熒光素酶輔助定量大腸桿菌破碎效果的方法

李奕雅 吳一凡 丁能水 范小萍 陳凡

（1. 閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，漳州 363000；2. 福建傲農(nóng)生物科技集團(tuán)股份有限公司，漳州 363000）

20 世紀(jì)末以來，隨著DNA 重組技術(shù)的蓬勃發(fā)展以及蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)的不斷進(jìn)步，基于原核生物蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的異源蛋白高效生產(chǎn)早已成為現(xiàn)實(shí)［1-3］。在原核表達(dá)體系中，以大腸桿菌為代表的表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清晰、生長快速、表達(dá)量高、易于操作、連續(xù)發(fā)酵能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛作為外源蛋白的表達(dá)宿主［4］。

然而，在基于大腸桿菌的外源蛋白表達(dá)體系中，作為分離純化目標(biāo)的靶蛋白往往以胞內(nèi)組分的形式存在。在分離提取環(huán)節(jié)，為了使細(xì)胞內(nèi)含物得到釋放，首先必須對細(xì)胞進(jìn)行破碎或裂解。因此，細(xì)胞的破碎便成為提取胞內(nèi)生物活性物質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)［5］。目前，常用的大腸桿菌細(xì)胞破碎技術(shù)，主要有高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲破碎法、酶溶法、化學(xué)滲透法等［6］。其中，超聲破碎法作為一種低成本、易使用的菌體破碎手段，一直被廣泛應(yīng)用。該法利用超聲波在液體介質(zhì)中引起的空化效應(yīng)，產(chǎn)生高壓力的沖擊波和局部高溫，破壞細(xì)胞壁的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來，參與后續(xù)的純化過程［7］。其作用效果受到探頭直徑、超聲功率、溶液體積、容器大小、容器材質(zhì)、破碎緩沖液組成以及超聲作用時間等多方面因素的協(xié)同影響，若不作針對性優(yōu)化，則難以達(dá)到較好的效果——在保證破碎率的基礎(chǔ)上，盡可能保全靶蛋白的生物活性［8］。因此，超聲破碎的參數(shù)優(yōu)化，就成為原核表達(dá)蛋白質(zhì)純化過程中的關(guān)鍵步驟之一。而這一優(yōu)化過程，往往需要借助SDS?PAGE 及其后續(xù)的染色結(jié)果判斷，費(fèi)時費(fèi)力且只能得到半定量的結(jié)果，效率與精度亟待提高［9］。

螢火蟲（Photinus pyralis） 熒光素酶（firefly luciferase, FLuc）大量存在于螢火蟲尾部，與生物發(fā)光密切相關(guān)［10-12］。其分子量約61 kD，常用于報告基因檢測，具有靈敏度高、半衰期短、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，早已成為醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)研究領(lǐng)域的重要標(biāo)記工具［13-15］。目前，已有研究表明［16］，F(xiàn)Luc 的作用底物D?Luciferin 在堿性條件下帶負(fù)電荷，無法穿透大腸桿菌的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜，不能與胞內(nèi)的FLuc產(chǎn)生反應(yīng)。若控制緩沖液的pH 值在堿性范圍，則向表達(dá)FLuc 的菌懸液中添加底物時，底物僅與游離的FLuc 產(chǎn)生反應(yīng)，發(fā)出熒光，故可用于表征菌體裂解時外屏障的受損情況。此外，F(xiàn)Luc 自身熱穩(wěn)定性不佳［17］，在35℃以上環(huán)境中，即可檢測到活性顯著下降。這一特點(diǎn)可用于破碎過程中超聲熱效應(yīng)的判定，為維持靶蛋白特別是熱不穩(wěn)定靶蛋白在破碎環(huán)節(jié)中的活性提供重要參考。

本研究使用基于大腸桿菌cspA啟動子的原核表達(dá)載體［18］，利用螢火蟲熒光素酶活性作為破碎指標(biāo)，考察了其在海腎熒光素酶（Renilla luciferase, RLuc）、增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）和紅色熒光蛋白（mCherry）表達(dá)菌株破碎過程中的定量效果。研究成果為大腸桿菌細(xì)胞破碎過程中的條件優(yōu)化和目標(biāo)蛋白的活性保全提供了簡便易行的評價手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 pCold III DNA 載體（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司）；BL21 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（上海唯地生物技術(shù)有限公司）。轉(zhuǎn)化了pCold?FLuc、pCold?RLuc、pCold?EGFP 和pCold?mCherry 等表達(dá)載體的BL21 菌種由本課題組構(gòu)建并保存，各載體結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 本研究使用的載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Schematic representation of the plasmid structures used in this study

