黑曲霉葡萄糖吸收定量檢測的方法建立及其在MstC 功能研究中的應(yīng)用

高凱月 郭雨婷 杜奕謀 鄭小梅 馬欣榮 趙偉鄭平 孫際賓

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308；3. 國家合成生物技術(shù)創(chuàng)新中心，天津 300308；4. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；5. 山東福洋生物科技股份有限公司，德州 253100）

黑曲霉（Aspergillus niger）是有機酸與酶制劑的重要工業(yè)生產(chǎn)菌株，黑曲霉生產(chǎn)的檸檬酸全球年產(chǎn)達200 萬t，并以每年5%的速度遞增［1］。黑曲霉所生產(chǎn)的葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶與植酸酶等大宗酶制劑占有較大的市場份額［2］。黑曲霉具有強大的水解酶系可快速將多聚葡萄糖分解為葡萄糖，由葡萄糖雙轉(zhuǎn)運系統(tǒng)高效轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)，供給細胞生長與發(fā)酵生產(chǎn)。作為重要的碳源底物，葡萄糖的攝入吸收直接影響黑曲霉的發(fā)酵生產(chǎn)性能。葡萄糖攝入吸收的研究對理解黑曲霉生長發(fā)育特性與高效生產(chǎn)性能具有重要理論意義與工業(yè)應(yīng)用價值。

為應(yīng)對胞外葡萄糖等碳源變化，黑曲霉具有較為復(fù)雜的葡萄糖雙親和力轉(zhuǎn)運系統(tǒng)［3］。黑曲霉葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)包括高親和力轉(zhuǎn)運系統(tǒng)與低親和力轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，分別在低葡萄糖濃度與高葡萄糖濃度下發(fā)揮作用［3］。在黑曲霉葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的鑒定方面，基因組分析發(fā)現(xiàn)黑曲霉CBS513.88 中具有106 個糖轉(zhuǎn)運蛋白，其中14 個可能為己糖轉(zhuǎn)運蛋白［4］。目前，僅有MstA 等基因鑒定為高親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白［5-6］。MstC 與MstA 具有不同的表達模式，推測屬于低親和力轉(zhuǎn)運系統(tǒng)［6-7］，但尚未有直接的實驗證據(jù)。由于絲狀真具有復(fù)雜的菌絲形態(tài)與特殊的生理特性，目前對于葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的研究還較為有限，尤其是在葡萄糖吸收能力的定量檢測上研究較少［8］，限制了對黑曲霉葡萄糖吸收轉(zhuǎn)運與關(guān)鍵組分功能的理解認識。

葡萄糖吸收能力多通過細胞無法代謝的葡萄糖類似物來進行檢測，常用的葡萄糖類似物包括3?O?甲基葡萄糖（3?O?methyl glucose, 3?OMG）與2?脫氧葡萄糖（2?deoxyglucose, 2?DG）等［9］。當(dāng)被細胞吸收至胞內(nèi)后，3?OMG 將由于無法被己糖激酶磷酸化而駐留在胞內(nèi)，而2?DG 則被磷酸化為6?磷酸?2?脫氧葡萄糖（6?phosphate?2?deoxyglucose, 6?P?2?DG）后，無法被磷酸葡萄糖異構(gòu)酶進一步代謝，進而使其在胞內(nèi)積累來表征葡萄糖的吸收能力［9］。因此，放射性同位素標(biāo)記如氚標(biāo)記的3?OMG 與2?DG 被廣泛用于細胞葡萄糖吸收攝入能力的檢測中［8］。雖然放射性同位素標(biāo)記的檢測方法靈敏度高、定量準(zhǔn)確，但存在費用昂貴與有輻射損傷的問題，因此非放射性同位素標(biāo)記的2?脫氧葡萄糖類似物也逐漸被用于葡萄糖吸收能力的檢測［8-9］。例如2?脫氧葡萄糖類似物（2?［N?（7?nitrobenz2?oxa?1,3?diazol?4?yl）amino］?2?deoxy?D?glucose, 2?NBDG）是熒光標(biāo)記的2?DG，可被細胞吸收后，被己糖激酶磷酸化而駐留在細胞內(nèi)，釋放的熒光信號可作用細胞葡萄糖吸收的示蹤劑，來表征細胞葡萄糖吸收能力［9-10］。2?NBDG由于具有檢測方便、分辨率高且無輻射等優(yōu)勢，已應(yīng)用于哺乳動物細胞與酵母細胞的葡萄糖吸收能力檢測中［9-11］，但目前在絲狀真菌中還尚無相關(guān)方法的報道。

