩培養(yǎng)（28℃、160 r/min）16 h，然后以0.5%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL TSB 培養(yǎng)液中恒溫?fù)u床培養(yǎng)（28℃、160 r/min）56 h，得到HK11?9 的發(fā)酵液。將發(fā)酵液離心（5 000 r/min、10 min）后用0.22μL 細(xì)菌過濾器過濾得到上清液，將離心后沉淀的菌體用無菌水配制獲得濃度為108CFU/mL 的菌懸液。

1.2.2.2 多主棒孢霉孢子懸浮液的配制 將多主棒孢霉菌在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d 后，加入無菌水刮取孢子，用滅菌紗布過濾，用無菌水稀釋配制1×106孢子/mL 的孢子懸浮液。

1.2.2.3 HK11?9 對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果測(cè)定 采用離體接種和活體接種方法。將2 片真葉的黃瓜苗移栽至花盆（直徑9 cm），用HK11?9 菌懸液（108CFU/mL）進(jìn)行葉面噴霧處理，表面晾干后針刺接種5 μL 黃瓜棒孢葉斑病菌孢子懸浮液（106孢子/mL）。以化學(xué)藥劑和清水作對(duì)照，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 株。離體接種方法：將處理過的黃瓜葉片取下來，針刺接種黃瓜棒孢葉斑病菌，然后置于25℃恒溫箱保濕培養(yǎng)，5 d 后調(diào)查棒孢葉斑病發(fā)病程度。活體接種方法：處理過的黃瓜葉部針刺接種黃瓜棒孢葉斑病菌，然后置于25-28℃育苗室培育，7 d 后調(diào)查棒孢葉斑病發(fā)病程度。另外，設(shè)HK11?9 菌懸液、發(fā)酵液、上清液處理，以清水作對(duì)照，了解HK11?9 不同發(fā)酵組分對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果，黃瓜棒孢葉斑病菌的接種采用活體接種方法，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 株。黃瓜棒孢葉斑病發(fā)病程度調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)病斑直徑，參考翁祖信等［13］方法并略作修改，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)，無癥狀；1 級(jí)，接種點(diǎn)出現(xiàn)輕微病斑，病斑直徑為小于0.2 cm；2 級(jí)，病斑直徑為0.21-0.5 cm；3 級(jí)，接種點(diǎn)黃化明顯，病斑直徑為0.51-0.8 cm；4 級(jí)，病斑直徑為大于0.81 cm 以上。

病情指數(shù)= Σ（各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)代表值）×100

防治效果/%=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%

1.2.3 HK11?9 在黃瓜葉部定殖量測(cè)定 選取大小均一的黃瓜苗移栽至花盆，在葉面均勻噴灑HK11?9（108CFU/mL）菌懸液，晾干后置于25-28℃育苗室培育，培育第1、7、14 和21 天時(shí)取黃瓜葉片去掉葉脈，取1 g 葉肉研磨后用無菌水稀釋一定濃度涂抹在加利福平（100 μg/mL）的TSA 培養(yǎng)基平板，置于28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，待形成菌落，計(jì)算菌落數(shù)并換算其在黃瓜葉片的定殖密度。設(shè)3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 株，每個(gè)處理每次取3 個(gè)葉片。

1.2.4 黃瓜葉部防御相關(guān)酶活性的測(cè)定 選取大小均一的黃瓜苗移栽至花盆，然后在葉面均勻噴灑HK11?9（108CFU/mL）菌懸液，晾干后葉面噴灑接種黃瓜棒孢葉斑病菌孢子懸浮液（106孢子/mL），置于25-28℃育苗室培育，培育第1、3、5 和7 天時(shí)選取第二片真葉，測(cè)苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）活性［14］。以清水處理作對(duì)照，試驗(yàn)設(shè)HK11?9 菌懸液處理（HK11?9）、接種黃瓜棒孢葉斑病菌（Cc）、HK11?9菌懸液處理后接種黃瓜棒孢葉斑病菌（HK11?9+Cc）和清水處理（CK）共4 個(gè)處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 株。