1.1.2 試劑 酵母提取物、胰蛋白胨（Oxoid）；氯化鈉、甘油（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氨芐青霉素鈉鹽、RealBand 三色預(yù)染蛋白Marker、IPTG（生工生物工程（上海）股份有限公司）；10×SDS 電泳緩沖液、10%蛋白預(yù)制膠、Ni?NTA 樹脂（鎳珠）（北京蘭博利德商貿(mào)有限公司）；DL101?01 雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

1.1.3 儀器 XS?TD1 臺式全溫振蕩培養(yǎng)箱（象尚昱科（上海）實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；Spark 多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；T30D 型三槽超級梯度PCR 儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）；UV?1600 紫外可見分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；H2050R?1 高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司）；VCX800 細(xì)胞破碎儀（美國Sonics 公司）；Imager 600 UV 生物分子成像儀（美國GE 公司）；DYCZ?24DN 垂直電泳槽、DYY?6D 電腦三恒多用電泳儀電源（北京六一生物科技有限公司）；VM?100旋轉(zhuǎn)混合儀（杭州佑寧儀器有限公司）；GelSMART凝膠成像儀（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化與靶蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 取保存于?80℃的甘油菌1 μL，加入到750 μL 氨芐（100mg/L，下同）抗性LB 培養(yǎng)基中，置于37℃，220 r/min環(huán)境中振蕩培養(yǎng)16 h。隨后取其中的500 μL，加入到150 mL氨芐抗性LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)至濁度（以O(shè)D650計，避免mCherry 被入射光激發(fā)，干擾檢測［19］）介于0.5-0.6 之間，再添加終濃度100 μmol/L 的IPTG，置于15℃，220 r/min環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，并開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 菌體的超聲破碎 按1.2.1 所述步驟誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，在7 000 ×g，4℃離心2 min 后，棄上清，收集菌泥，以20 mL 冰冷的PBS 緩沖液（pH 7.4，0.01 mol/L，下同）重懸，重復(fù)離心一次，棄上清后以10 mL 冰冷的PBS 重懸。隨后利用50 mL 離心管盛放菌液，置于冰水混合物中，使用直徑6 mm 的超聲探頭，在指定功率下按照“破碎2 s，停止3 s”的條件破碎并采樣檢測。破碎樣品經(jīng)15 000 ×g，4℃離心15 min 后，取上清液檢測蛋白質(zhì)活性。

1.2.3 熒光素酶活性檢測 取一定量經(jīng)PBS 稀釋的熒光素酶樣品，用試劑盒附帶的細(xì)胞裂解液補(bǔ)足20μL 后，利用多功能酶標(biāo)儀逐孔檢測。檢測時，利用自動進(jìn)樣器添加對應(yīng)的底物，再對酶標(biāo)板進(jìn)行2 s 的振蕩，隨后立即檢測熒光強(qiáng)度。此外，檢測FLuc 活性時，設(shè)置數(shù)據(jù)衰減模式為“OD1”（約衰減到原始數(shù)值的10%）；檢測RLuc 活性時，應(yīng)將儀器衰減模式設(shè)置為“OD3”（約衰減到原始數(shù)值的0.1%），以避免過曝。

1.2.4 熒光蛋白活性檢測 利用多功能酶標(biāo)儀檢測EGFP（濾光片組合：EX?485；EM?535）和mCherry（濾光片組合：EX?535；EM?595）活性時，取破碎后的上清液，用PBS 補(bǔ)足100 μL 后上機(jī)檢測。為避免過曝，EGFP 檢測過程中需將增益值（Gain）設(shè)置為45，mCherry 檢測時需將增益值設(shè)置為60。