針對上述問題，本文首先以2?NBDG 為葡萄糖吸收轉(zhuǎn)運的示蹤劑，利用熒光成像與流式細胞定量檢測，優(yōu)化獲得2?NBDG 的最佳使用濃度與孵育時間，建立黑曲霉葡萄糖吸收能力的定量檢測技術(shù)流程。然后，利用該方法定量檢測黑曲霉低親和力轉(zhuǎn)運蛋白MstC 的過表達對細胞葡萄糖吸收的影響，并鑒定MstC 的關(guān)鍵活性氨基酸，為葡萄糖轉(zhuǎn)運的改造應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 FastPfu DNA 聚合酶與限制性內(nèi)切酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。ClonExpress? II 一步重組基因克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。2?NBDG 購自Thermo 公司；PEG6000、PEG3350 和來源于木霉的裂解酶均購自Sigma 公司；氨芐青霉素、蔗糖、麥芽糖提取物、山梨醇購自Amresco 公司；無尿嘧啶的氨基酸混合物、色氨酸、亮氨酸和組氨酸、瓊脂粉、無水麥芽糖、醋酸鋰、二硫蘇糖醇（DTT）、PBS 緩沖液與Tween?80 購自北京索萊寶科技有限公司；酵母粉和蛋白胨購自O(shè)xoid 公司。鮭魚精、氯化鈉、無水葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和氯化銨購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒與引物 本研究所使用的所有菌株和質(zhì)粒均在本實驗室保存。本研究所用的菌株、質(zhì)粒與引物如表1、表2 所示。

表1 本研究所用的菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用引物及其序列Table 2 Primers and their sequences used in this study

1.2 方法

1.2.1 重組表達質(zhì)粒pRS?MstC、pRS?MstCR188K與pOE?MstC、pOE?MstCR188K的構(gòu)建 首先，從Fung?iDB 數(shù)據(jù)庫［15］（https://fungidb.org/fungidb/app）中獲得黑曲霉葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白MstC 的核苷酸序列，來設(shè)計質(zhì)粒構(gòu)建的相關(guān)引物（表2）。然后，以黑曲霉D353.8 菌株的反轉(zhuǎn)錄cDNA 為模板，以MstC?F1/MstC?R1 為引物來擴增mstC基因的cDNA 片段。經(jīng)核酸瓊脂糖電泳檢測后，進行PCR 產(chǎn)物純化。采用ClonExpress? II 一步重組基因克隆試劑盒，再與經(jīng)限制性內(nèi)切酶BcuI 和HindIII 處理的質(zhì)粒片段pRS426 進行DNA 片段重組。然后，熱擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans1?T1 感受態(tài)細胞。以pRS?F/pRS?R 為引物進行菌落PCR 后，挑去正確的陽性克隆，進行質(zhì)粒提取與DNA 測序驗證。DNA 測序正確的質(zhì)粒，命名為pRS?MstC。為獲得mstC基因的點突變體表達質(zhì)粒，以pRS?MstC 為模板，以MstCR188K?F 與MstCR188K?R 為引物來在mstC基因中引入點突變。經(jīng)DNA 測序正確后，質(zhì)粒命名為pRS?MstCR188K。為構(gòu)建在黑曲霉表達質(zhì)粒，以MstC?F2/MstC?R2 為引物，分別以pRS?MstC 與pRS?MstCR188K為模板PCR 擴增，獲得MstC 與點突變體MstCR188K的編碼DNA 片段。然后，經(jīng)PCR 產(chǎn)物純化后，采用ClonExpress?II 一步重組基因克隆試劑盒與PacI 和SnaB I 酶切處理后的pXMD7 載體片段進行DNA 重組。經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化與菌落PCR，篩選陽性克隆后，提取質(zhì)粒與DNA 測序。經(jīng)DNA 測序驗證正確的質(zhì)粒，分別命名為pOE?MstC 與pOE?MstCR188K。