1.2.5 HK11?9 的鑒定 HK11?9 的形態(tài)特征及生理生化特性主要參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，按照常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法進(jìn)行鑒定［15］。HK11?9 的分子鑒定為分析16S rRNA 序列同源性。將HK11?9 在TSA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，利用試劑盒（北京華越洋生物科技有限公司）提取RNA，采用通用引物27f（5'?AGAGTTTGATCMTGGCTCAG?3'） 和1492 r（5'?TACGGHTACCTTACGACTT?3'）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增采用50 μL 反應(yīng)體系（RNA 1 μL, Primer 27f/1492r（20 pmol）各1 μL，Mix 25 μL，ddH2O 22 μL），PCR 反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸2 min，35 個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。將PCR 產(chǎn)物送生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用NCBI BLAST 進(jìn)行序列分析，并利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 HK11?9 的抑菌譜和生物學(xué)功能測(cè)定 采用平板對(duì)峙法測(cè)定HK11?9 的抑菌譜，采用透明圈法［16］測(cè)定HK11?9 的淀粉分解、纖維素分解、蛋白分解和產(chǎn)嗜鐵素能力。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2016 和DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以最小顯著差法（LSD）進(jìn)行顯著性差異（P<0.05）分析。

2 結(jié)果

2.1 HK11?9對(duì)多主棒孢霉的抑菌活性

HK11?9 對(duì)多主棒孢霉菌的菌絲具有抑制活性，在PDK 培養(yǎng)基上形成明顯的抑菌帶，其抑菌帶大小為0.74 cm（圖1）。同時(shí)，HK11?9 對(duì)多主棒孢霉孢子萌發(fā)具有顯著的抑制效果，在無菌水中培養(yǎng)2 h時(shí)分生孢子已經(jīng)開始萌發(fā)，其萌發(fā)率為21.30%，培養(yǎng)6 h 時(shí)萌發(fā)率達(dá)到100%，而HK11?9 處理的分生孢子培養(yǎng)8 h 都沒有萌發(fā)，HK11?9 對(duì)多主棒孢霉分生孢子萌發(fā)的抑制效果達(dá)到100%（圖2）。試驗(yàn)結(jié)果說明，HK11?9 菌株對(duì)多主棒孢霉的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均具有顯著的抑制效果。

圖1 HK11-9 對(duì)多主棒孢霉菌絲生長(zhǎng)的抑制效果Fig. 1 Inhibition effect of HK11-9 against the mycelium growth of Corynespora cassiicola

圖2 HK11-9 對(duì)多主棒孢霉分生孢子萌發(fā)的抑制效果Fig. 2 Inhibition effect of HK11-9 against the conidia germination of Corynespora cassiicola

2.2 HK11?9對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果

HK11?9 處理對(duì)黃瓜棒孢葉斑具有顯著的防治效果。在離體接種和活體接種條件下，HK11?9 處理對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果分別達(dá)到62.80%和67.73%，與化學(xué)藥劑處理的防治效果沒有差異（表1，圖3）。另外，HK11?9 的菌懸液和發(fā)酵液對(duì)黃瓜棒孢葉斑病具有明顯的防治效果，其防治效果分別達(dá)到66.35%和64.80%，而上清液的防治效果不明顯（表2）。說明HK11?9 對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果主要是對(duì)其活菌的定殖起效果。

表1 HK11-9 對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果Table 1 Control effect of HK11-9 against the Corynespora leaf spot of cucumber

表2 HK11-9 不同發(fā)酵組分對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果Table 2 Control effects of different components of HK11-9 against Corynespora leaf spot of cucumber

圖3 HK11-9 對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果Fig. 3 Control effect of HK11-9 against Corynespora leaf spot of cucumber

2.3 HK11?9在黃瓜葉部的定殖量

HK11?9 在黃瓜葉部具有穩(wěn)定的定殖能力。處理第1 天時(shí)在葉部的定殖密度為1.13×104CFU/g，之后定殖密度增加，處理第7 天時(shí)增加為3.13×104CFU/g，之后定殖密度趨于穩(wěn)定，處理后第21 天時(shí)定殖密度仍能達(dá)到2.73×104CFU/g（圖4）。結(jié)果表明，HK11?9 在黃瓜葉部保持穩(wěn)定的定殖量，有利于其發(fā)揮作用。