1.2.5 螢火蟲熒光素酶輔助破碎定量效果檢測 按1.2.1、1.2.2 有關(guān)步驟進(jìn)行靶蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和菌體清洗，最終得到表達(dá)4 種靶蛋白的菌懸液各10 mL。此后，向含有RLuc、EGFP 和mCherry 的菌懸液中，各加入20 μL 表達(dá)了FLuc 的菌懸液。再于160 W 功率下進(jìn)行超聲破碎。破碎結(jié)束后，取上清液2.5 μL，按1.2.3 所述方法直接檢測螢火蟲熒光素酶活性；針對海腎熒光素酶，則取稀釋500 倍后的上清液2.5μL 檢測；對于含有EGFP 或mCherry 的上清液，則按1.2.4 所述步驟，取5 μL 上清液檢測活性。

1.2.6 溫度對蛋白質(zhì)活性的影響評價 按1.2.1、1.2.2 所述步驟進(jìn)行靶蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和菌體破碎（160W，15 min）。隨后取若干個0.2 mL 離心管，每管加入50 μL 含有靶蛋白的上清液，先利用梯度PCR 或冰水混合物（0℃）孵育15 min，再以室溫孵育15 min，隨后以0℃處理的樣品活性為100%，檢測并計算各靶蛋白的殘余活性。

1.2.7 不同破碎功率對熒光素酶活性的影響評價 按1.2.1、1.2.2 有關(guān)步驟進(jìn)行靶蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和菌體清洗，得到表達(dá)FLuc 和RLuc 的菌懸液各10 mL，取每種菌懸液20 μL，加入到10 mL 冰冷的PBS 中，混合均勻后按1.2.2 所述的超聲破碎方法分別使用160 W、240 W 和320 W 超聲功率進(jìn)行菌體破碎，并于破碎過程中定時采樣獲得破碎上清液，取其中2.5 μL 直接檢測熒光素酶活性。

1.2.8 蛋白質(zhì)活性的半定量攝像 針對FLuc 樣品，取少量含有FLuc 的破碎上清液，用試劑盒附帶的細(xì)胞裂解液補(bǔ)足20 μL，再加入檢測用底物溶液100μL，混合2 s 后立即使用攝像頭采集反應(yīng)圖像。針對EGFP 或mCherry 樣品，取少量含熒光蛋白的破碎上清液，用PBS 補(bǔ)足100 μL 后，通過485 nm 光源激發(fā)熒光，以520 nm 濾光板（長通型）輔助拍照。

1.2.9 蛋白質(zhì)的鎳珠法純化與電泳檢測 用10 倍鎳珠體積的PBS 清洗鎳珠3 次，再將等體積的鎳珠添加到待純化的蛋白質(zhì)溶液中，混勻后取樣保存。隨后以20 r/min，4℃上下回旋振蕩12 h，500 ×g離心3 min 后取少量上清液保存。再以PBS 清洗鎳珠3 次，取約20 μL 鎳珠顆粒保存。最后將終濃度1×的SDS?PAGE 上樣緩沖液加入各樣品中，定容至100 μL，95℃加熱10 min 后取其中15 μL 進(jìn)行SDS?PAGE（分離膠濃度10%）檢測，并以考染方式分析電泳結(jié)果。

1.2.10 凍存菌的破碎與檢測 按1.2.1 所述步驟誘導(dǎo)表達(dá)靶蛋白的菌液，離心清洗菌體1 次，用10mL 含有體積分?jǐn)?shù)為30%的甘油的PBS 重懸。再將重懸后的菌液分裝置于?80℃冷凍保存。此后，每隔30 d 取出含有FLuc 和RLuc 的菌懸液各1 mL，37℃水浴解凍，離心后用10 mL 冰冷的PBS 重懸，隨后以160 W 功率破碎，并定時取樣。破碎上清液用PBS 稀釋50 倍后，取2.5 μL 檢測熒光素酶活性。

1.2.11 統(tǒng)計分析 所有檢測結(jié)果使用Minitab v17.0軟件進(jìn)行數(shù)值統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean± SD）”形式表示（每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次）。待比較數(shù)據(jù)的方差一致時，使用Tukey 方法進(jìn)行多重比較；方差不一致時，使用Games?Howell 方法進(jìn)行多重比較。同一實(shí)驗(yàn)中，不含共享字符的兩組數(shù)據(jù)存在顯著差異（P<0.05）。