1.2.2 葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的酵母重組表達菌株的構(gòu)建與驗證 利用醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將重組表達質(zhì)粒pRS?MstC 與pRS?MstCR188K轉(zhuǎn)化至無葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae）EBY.VW4000中。首先，進行酵母感受態(tài)細胞的制備：挑取酵母菌株EBY.VW4000 的新鮮單菌落在5 mL YPM 培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min 預(yù)培養(yǎng)24 h，然后選取生長最好最快的進行后續(xù)實驗。取2 mL 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入50 mL YPM 培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min 繼續(xù)培養(yǎng)6-9 h。至OD600達到0.8-1.5 后，開始在冰上制備感受態(tài)細胞。用無菌去離子水進行洗滌后，獲得的細胞懸液即為酵母感受態(tài)細胞。然后，在500 μL 酵母感受態(tài)細胞中分別加入2 μg 重組表達質(zhì)粒pRS?MstC與pRS?MstCR188K、50 μL 1 mol/L LiAc、20 μL 1 mol/L DTT、15 μL 鮭魚精DNA（10 mg/mL）以及160 μL 50% PEG?3350，42℃孵育30 min 保持不動，2 500 r/min 離心5 min 收集菌體，重懸于250 μL 無菌去離子水，涂布于營養(yǎng)缺陷型加有20 g/L 麥芽糖的SD固體平板上，在30℃培養(yǎng)3-5 d 直至菌落長出。挑取單菌落進行酵母菌落PCR 驗證，以pRS?F/pRS?R為引物，來篩選陽性酵母重組菌株。

1.2.3 葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的黑曲霉過表達菌株的構(gòu)建與驗證 利用PEG 介導(dǎo)的原生質(zhì)體DNA 轉(zhuǎn)化方法將重組表達質(zhì)粒pOE?MstC 與pOE?MstCR188K轉(zhuǎn)化至黑曲霉D353.8 菌株的原生質(zhì)體中。黑曲霉DNA 轉(zhuǎn)化方法參考文獻［14］，首先，進行原生質(zhì)體懸液的制備：將D353.8 菌株的孢子懸液在34℃、220 r/min培養(yǎng)16-18 h。然后采用含有體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的來源于哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的裂解酶的酶解體系，在37℃孵育2-3 h，裂解菌體的細胞壁以制備原生質(zhì)體。用STC 進行洗滌后，獲得原生質(zhì)體懸液。然后，在100 μL 原生質(zhì)體中分別加入2 μg 重組表達質(zhì)粒pOE?MstC 與pOE?MstCR188K以及25% PEG 緩沖液，冰浴后依次加入1 mL 25% PEG緩沖液，加入2 mL STC 和10 mL 預(yù)熱的MMSA 上層培養(yǎng)基，然后平鋪至MMSA 下層培養(yǎng)基上，在34℃倒置培養(yǎng)5 d。挑取轉(zhuǎn)化子在CMA 固體平板上進行單孢子劃線分純，以獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子。然后，采用天根植物基因組提取試劑盒來提取各轉(zhuǎn)化子的基因組。最后，以各轉(zhuǎn)化子基因組為模板，以MstC?F2/MstC?R2 為引物進行PCR 驗證，篩選陽性黑曲霉重組菌株。