圖4 HK11-9 在黃瓜葉部的定殖量Fig. 4 Colonization of HK11-9 on cucumber leaves

2.4 HK11?9處理對(duì)黃瓜葉部防御酶活性的影響

HK11?9 處理顯著影響黃瓜葉部PAL、PPO 和POD 酶活性。HK11?9、黃瓜棒孢葉斑病菌（Cc）和HK11?9+Cc 處理對(duì)黃瓜葉部PAL 活性的變化趨勢(shì)一致，處理第1 天時(shí)，Cc、HK11?9 和HK11?9+Cc 處理均提高黃瓜葉部PAL 活性，其中Cc 處理提高最顯著，比對(duì)照提高17.92%，而處理第7 天時(shí)，Cc 處理的黃瓜葉部PAL 活性降低，而HK11?9+Cc 處理黃瓜葉部PAL 活性顯著提高，比Cc 處理提高62.16%（圖5?A）。Cc 處理降低黃瓜葉部POD 酶活性，處理第1 天時(shí)Cc 處理的黃瓜葉部POD 活性比對(duì)照降低19.41%，而HK11?9+Cc 處理的黃瓜葉部POD 活性均顯著高于其他處理，處理第1 天時(shí)比Cc 處理提高38.76%，第7 天時(shí)仍比Cc 處理提高17.55%（圖5?B）。另外，HK11?9、Cc 和HK11?9+Cc 處理均影響黃瓜葉部PPO 活性，處理第1 天時(shí)，Cc 和HK11?9+Cc 處理的黃瓜葉部PPO 活性均顯著提高，分別比對(duì)照提高74.28%和128.11%，然后，Cc 處理的黃瓜葉部PPO 活性趨于下降，而HK11?9+Cc 處理的黃瓜葉部PPO 活性均保持比較高水平，處理第7 天時(shí)，HK11?9+Cc 處理的黃瓜葉部PPO 活性比Cc 處理提高51.06%（圖5?C）?？梢姡琀K11?9 處理不同程度提高黃瓜葉部防御酶活性，有利于提高黃瓜對(duì)病原菌的抗性。

圖5 HK11-9 處理對(duì)黃瓜葉部防御酶活性的影響Fig. 5 Effects of HK11-9 treatment on the activities of cucumber leaf defense enzymes

2.5 HK11?9的鑒定

HK11?9 在TSA 培養(yǎng)基上產(chǎn)生乳白色、不透明、表面不光滑、邊緣不規(guī)則的菌落（圖6）。HK11?9的菌體為直桿狀、周生鞭毛、革蘭氏陽性，在4-50℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，最高耐鹽濃度為4%，可以利用葡萄糖、蔗糖、甘油、麥芽糖、甘露醇，不能利用半乳糖、單寧酸、檸檬酸，亞硝酸鹽還原反應(yīng)、淀粉水解呈陽性，硝酸鹽還原反應(yīng)、硫化氫、明膠液化呈陰性，能進(jìn)行葡萄糖氧化發(fā)酵（表3）。另外，以HK11?9 總RNA 為模板，PCR 擴(kuò)增出的16S rRNA 序列全長(zhǎng)為1 449 bp，NCBI BLAST 比對(duì)結(jié)果與多黏類芽孢桿菌16S rRNA 序列同源性達(dá)到99%。利用MEGA 軟件構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，與多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxaHE981775.1）在一個(gè)分支，其支持度為99%（圖7）。因此，根據(jù)其形態(tài)特征、生理生化特性和16S rRNA 基因序列同源性分析，將HK11?9 鑒定為多黏類芽孢桿菌。

表3 HK11-9 的形態(tài)特征和生理生化特性Table 3 Morphological characteristics and physiological and biochemical characteristics of HK11-9

圖6 HK11-9 菌落形態(tài)Fig. 6 Colony morphology of HK11-9

圖7 基于16S rRNA 序列構(gòu)建的HK11-9 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 7 Phylogenetic tree of HK11-9 based on 16S rRNA sequence