2 結(jié)果

2.1 熒光素酶和熒光蛋白活性檢測條件的確定

在各靶蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和菌體超聲破碎（160 W，20 min） 后， 對含有FLuc、RLuc、EGFP 和mCherry 等4 種蛋白質(zhì)的上清液進(jìn)行活性檢測（FLuc和RLuc 樣品在檢測前須稀釋500 倍），并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。由各標(biāo)準(zhǔn)曲線可見，本研究選擇的樣品添加量與反應(yīng)熒光強(qiáng)度存在較強(qiáng)的線性關(guān)系，可認(rèn)為對應(yīng)的檢測方法和上清液用量是有效且準(zhǔn)確的。此外，基于圖2 所示數(shù)據(jù)可知，在輔助破碎的過程中，向目標(biāo)菌懸液中按1∶500（體積比）添加表達(dá)FLuc的菌懸液，能夠?qū)z測讀數(shù)控制在標(biāo)準(zhǔn)曲線所及的范圍內(nèi)并留有余量，足以為破碎過程提供定量依據(jù)。

圖2 經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的4 種蛋白質(zhì)活性標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curves of four induced proteins activities after induction

2.2 超聲破碎的螢火蟲熒光素酶輔助定量效果檢驗(yàn)

確定輔助定量所需的FLuc 菌液用量后，按照1.2.5 所述步驟，檢驗(yàn)FLuc 表達(dá)菌對RLuc、EGFP和mCherry 表達(dá)菌的超聲破碎輔助定量效果。以破碎樣品中活性最強(qiáng)的平均值為100%，繪制活性變化曲線如圖3 所示。通過對圖3 中各子圖的分析可知，F(xiàn)Luc 在破碎上清液中的活性上升趨勢與3 種靶蛋白基本一致。說明FLuc 對靶蛋白的釋放過程起到了良好的定量表征作用，能為不同條件下超聲破碎參數(shù)的設(shè)置提供有效參考。

圖3 三種菌懸液超聲破碎的螢火蟲熒光素酶輔助定量結(jié)果圖Fig. 3 Firefly luciferase-assisted quantification of ultrasonic disruption for three bacterial suspensions

2.3 螢火蟲熒光素酶對超聲破碎功率的敏感性測試

按1.2.6 所述實(shí)驗(yàn)步驟，對4 種蛋白質(zhì)分別進(jìn)行加熱和保溫處理，探討溫度對4 種蛋白質(zhì)活性的影響，結(jié)果如圖4 所示，可得到如下結(jié)論：（1）由圖4?A,B 可見，F(xiàn)Luc 和RLuc 在38.5℃和40℃環(huán)境下處理15 min 后，活性明顯下降，且FLuc 活性損失較大。（2）在圖4?C, D 中，EGFP 和mCherry 所表現(xiàn)出的熱穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于熒光素酶，其活性僅在處理溫度大于67℃后出現(xiàn)下降，且mCherry 的活性下降更為緩慢。因此，后續(xù)宜選用“FLuc+RLuc”這一對溫度更敏感的蛋白質(zhì)組合，考察不同破碎功率對終產(chǎn)物活性的影響。

圖4 不同處理溫度下4 種蛋白質(zhì)活性的變化Fig. 4 Activity changes of four proteins incubated under different temperatures

按1.2.7 所述步驟，以不同超聲功率對熒光素酶表達(dá)菌進(jìn)行破碎，結(jié)果顯示，（1）以160 W 功率破碎（圖5?A），熒光素酶活性在10 min 內(nèi)達(dá)到最大值，隨后逐步下降，破碎25 min 后，兩種酶的活性損失均大于45%。（2）以240 W 功率破碎（圖5?B），熒光素酶活性在5 min 內(nèi)達(dá)到最大并迅速下降，破碎結(jié)束后，兩種酶的活性損失均大于85%。（3）以320 W 功率破碎（圖5?C），熒光素酶活性在10 min內(nèi)就經(jīng)由升高到近乎完全損失，高功率帶來的負(fù)面效應(yīng)明顯。綜合圖5 所示結(jié)果，認(rèn)為FLuc 的活性變化確實(shí)能夠反映出破碎條件過于劇烈的可能，從而為蛋白質(zhì)活性的保全提供重要參考。