1.2.4 黑曲霉孢子攝取2?NBDG 的樣品處理 黑曲霉孢子攝取2?NBDG 的樣品處理主要包括黑曲霉孢子的預(yù)處理與2?NBDG 的孵育兩個步驟。首先，利用生理鹽水洗滌培養(yǎng)96 h 的CMA 固體平板上的孢子，制備新鮮的孢子懸液，以保證孢子活力。以將1×106個黑曲霉孢子接種于1 mL MM 培養(yǎng)基中，在34℃，200 r/min 的條件下進行預(yù)培養(yǎng) 4 h。然后，離心收集預(yù)培養(yǎng)的孢子后，用等體積PBS 緩沖液洗滌兩次。最后，將預(yù)培養(yǎng)孢子用含有不同濃度2?NBDG的PBS 緩沖液進行重懸，在34℃，200 r/min 的條件下孵育不同時間后，再次通過離心收集處理后的孢子，再用等體積PBS 緩沖液洗滌兩次后，用于熒光顯微成像與流式檢測。

1.2.5 黑曲霉孢子攝取2?NBDG 后的熒光顯微成像檢測 采用激光掃描共聚焦顯微鏡Leica TCS SP5 II（Leica）與成像分析軟件Leica Microsystems LAS AF?TCS MP，在100×1.4 NA 油鏡下，在激發(fā)波長為475 nm，檢測波長為550 nm 的條件下，來對2?NBDG處理的黑曲霉孢子進行成像觀察。采用Image J 軟件來進行圖片處理，每個樣品下至少采集50 個孢子的熒光成像圖，用于2?NBDG 的熒光強度的相對定量分析。

1.2.6 黑曲霉孢子攝取2?NBDG 后的流式定量檢測 采用BD Fortessa X?20 分析型流式細胞儀來定量檢測2?NBDG 孵育后的黑曲霉孢子。流式細胞儀的激發(fā)波長設(shè)置為488 nm；前向散射電壓（forward scatter（FSC）voltage）設(shè)置為37；側(cè)向角散射電壓（side scatter（SSC）voltage）設(shè)置為170；異硫氰酸熒光素電壓（fluorescein isothiocyanate（FITC）volt?age）設(shè)置為390。對流式數(shù)據(jù)進行輕微的門控，以排除明顯的錯誤，如灰塵顆粒、細胞簇和分生孢子聚集體等。每個樣品平行共檢測10 萬個細胞，用于分析熒光強度（FITC）和側(cè)向角散射（SSC）。流式檢測結(jié)果采用FlowJo 軟件（Beckman Coulter Inc., Brea,CA, USA）進行分析。每組樣品檢測至少3 組平行，各組樣品之間的差異采用t?檢驗進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 基于2?NBDG的黑曲霉葡萄糖攝取定量檢測方法的建立

為摸索合適的2?NBDG 孵育濃度，將預(yù)培養(yǎng)的黑曲霉孢子與不同濃度的2?NBDG 孵育2 h 后，分別采用熒光顯微成像與流式細胞儀來檢測黑曲霉孢子吸收2?NBDG 后的熒光情況，以確認能否以熒光強度來表征黑曲霉細胞的葡萄糖吸收能力。結(jié)果如圖1 所示，隨著2?NBDG 濃度的增加，黑曲霉孢子吸收2?NBDG 后，產(chǎn)生的熒光強度逐漸增加。具體來說，當(dāng)黑曲霉孢子與100 μmol/L 2?NBDG 孵育后，黑曲霉孢子出現(xiàn)較為微弱的可檢測熒光信號；并且在流式細胞檢測中，平均熒光強度為510.4±36.5，進入強熒光區(qū)域（Q2, FITC?H>103）的孢子比例為19.6%。當(dāng)2?NBDG 的孵育濃度為150 μmol/L 2?NBDG 時，黑曲霉孢子出現(xiàn)的熒光信號有所增強，流式細胞分析的105個孢子的平均熒光強度提高至712.1±51.2。當(dāng)孵育濃度進一步增加至添加200 μmol/L 時，但與150 μmol/L 2?NBDG 的情況相比，并無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.24）。因此，選擇2?NBDG 的孵育濃度為150 μmol/L，用于后續(xù)檢測。

