白色念珠菌鑒定方法學(xué)比較及流行病學(xué)研究

陳 瑤 鄭才斌

福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院檢驗科，福建南平 353000

白色念珠菌（Candida albicans）是一種常見的機會致病菌，常寄生在正常人的皮膚表面、口腔、胃腸道、陰道黏膜等位置而不發(fā)生疾病[1-2]。近年來，由于社會老齡化問題愈來愈嚴重、多種廣譜抗生素的濫用、人體免疫功能下降等原因，導(dǎo)致感染白色念珠菌的人數(shù)逐年升高[3-4]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌是真菌感染常見致病菌，同時也是導(dǎo)致院內(nèi)獲得性念珠菌感染的主要病原體[5-6]。目前有很多方法可用于鑒定白色念珠菌[7-8]，包括基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser-desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列分析方法。MALDI-TOF MS 作為一種新興的微生物蛋白圖譜鑒定系統(tǒng)，因其具有快速檢測的優(yōu)勢，近年來逐漸受到廣泛關(guān)注[9]。分析比較不同科室分離的白色念珠菌的親緣關(guān)系，可以清楚的看出它的傳播特點和流行情況，為有效抑制真菌擴散與感染爆發(fā)提供依據(jù)。因此，準(zhǔn)確、快速地診斷念珠菌感染以及對其進行流行病學(xué)調(diào)查，對于預(yù)防和治療侵襲性真菌感染具有重要的臨床價值。本研究通過回顧性分析2011 年1 月至2016年12 月臨床無菌部位分離的白色念珠菌，分別用不同方法鑒定并進行比較分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

回顧性分析2011 年1 月至2016 年12 月福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院從臨床無菌部位（血液、腦脊液、胸腹水、穿刺液、引流液等）分離出的173 株白色念珠菌，均為各個科室送檢的血培養(yǎng)陽性念菌株；均進行同樣的方式檢驗；將同一患者同一部位檢出的標(biāo)本或者同一患者不同部位反復(fù)檢出的相同標(biāo)本剔除，記錄好患者的基本資料和菌株信息。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 將收集到的菌株進行復(fù)蘇，沙保羅瓊脂平板在35℃孵育箱培養(yǎng)24 ～48 h，挑選菌落進行MALDI-TOF MS（德國布魯克公司）鑒定和ITS 測序鑒定。

1.2.2 同源性分析

1.2.2.1 多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST） （1）引物合成：從http://www.mlst.net/網(wǎng)站中獲取7 個管家基因位點的引物信息，委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。引物信息見表1。

表1 白色念珠菌7個管家基因的片段長度和引物序列

用以上引物進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增，并行瓊脂糖凝膠電泳，再將擴增后的陽性產(chǎn)物送至鉑尚生物技術(shù)有限公司進行測序，就可得到菌株的序列型（sequence typing，ST 型）和基因位點分型。

（2）系統(tǒng)發(fā)育分析：①基于位點序列的系統(tǒng)發(fā)育分析。用clustalX 軟件，將上述測序數(shù)據(jù)進行比對，然后用MEGA4 軟件進行菌株的序列多重比對，最后用鄰接法、最大簡約法等構(gòu)建進化樹。②基于位點型別的系統(tǒng)發(fā)育分析。用eBURST 的方法，將上述得到的7 個管家基因的基因位點型別進行聚類分析，至少有4 個基因位點相同的型別可分到同一eBURST 群中。

1.2.2.2 MALDI Biotyper 同源性分析 （1）聚類分析[主譜圖預(yù)測（main spectra projection，MSP）]：125 株菌株可以生成125 個MSP，Selected MSP 窗口下選中全部MSP，右擊MSP Dendrogram，即可生成聚類分析圖。

（2）主成分分析（principal compontent analysis，PCA）：分析菌株的原始數(shù)據(jù)，結(jié)果用View Clustering 圖形顯示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以[n（%）]表示，用χ2檢驗，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ITS測序結(jié)果

通過ITS 測序鑒定后，173 株白色念珠菌只有125 株鑒定準(zhǔn)確，PCR 電泳圖見圖1。

2.2 不同鑒定方法的結(jié)果比對

通過不同方法鑒定后，173 株白色念珠菌只有125 株鑒定準(zhǔn)確，結(jié)果見表2。

表2 不同鑒定方法的結(jié)果比較

2.3 白色念珠菌的菌株分布特征

用上述方法鑒定準(zhǔn)確的125 株白色念珠菌，分別來自125 例不同患者，男83 例（83/125，66.40%），女42 例（42/125，33.60%），年齡中位數(shù)為59 歲，平均（51.35±6.54）歲。引流液和血液是標(biāo)本來源中最多的兩種類型，分別占43 例（43/125，34.40%）和40 例（40/125，32.00%），最少的為腦脊液（1/125，0.80%）。科室分布中以重癥醫(yī)學(xué)科占最多有47 例（47/125，37.60%），排在第二的為基本外科占21 例（21/125，16.80%）。

2.4 MLST分型

125 株白色念珠菌經(jīng)MLST 分型后可得到61 個序列型（ST 型），其中最多的序列型為ST3160（8 株）和ST1474（9 株），其次是ST2059（7 株）和ST1450（7株）。在7 個管家基因位點中，VPS13 基因與SYA1基因依次分出24 個和19 個型別，分型效率居前兩位，ACC1 基因分出8 個型別，分型效率最低。