2.6 HK11?9的抑菌譜及其生物學(xué)功能

除多主棒孢霉以外，HK11?9 菌株對(duì)多種植物病原菌具有抑菌活性，其抑菌帶寬度大于0.55 cm（表4，圖8）。HK11?9 菌株還具有分解淀粉、纖維素、蛋白和產(chǎn)嗜鐵素的能力（表5，圖9）。可見，HK11?9 具有很好的生防潛力。

表4 HK11-9 對(duì)植物病原菌的抑菌活性Table 4 Antifungal activities of HK11-9 against plant pathogens

表5 HK11-9 的生物學(xué)功能Table 5 Biological functions of HK11-9

圖8 HK11-9 對(duì)植物病原菌的抑菌活性Fig. 8 Antifungal activities of HK11-9 against plant pathogens

圖9 HK11-9 的生物學(xué)功能Fig. 9 Biological functions of HK11-9

3 討論

3.1 HK11?9對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的生防潛力

黃瓜棒孢葉斑病在黃瓜整個(gè)生育期均能引起發(fā)病，主要危害葉片，在黃瓜葉柄和莖稈上也會(huì)產(chǎn)生病斑。該病原菌以菌絲體、分生孢子叢或厚垣孢子隨病殘?bào)w在土壤中越冬，存活力較強(qiáng)，主要以種子帶菌的方式進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，在作物生育期間主要靠分生孢子進(jìn)行再次侵染和病害的擴(kuò)散蔓延［17-19］。因此，抑制病原菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，能夠有效降低病原菌侵染和傳播，達(dá)到防治病害的效果。張曉云等［8］研究報(bào)道，貝萊斯芽孢桿菌HMB28521對(duì)多主棒孢霉的抑菌率為83.6%，對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果為80.5%；王明剛［20］報(bào)道，放線菌XN?22 對(duì)多主棒孢霉的抑菌率為85.9%，對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果為67.37%；郭會(huì)靖等［21］發(fā)現(xiàn)，拮抗菌ZL?7 對(duì)多主棒孢霉的抑菌率為67.1%。本研究結(jié)果，HK11?9 菌株能夠抑制多主棒孢霉菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，有效防治黃瓜棒孢葉斑病。多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）是一類產(chǎn)生內(nèi)生孢子來抵抗逆境的具有耐高溫、耐干旱特性，在植物表面易存活和繁殖的優(yōu)良生防資源［22］。已報(bào)道較多多黏類芽孢桿菌能夠防治多種植物病害，如多黏類芽孢桿菌K18?5 防治黃瓜枯萎?。?3］；多黏類芽孢桿菌XZ?2 對(duì)大豆疫霉病菌、大豆炭疽病菌和大豆菌核病菌有不同程度的拮抗作用［24］；多黏類芽孢桿菌APEC136 對(duì)蘋果采后炭疽病和白腐病有良好的防治效果［25］；多黏類芽孢桿菌DY04 對(duì)小麥赤霉病有良好的防治效果和促生效果［26］；多黏類芽孢桿菌TC35 對(duì)辣椒疫病有較好的防治效果［27］。至今，尚未見到多黏類芽孢桿菌防治黃瓜棒孢葉斑病的報(bào)道。本研究鑒定結(jié)果HK11?9 菌株為多黏類芽孢桿菌，能夠產(chǎn)生芽孢，對(duì)尖孢鐮孢菌等多種植物病原菌具有抑菌活性，能夠產(chǎn)生嗜鐵素、分解纖維素、蛋白和淀粉等作用，顯示出良好的生防潛力，為黃瓜棒孢葉斑病生物防治提供了新的生防微生物資源。