圖1 不同2-NBDG 孵育濃度對葡萄糖吸收熒光檢測的影響Fig. 1 Effect of 2-NBDG concentration on the glucose uptake in A. niger

為了檢測2?NBDG 孵育時間是否影響黑曲霉孢子吸收2?NBDG 后的熒光強度，本研究對預(yù)培養(yǎng)孢子與2?NBDG 孵育后的熒光強度進行了跟蹤檢測。將預(yù)培養(yǎng)后的黑曲霉孢子與150 μmol/L 2?NBDG 孵育后，在2 h 與4 h 進行跟蹤取樣，然后采用熒光顯微成像與流式細胞儀來檢測黑曲霉孢子對2?NBDG吸收的熒光強度。結(jié)果如圖2 所示，隨時間的增加，預(yù)培養(yǎng)后的黑曲霉孢子吸收2?NBDG 后可檢測到的熒光強度逐漸增加。黑曲霉孢子與2?NBDG 孵育2 h 后，黑曲霉孢子出現(xiàn)可檢測到的熒光信號，但仍然有部分孢子的熒光信號較弱。在流式細胞檢測中，孵育2 h 后的可檢測到的平均熒光強度從0 h 時的40.1±2.7 增加到609.5± 4.5，進入強熒光區(qū)域（Q2,FITC?H>103）的孢子比例增長到17.4%。當(dāng)2?NBDG孵育時間增加至4 h 時，孢子中熒光信號進一步增強，在所檢測的10 萬個孢子中，29.6%的孢子出現(xiàn)較強的熒光信號（Q2, FITC?H>103），平均熒光強度達1 877.0±2.5，這說明與2?NBDG 孵育4 h 后，通過流式細胞儀可有效對孢子吸收2?NBDG 后產(chǎn)生的熒光信號。同時，孢子的顯微成像檢測表明該處理后的孢子處于未萌發(fā)未產(chǎn)生菌絲的狀態(tài)，因此可保證其在流式細胞儀中的順利檢測。綜合考慮孢子的狀態(tài)與熒光信號，因此選取4 h為黑曲霉孢子與2?NBDG孵育時間，用于后續(xù)檢測。

圖2 不同2-NBDG 孵育時間對葡萄糖吸收熒光檢測的影響Fig. 2 Effect of 2-NBDG incubation time on the glucose uptake fluorescence detection in A. niger

2.2 黑曲霉葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白MstC及其突變體的葡萄糖轉(zhuǎn)運能力檢測

雖然有文獻預(yù)測MstC 可能屬于低親和葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，但并未系統(tǒng)檢測MstC 的轉(zhuǎn)運活性。為檢測MstC 的轉(zhuǎn)運能力，本文首先以無糖轉(zhuǎn)運蛋白酵母菌株EBY4000 為宿主，構(gòu)建了黑曲霉MstC 的酵母重組菌株EBY.MstC，然后檢測EBY.MstC 在不同濃度葡萄糖下的生長情況。酵母菌株EBY4000 由于敲除了內(nèi)源的所有己糖轉(zhuǎn)運蛋白，而無法在以己糖為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基上生長，僅能在麥芽糖培養(yǎng)基上生長。因此，導(dǎo)入外源葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白后的生長情況可用于表征外源葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運能力，酵母重組菌株生長越強，表明其外源轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運能力越強。如圖3 所示，MstC 的表達可使無糖轉(zhuǎn)運蛋白酵母菌株EBY4000 在葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，表明MstC 為葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白。同時，EBY.MstC 可在0.02%、0.2%與2%的不同葡萄糖濃度下生長，且在高葡萄糖濃度下生長顯著高于低葡萄糖濃度下的生長。這表明MstC 在不同葡萄糖濃度均可發(fā)揮葡萄糖轉(zhuǎn)運的作用。

圖3 酵母重組菌株EBY.MstC 在不同葡萄糖濃度下的生長情況Fig. 3 Effect of glucose concentration on the cell growth of recombinant E. coli strain EBY.MstC