圖5 不同超聲破碎功率對破碎后熒光素酶活性的影響Fig. 5 Effects of different ultrasonic power on luciferase activity after sonication

2.4 添加熒光素酶對靶蛋白純化的影響

本研究使用的FLuc 不帶純化標(biāo)簽且用量極少，理論上不干擾靶蛋白的后續(xù)純化。為驗(yàn)證該假設(shè)，首先按照1.2.8 所述步驟，拍攝了實(shí)驗(yàn)2.1 所使用的FLuc、EGFP 和mCherry 破碎上清液的活性影像，結(jié)果如圖6?A-C 所示?？梢姼魃锨逡褐写_實(shí)含有與樣品對應(yīng)的外源蛋白。隨后再將FLuc/EGFP 或FLuc/mCherry 上清液按2∶1（體積比）混合，作為待純化的樣品，按1.2.9 所述步驟進(jìn)行鎳珠吸附檢測，結(jié)果如圖6?D 所示。由該結(jié)果看出，即便在過量添加FLuc 的樣品中，該酶也難以被鎳珠吸附，其對應(yīng)條帶基本保留在上清液中，與EGFP 和mCherry 的顯色結(jié)果截然相反。因此，以FLuc 作為破碎輔助定量手段時，其對鎳珠純化過程及產(chǎn)物純度的影響可忽略不計。

圖6 螢火蟲熒光素酶的添加對靶蛋白后續(xù)純化的影響Fig. 6 Effect of firefly luciferase addition on the purification of target proteins

2.5 低溫凍存對輔助定量效果的影響

按1.2.10 所述步驟，驗(yàn)證菌體凍存對輔助定量效果的影響，結(jié)果（圖7）顯示，兩種熒光素酶的活性曲線中，后3 組數(shù)據(jù)的均值在連續(xù)4 次檢測中未見下降趨勢（酶活僅因檢測溫度不同，略有波動），說明凍存期間兩種熒光素酶的活性并未產(chǎn)生可檢出的損失。熒光素酶活性曲線中，0-3 min 內(nèi)的斜率最大，說明破碎初始階段，菌體對超聲作用最為敏感。而在連續(xù)4 次檢測中，位于3 min 數(shù)據(jù)點(diǎn)的數(shù)值，與后3 組數(shù)據(jù)均值之比都在50%-60%之間波動，同樣未見明顯上升趨勢。且圖7?A 所示新鮮菌液的破碎曲線與圖7?B-D 所示凍融菌的破碎曲線，在趨勢上也大體相同，可見一次凍融對大腸桿菌細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的破壞有限，并不能大幅降低菌體對外力破壞的耐受性，凍融菌破碎難度與新鮮菌體基本一致。

圖7 不同凍存時間對螢火蟲熒光素酶輔助定量效果的影響Fig. 7 Effect of different cryo-storage time on firefly luciferase-assisted quantification