3 討論

多年來，深部真菌一直是院內(nèi)感染的關(guān)鍵致病微生物之一。對年齡分布的分析表明，60 ～79 歲年齡段的患者數(shù)量最多，占總數(shù)的一半以上，其中60 ～69 歲患者占比高達24.80%。這一趨勢與已有文獻的研究結(jié)果一致[10-11]，強調(diào)了老年人更容易感染白色念珠菌的事實。這一現(xiàn)象可以追溯到多個因素：首先，老年人隨著年齡增長，各個器官系統(tǒng)的功能逐漸減弱，是感染高發(fā)群體；其次，老年人通常伴隨多種基礎(chǔ)性疾病，可能服用影響免疫的藥物，或因住院時間較長而接受侵入性操作，這些因素都導(dǎo)致免疫功能的下降，促使真菌在體內(nèi)滋生，引發(fā)二次感染[12]。值得特別強調(diào)的是，在本研究中，源自血液感染的白色念珠菌感染占比高達32.00%。根據(jù)報道[13]，真菌血癥病死率最高可超過70%，早期及時對疑似感染患者行真菌鏡檢及培養(yǎng)是挽救生命體的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)白色念珠菌感染的發(fā)病率在不同臨床科室之間存在差異，其中重癥醫(yī)學(xué)科的發(fā)病率最高，達到37.60%，這與先前的文獻報道[14]一致。在重癥醫(yī)學(xué)科，白色念珠菌高發(fā)的主要原因是醫(yī)源性因素，如氣管插管、中心靜脈導(dǎo)管的置入、留置導(dǎo)尿管等侵入性操作，外科大手術(shù)等。此外，基本外科科室中，肝膽外科檢出率也相對較高，通常伴隨創(chuàng)傷性大手術(shù)。因此，迫切需要尋找快速而準(zhǔn)確的鑒定方法，以便對真菌感染進行診斷和治療。

本研究結(jié)果表明，針對致病性念珠菌的鑒定，MALDI-TOF MS 與ITS 測序結(jié)果相比，在準(zhǔn)確性上無明顯差異，但其具有更短的檢測時間和更低的成本，因此被視為一種迅速、便捷、精確的鑒定方法。有研究者認為，真菌科瑪嘉顯色培養(yǎng)存在技術(shù)局限，可能導(dǎo)致誤導(dǎo)性的鑒定和治療錯誤。原因分析：①不同人對顏色的分辨能力存在差異，導(dǎo)致對于類似的顏色，如紫紅色、藍色、藍灰色、藍紫色的識別存在差異；②常見菌株在科瑪嘉顯色后的顏色可能缺乏典型；③研究中所包含的不同菌種構(gòu)成比例不同；④少見與常見菌株的相似性。這反映了科瑪嘉顯色培養(yǎng)方法在結(jié)果解釋方面存在一定的主觀性，容易導(dǎo)致誤判情況的發(fā)生。因此，為了獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，需要將科瑪嘉顯色培養(yǎng)與其他鑒定方法結(jié)合使用[15-16]。

以MALDI-TOF MS 鑒定念珠菌，方法和原理完全有別于傳統(tǒng)方法，不再需要提取DNA 和測序。鑒別單個樣本所需的時間僅為幾分鐘，極大地提高了工作效率，成本低且操作簡便。在本研究中，此法鑒定念珠菌級別準(zhǔn)確度高達100.00%，并且與ITS 測序結(jié)果完全一致。這一結(jié)果與已有文獻研究[17]的結(jié)論一致，肯定了此法鑒定精準(zhǔn)、低成本、高效率的特點。

分子生物學(xué)技術(shù)在臨床和科研領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，通常被視為評估其他真菌鑒定方法的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。本研究通過ITS 測序準(zhǔn)確地確定了酵母樣真菌的種屬，覆蓋了12 個不同的真菌種類。盡管分子生物學(xué)技術(shù)在真菌鑒定方面取得了顯著進展，但仍存在一些挑戰(zhàn)。真菌基因數(shù)據(jù)庫尚不完善，同時，不同真菌DNA 提取尚缺乏統(tǒng)一規(guī)范，這可能導(dǎo)致較高的成本和較長的操作時間。因此，許多臨床實驗室目前尚未具備進行這項技術(shù)的實驗條件，相關(guān)研究尚處于實驗階段，尚未在臨床實踐中得到廣泛應(yīng)用。

綜上，MALDI-TOF MS 鑒定念珠菌準(zhǔn)確度與ITS 測序相近，而且具有更高的效率、較低的成本，是一種快速、便捷、準(zhǔn)確的致病性念珠菌鑒定方法。此外，兩種方法的同源性分析結(jié)果基本一致，這表明在臨床實驗室中廣泛采用MALDI-TOF MS 是合理的。然而，本研究也存在一些限制，包括樣本數(shù)量有限和研究時間較短。未來的深入研究將有助于更全面地驗證MALDI-TOF MS 在念珠菌鑒定中的準(zhǔn)確度。