2.3 黑曲霉低親和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白MstC及其突變體的葡萄糖攝取能力檢測

為檢測MstC 對黑曲霉葡萄糖吸收的影響，本研究利用組成型啟動子PgpdA構(gòu)建了MstC 的過表達菌株OE.MstC。通過基因型驗證后，采用本研究建立優(yōu)化的2?NBDG 葡萄糖吸收定量檢測方法，檢測了MstC 的過表達對黑曲霉葡萄糖吸收的影響。結(jié)果如圖4 所示，當(dāng)過表達菌株OE.MstC 的孢子預(yù)培養(yǎng)后與2?NBDG 孵育后，與出發(fā)菌株D353.8 相比，所檢測的孢子具有更強的熒光信號。進一步流式細胞的定量分析發(fā)現(xiàn)，在過表達菌株OE.MstC 所檢測的105個孢子中有41.9%的孢子具有較強的熒光信號（Q2,FITC?H>103），而出發(fā)菌株D353.8 的強熒光的孢子比例為24.9%。同時，過表達菌株OE.MstC 平均熒光強度達4 359.5±12.5，顯著高于出發(fā)菌株D353.8（P為0.025），是出發(fā)菌株D353.8 平均熒光強度的2.44 倍。這表明MstC 在黑曲霉葡萄糖吸收中起重要的作用。

圖4 黑曲霉MstC 過表達菌株的葡萄糖吸收能力檢測Fig. 4 Glucose uptake capacity detection based on MstCoverexpressed strain A. niger

2.4 黑曲霉葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白MstC的關(guān)鍵活性氨基酸的預(yù)測與鑒定

為鑒定MstC 中起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基，本研究首先利用TMHMM 預(yù)測了MstC 的跨膜螺旋，如圖5 所示，MstC 具有12 個跨膜螺旋，N?端與C?端均位于細胞質(zhì)中。結(jié)合在粗糙脈孢霉（Neurospora crassa）葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白關(guān)鍵氨基酸的鑒定與多序列比對分析，本研究預(yù)測發(fā)現(xiàn)，與粗糙脈孢霉葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白關(guān)鍵氨基酸相對應(yīng)的氨基酸位點，即位于MstC 的第4 個跨膜螺旋與第5 個跨膜螺旋之間188 位的精氨酸Arg188 可能為影響MstC 葡萄糖轉(zhuǎn)運功能的關(guān)鍵氨基酸。為鑒定這個氨基酸殘基，本研究構(gòu)建了該位點的突變體MstCR188K及其酵母重組菌株EBY.MstCR188K。當(dāng)在0.02%、0.2%與2%的不同葡萄糖濃度下進行培養(yǎng)時，酵母重組菌株EBY.MstCR188K均無法生長，與僅轉(zhuǎn)化空載體的陰性對照菌株EBY.pRS 具有同樣的表型。這表明MstC 中R188K 的突變直接導(dǎo)致MstC 葡萄糖轉(zhuǎn)運能力的喪失，即Arg188 為影響MstC 葡萄糖轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵氨基酸位點。

為進一步在黑曲霉中驗證這一結(jié)果，本文構(gòu)建了MstC 突變體MstCR188K的黑曲霉過表達菌株OE.MstCR188K，并采用本文建立的2?NBDG 葡萄糖吸收定量檢測方法，對黑曲霉過表達菌株OE.MstCR188K進行葡萄糖吸收能力的定量檢測。結(jié)果如圖6 所示，當(dāng)MstC 突變體的過表達菌株OE.MstCR188K的孢子預(yù)培養(yǎng)后與2?NBDG 孵育后，其所檢測到的熒光信號與出發(fā)菌株D353.8 無顯著差異（P為0.13），其孢子的平均熒光強度為1 553.5±12.5；但顯著低于野生型MstC 的過表達菌株OE.MstC 的平均熒光強度（P為0.005 7）。這表明MstC 的Arg188 在葡萄糖轉(zhuǎn)運中起到重要的作用，是決定MstC 葡萄糖吸收的關(guān)鍵氨基酸位點。