3 討論

螢火蟲熒光素酶具有靈敏度高、線性范圍廣、檢測操作簡單且結(jié)果容易量化等特點(diǎn)，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。本研究提出并驗(yàn)證了大腸桿菌超聲破碎的螢火蟲熒光素酶輔助定量方法，進(jìn)一步拓寬了熒光素酶的應(yīng)用范圍，其主要優(yōu)勢在于：（1）實(shí)際操作中，由于破碎效果受多種條件的協(xié)同影響，使超聲處理?xiàng)l件的精細(xì)優(yōu)化較為繁瑣。本法利用表達(dá)了FLuc 的大腸桿菌作為內(nèi)標(biāo)，通過破碎過程中熒光素酶的活性釋放情況，表征待測菌體的破碎程度，特別適合靶蛋白活性檢測困難的場合，能為大腸桿菌的超聲破碎條件優(yōu)化提供量化指導(dǎo)且不影響靶蛋白的后續(xù)純化，具有良好的可行性。（2）在超聲破碎過程中，氧化效應(yīng)、空化效應(yīng)，特別是熱效應(yīng)的持續(xù)累積［20］，可能對靶蛋白的高級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，對終產(chǎn)物的質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。因此，一種能夠反映破碎條件是否過于劇烈，從而避免靶蛋白活性損失的指標(biāo)就顯得極為重要。而熱穩(wěn)定性不佳且分子量適中［21-22］的FLuc，恰恰適合監(jiān)測破碎條件的劇烈程度，并能夠給出溶液的整體量化均數(shù)，對于穩(wěn)定性高于FLuc 的靶蛋白，其數(shù)據(jù)有較高的參考價值，信息量豐富。但仍應(yīng)注意在實(shí)際操作中，破碎條件對靶蛋白活性的影響，還與其自身的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有關(guān)。對于具體的研究項(xiàng)目，靶蛋白與FLuc相比是否更為穩(wěn)定，應(yīng)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)對比確認(rèn)。若遇到靶蛋白穩(wěn)定性較差的情況，可考慮使用條件上更為溫和的化學(xué)或酶法裂解，減小破碎過程中的損失。（3）輔助定量過程中，F(xiàn)Luc 表達(dá)菌的用量極少。若FLuc 表達(dá)菌需要隨目標(biāo)菌一同培養(yǎng)，則整個定量流程將過于繁瑣。而依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究人員可將表達(dá)FLuc 的菌體分裝后低溫凍存，且凍存菌可在至少3 個月內(nèi)保持相似的檢測靈敏度，對需要反復(fù)優(yōu)化破碎條件的研究工作極為有利，也極大地保障了方法的實(shí)用性和便捷性。

此外，從本文所示的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也能推斷：（1）輔助定量可使用的熒光素酶不僅限于FLuc。在本文所示數(shù)據(jù)中，RLuc 在破碎過程中的活性變化和FLuc 十分接近，同樣可以作為定量依據(jù)。但FLuc 在生物學(xué)研究中應(yīng)用較早，試劑盒國產(chǎn)化程度高［23-25］，檢測成本相對低廉，故成為本研究的首選酶系。（2）因FLuc 的原核表達(dá)效率較高，故應(yīng)避免使用閃光型熒光素酶檢測試劑盒。一方面其熒光強(qiáng)度高，容易造成檢測器過曝；另一方面，閃光型反應(yīng)發(fā)光時間過短，檢測特別是手動加樣檢測時誤差較大，往往導(dǎo)致更大的數(shù)據(jù)變異系數(shù)，對輔助定量極為不利。（3）研究結(jié)果顯示，超聲破碎時，菌體的用量也能顯著影響破碎結(jié)果。相同功率下，菌體量少則破碎速度快，但破碎造成的蛋白質(zhì)變性情況也將增加。這可能與菌體用量大時，隨菌體破碎而進(jìn)入外部緩沖液的物質(zhì)量增加有關(guān)。通常情況下，蛋白質(zhì)自身或環(huán)境中極性氨基酸濃度增大時，其穩(wěn)定性也相應(yīng)提高。且游離到胞外的分子伴侶蛋白，也可能對靶蛋白的高級結(jié)構(gòu)起到保護(hù)或修復(fù)的作用，故其整體活性能夠維持在比較高的水平［26-27］。（4）本研究中pCold III DNA 載體使用了大腸桿菌的cspA啟動子，故大部分大腸桿菌均可作為宿主使用，僅表達(dá)量可能有所不同，具備廣泛應(yīng)用的潛力。且從理論上分析，無論使用何種破碎方式或表達(dá)宿主種類，只要該宿主表達(dá)的FLuc 有活性并累積于胞內(nèi)，而破碎方式又不影響FLuc 的活性和檢測，均可使用本定量方法。（5）若靶蛋白的表達(dá)對細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞膜有破壞作用，則兩種菌體破碎難度不同，不適用本研究所述的輔助定量方式。

4 結(jié)論

本研究建立了以螢火蟲熒光素酶為內(nèi)標(biāo)的大腸桿菌超聲破碎輔助定量方式，利用相對簡便的操作和穩(wěn)定的檢測結(jié)果，較好地解決了大腸桿菌超聲破碎過程中的檢測效率問題，適合超聲破碎的條件優(yōu)化或日常實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)量監(jiān)控，為相關(guān)研究人員提供了又一實(shí)用工具。