3.2 HK11?9的定殖能力

生防菌的定殖能力是生防菌能否成功控制病害的決定性因素，其定殖受很多因素的影響［28-29］。研究報(bào)道，鉤狀木霉菌（Trichoderma hamatum）在辣椒根際和植株中穩(wěn)定定殖，并對(duì)辣椒疫病具有生物防治作用，防治效果達(dá)到53.33%［30］。蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）SZ5、枯草芽孢桿菌DP10 和CCM9在棉花（Gossypium hirsutumL.）體內(nèi)的定殖密度與對(duì)病害的防治效果有密切相關(guān)，在棉苗中定殖一定數(shù)量才能對(duì)棉花黃萎病產(chǎn)生較高的防治效果［31］。熒光假單胞菌2?79 在小麥（Triticum aestivumL.）根部不同部位定殖量與小麥全蝕病病斑數(shù)成反比，定殖量越多病斑數(shù)量越少［32］?？莶菅挎邨U菌B47 在番茄植株根和莖中定殖量達(dá)到104CFU/g 時(shí)，其對(duì)番茄青枯病的防治效果能夠達(dá)到79.79%［33］。本研究中HK11?9 菌株在黃瓜葉部穩(wěn)定保持一定的定殖量，另外，HK11?9 的菌懸液和發(fā)酵液對(duì)黃瓜棒孢葉斑病具有明顯的防治效果，而其上清液對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果不明顯，推測(cè)HK11?9 發(fā)揮其對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果與其定殖能力有密切相關(guān)，其具體相關(guān)性有待于進(jìn)一步探討。

3.3 HK11?9對(duì)防御酶活性的影響

大量研究表明，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）與植物抗病過程有密切相關(guān)，是植物抗病的重要指標(biāo)。PAL 是酚類物質(zhì)、植保素和木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，通過苯丙烷代謝途徑能夠促進(jìn)水楊酸、木質(zhì)素和植保素及類物質(zhì)的產(chǎn)生。PAL 活性增加能夠?qū)е滤畻钏?、木質(zhì)素和植保素等在植物內(nèi)的含量提高，進(jìn)而增強(qiáng)抗病性。POD 是植物體內(nèi)一種關(guān)鍵的氧化酶，是防御酶系中的重要一員，可以將酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素、植保素等，從而提高植物抗病性。PPO 廣泛存在于植物中，可促進(jìn)酚類物質(zhì)氧化，將酚類物質(zhì)氧化成對(duì)病原菌有毒的醌類物質(zhì)，殺死病原菌［34］。已有較多報(bào)道，生防菌的處理能夠誘導(dǎo)植物防御酶活性的提高，進(jìn)而提高植物對(duì)病原菌的抗性，如解淀粉芽孢桿菌HRH317 能誘導(dǎo)玉米植株體內(nèi)防御酶活性的表達(dá)而增強(qiáng)其系統(tǒng)抗性［35］；芽孢桿菌Ya?1 處理后辣椒葉片PAL、POD 和SOD 活性顯著升高，從而增強(qiáng)植物抗辣椒枯萎病的能力［36］；貝萊斯芽孢桿菌HM3?3 可誘導(dǎo)植物體內(nèi)POD、PPO、SOD、CAT 活性提高，抵御致病菌對(duì)植株的侵害［37］；熒光假單胞菌S149 可提高寄主抗病相關(guān)防御酶活性，進(jìn)而增加寄主抗病性［38］。本研究結(jié)果，經(jīng)HK11?9 處理后接種棒孢葉斑病菌，提高黃瓜葉部PAL、POD 和PPO活性，可能是因?yàn)镠K11?9 處理激發(fā)了植物體內(nèi)的抗性反應(yīng)，提高了黃瓜葉部防御酶活性，進(jìn)而減輕黃瓜葉部棒孢葉斑病的發(fā)病程度，其具體的相關(guān)性有待于進(jìn)一步研究。HK11?9 菌株是具有較大潛力的多功能生防細(xì)菌，其具體的防病機(jī)制及實(shí)際應(yīng)用推廣有待進(jìn)一步的探索和研究。

4 結(jié)論

從金雞菊植物根際土壤分離篩選獲得拮抗細(xì)菌HK11?9 對(duì)黃瓜棒孢葉斑病具有良好的防治效果，其離體和活體防效分別能達(dá)到62.80%和67.73%，且在葉部有穩(wěn)定的定殖能力，能提高黃瓜葉部防御酶的活性。HK11?9 經(jīng)鑒定為多黏類芽孢桿菌，具有分解淀粉、纖維素、蛋白和產(chǎn)嗜鐵素的能力，且其抑菌譜較廣，因而表明菌株 HK11?9 在黃瓜棒孢葉斑病生物防治方面具有一定的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。