圖6 黑曲霉MstC 突變體過表達菌株OE.MstCR188K 的葡萄糖吸收檢測Fig. 6 Glucose uptake capacity detection of A. niger MstC point mutant over-expressed strain OE.MstCR188K

3 討論

黑曲霉等絲狀真菌是重要的有機酸與酶制劑工業(yè)生產(chǎn)菌株［1］，具有較為復(fù)雜的葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。作為重要的碳源與信號分子，葡萄糖的攝入吸收直接影響黑曲霉的發(fā)酵生產(chǎn)性能，因此葡萄糖攝入吸收的研究對理解黑曲霉生長發(fā)育特性與改造優(yōu)化較為重要。本研究利用葡萄糖衍生物2?NBDG 建立了黑曲霉葡萄糖吸收能力的定量檢測方法，并利用該方法鑒定了黑曲霉葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白MstC 及其突變體對黑曲霉葡萄糖吸收的影響。

熒光標(biāo)記的葡萄糖衍生物2?NBDG 已在哺乳動物細胞與酵母細胞的葡萄糖吸收能力檢測中得到應(yīng)用［9,11］，被細胞吸收后，可被己糖激酶磷酸化而駐留在細胞內(nèi)，釋放的熒光信號可表征細胞葡萄糖吸收能力，具有檢測方便、分辨率高且無輻射等優(yōu)勢。但由于絲狀真菌具有復(fù)雜的菌絲形態(tài)［16］，其菌絲體難以直接進行熒光檢測。針對這一問題，絲狀真菌的單倍體孢子［14］或萌發(fā)的孢子［17］分別被用于進行流式細胞檢測，來定量細胞的熒光強度。在本研究建立黑曲霉葡萄糖吸收定量檢測方法的過程中發(fā)現(xiàn)，雖然萌發(fā)后的孢子長出菌絲雖然可以吸收2?NBDG在細胞內(nèi)產(chǎn)生明顯的細胞信號，但由于在預(yù)培養(yǎng)的過程中，孢子存在萌發(fā)速度的差異，導(dǎo)致不同菌絲間的熒光信號差異較大，且在流式細胞分析中可能會形成相互聚集的菌絲，而導(dǎo)致無法正常檢測。本研究采用預(yù)培養(yǎng)4 h 的孢子來進行熒光定量分析，此時的孢子處于吸水膨脹的階段，但還未長出菌絲，從而保證樣品間熒光定量分析的準(zhǔn)確性。預(yù)培養(yǎng)的孢子與2?NBDG 孵育時間越長，所檢測的細胞內(nèi)熒光強度越高。但由于需同時考慮孵育后孢子的狀態(tài)，因此在判斷最佳孵育時間時，需要跟蹤檢測孢子在孵育過程的萌發(fā)狀態(tài)。例如，本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)預(yù)培養(yǎng)的孢子與2?NBDG 孵育4 h 時，所檢測的孢子具有明顯的熒光信號，且在不同樣品進行檢測時具有較好的重復(fù)性，因此黑曲霉孢子與2?NBDG 的最佳孵育為4 h 用于黑曲霉葡萄糖吸收定量檢測。

絲狀真菌多具有復(fù)雜的雙親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)［3］。在粗糙脈孢霉中，Hgt1 與Hgt2 為高親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的關(guān)鍵組分，而Glt1 為低親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的主要組分，兩個不同葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)具有不同轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控模式，從而在不同葡萄糖濃度下發(fā)揮作用［18］。在黑曲霉中，Vankuyk 等［5］鑒定了MstA 為首個鑒定的高親和力轉(zhuǎn)運蛋白，但其敲除后黑曲霉仍可正常生長，表明葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)較為復(fù)雜［6］。J?rgensen 等［6］發(fā)現(xiàn)在批次培養(yǎng)中高親和力轉(zhuǎn)運蛋白MstA 并不表達，而另一個轉(zhuǎn)運蛋白MstC 則具有較為顯著的表達，推測MstC 與MstA具有不同的表達模式，推測MstC 可能為低親和力轉(zhuǎn)運蛋白，但并未提供直接的實驗證據(jù)。本文對MstC與不同來源的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白進行多序列比對分析與進化分析時發(fā)現(xiàn)，MstC 與低親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的同源性更高。在無己糖轉(zhuǎn)運蛋白酵母中的葡萄糖轉(zhuǎn)運活性檢測發(fā)現(xiàn)，MstC 在不同葡萄糖濃度下均可轉(zhuǎn)運葡萄糖，與高親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白僅在低葡萄糖濃度下發(fā)揮作用顯著不同。由此可見，MstC為黑曲霉低親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的主效組分。當(dāng)在黑曲霉中，采用強組成型啟動子PgpdA來過表達MstC 時，可使黑曲霉葡萄糖轉(zhuǎn)運能力提高至出發(fā)菌株的2.44 倍。這與MstC 同糖酵解途徑關(guān)鍵酶的過表達可提高黑曲霉蘋果酸轉(zhuǎn)化率的結(jié)果（從1.27 mol/mol 提高到1.64 mol/mol［7］）相一致，表明MstC可用于黑曲霉葡萄糖吸收轉(zhuǎn)運強化的重要改造靶點。

葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白中活性氨基酸是影響轉(zhuǎn)運能力的關(guān)鍵，比如釀酒酵母Hxt1 位于第8 個跨膜螺旋的N370A 會導(dǎo)致轉(zhuǎn)運能力的喪失［9］。在粗糙脈孢霉中，低親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白Glt1 中，位于第4 個跨膜螺旋與第5 個跨膜螺旋之間的保守精氨酸Arg167的點突變R167K 均會導(dǎo)致其葡萄糖轉(zhuǎn)運活性的喪失［18］。為鑒定黑曲霉MstC 中的關(guān)鍵氨基酸位點，本文通過多序列比對鑒定出這兩個跨膜螺旋之間的保守氨基酸Arg188。該位點的單點突變R188K 也導(dǎo)致MstC 葡萄糖轉(zhuǎn)運能力的喪失，當(dāng)R188K 在黑曲霉中進行過表達時，其葡萄糖轉(zhuǎn)運能力與出發(fā)菌株基本一致，無顯著差異。這說明黑曲霉葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白MstC 的Arg188 是決定葡萄糖轉(zhuǎn)運活性的關(guān)鍵氨基酸。目前，對于該保守精氨酸影響轉(zhuǎn)運蛋白的葡萄糖吸收的具體機制還尚未有報道。考慮到該位點處于第4 個跨膜螺旋與第5 個跨膜螺旋之間的細胞質(zhì)側(cè)，該位點的突變可能會使轉(zhuǎn)運蛋白跨膜螺旋的構(gòu)象改變，進而影響整個轉(zhuǎn)運蛋白的跨膜通道的結(jié)構(gòu)，有可能進一步導(dǎo)致轉(zhuǎn)運蛋白無法識別胞外的葡萄糖或者使葡萄糖無法通過跨膜通道。

4 結(jié)論

本研究利用葡萄糖衍生物2?NBDG 建立了黑曲霉葡萄糖吸收定量檢測方法，并確立2?NBDG 的最佳使用濃度與孵育時間。通過MstC 的過表達使黑曲霉的葡萄糖吸收能力提高1.44 倍，同時發(fā)現(xiàn)R188K 的點突變會導(dǎo)致MstC 葡萄糖轉(zhuǎn)運活性的喪失，Arg188 位點為MstC 的關(guān)鍵活性氨基酸。本研究不僅為絲狀真菌葡萄糖吸收的定量研究提供了切實可行的技術(shù)方法，還揭示了MstC 及其關(guān)鍵突變體對黑曲霉葡萄糖吸收的作用，為黑曲霉葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的認識與開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。