Egl-9家族缺氧誘導(dǎo)因子1的研究進(jìn)展及與肺癌的關(guān)系

白巧會(huì) 艾 麗 蔣 絨 李永霞

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，云南昆明 650000

Egl-9 家族缺氧誘導(dǎo)因子1（Egl-9 family hypoxia inducible factor 1，EGLN1）作為氧傳感器在動(dòng)物及人體的大腦、腎臟、皮膚、心臟、肺等27 種器官中廣泛表達(dá)。在有氧條件下，EGLN1 羥基化缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）亞基，使HIF-1α 被E3-泛素連接酶復(fù)合物底物希佩爾林道蛋白（von Hippel-Lindau protein，pVHL）接頭特異性識(shí)別并使其泛素化，從而導(dǎo)致HIF-1α 蛋白酶體降解。相反，在缺氧時(shí)，EGLN1 不活躍，HIF-1α 亞基穩(wěn)定，激活導(dǎo)致細(xì)胞適應(yīng)缺氧的轉(zhuǎn)錄程序[1]。因此，EGLN1 被稱為在缺氧誘導(dǎo)因子介導(dǎo)的缺氧信號(hào)通路中起核心作用的蛋白。研究證實(shí)EGLN1 在人類許多腫瘤中表達(dá)，對(duì)腫瘤的生長、血管生成、轉(zhuǎn)移皆有影響，但具體機(jī)制尚不完全清楚。根據(jù)EGLN1 在不同的細(xì)胞環(huán)境下介導(dǎo)的調(diào)節(jié)反應(yīng)不同，EGLN1 又被定義為腫瘤抑制基因或癌基因[2-3]。

1 EGLN1的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制

1.1 EGLN1的結(jié)構(gòu)特征

EGLN1 包含一個(gè)具有7 個(gè)半胱氨酸殘基的N端鋅指結(jié)構(gòu)域、一個(gè)具有7 個(gè)保守的半胱氨酸的催化結(jié)構(gòu)域（殘基181-426）和一個(gè)具有1 個(gè)半胱氨酸的中間間隔區(qū)。研究提示，EGLN1 中的部分半胱氨酸殘基容易發(fā)生氧化，尤其是半胱氨酸殘基127、201 和208，而半胱氨酸殘基208、266、302、323 和/或326 的氧化可導(dǎo)致EGLN1 的自我失活，游離半胱氨酸卻可防止EGlN1 中對(duì)其功能至關(guān)重要的特定半胱氨酸殘基的氧化[4]。

1.2 EGLN1的作用機(jī)制

EGLN1、EGLN2 和EGLN3 分別編碼脯氨酰羥化酶結(jié)構(gòu)域（prolyl hydroxylase domain，PHD）中的PHD2、PHD1 和PHD3，因此EGLN1 也通常稱為PHD2。在常氧條件下，通過RNA 干擾沉默PHD2會(huì)增加HIF-1α 表達(dá)水平，而沉默PHD1 和PHD3均未觀察到這種效果，因此EGLN1 被認(rèn)為是關(guān)鍵的氧傳感器。EGLN1/HIF-1α 通路是缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在常氧條件下，EGLN1 以氧氣和2-羥基戊二酸作為底物，F(xiàn)e（Ⅱ）和抗壞血酸作為輔助因子，羥基化HIF-1α 的氧依賴性降解（oxygendependent degradation，ODD）結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致HIF-1α蛋白急劇降解。在缺氧期間，這種羥基化被阻斷，導(dǎo)致HIF-1α 積累，從而影響機(jī)體血管生成、紅細(xì)胞生成、糖酵解以及鐵代謝。

1.2.1 EGLN1 與紅細(xì)胞生成 紅細(xì)胞生成主要受促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）的調(diào)節(jié)，EPO的轉(zhuǎn)錄受到缺氧反應(yīng)途徑的嚴(yán)格調(diào)控以維持氧穩(wěn)態(tài)，而HIF-α 亞基的第一個(gè)特征異構(gòu)體HIF-1α 被認(rèn)為是調(diào)控EPO 合成的主要HIF-α 異構(gòu)體。研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠的PHD2 導(dǎo)致EPO 的增高和紅細(xì)胞增多癥的發(fā)生，敲除腎間質(zhì)細(xì)胞（EPO 主要來源）的PHD2 則導(dǎo)致了顯著的紅細(xì)胞增多癥，而PHD2 是引起HIF-1α 羥基化的主要因子，提示EGLN1 基因的種系缺陷可能通過減少HIF-1α 的羥基化導(dǎo)致EPO 過表達(dá)，從而引起繼發(fā)性遺傳性紅細(xì)胞增多癥[5]。大量研究提示，血紅蛋白濃度、血氧飽和度也與EGLN1 的表達(dá)顯著相關(guān)[6-8]。血紅蛋白是紅細(xì)胞中攜帶氧氣的主要成分，血氧飽和度是動(dòng)脈血中氧氣與血氧飽和度結(jié)合程度的指標(biāo)，因此推測血紅蛋白濃度、血氧飽和度與EGLN1 的關(guān)系與EGLN1調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成作用有一定的聯(lián)系，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

1.2.2 EGLN1 與糖酵解 在有氧條件下線粒體中丙酮酸的分解是大多數(shù)細(xì)胞的能量來源，而在可用氧氣減少后，細(xì)胞將新陳代謝轉(zhuǎn)向無氧糖酵解。在轉(zhuǎn)錄水平上將有氧代謝轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧代謝的關(guān)鍵因素之一是HIF-1α，而HIF-1α 的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性主要受EGLN1 的調(diào)節(jié)。Guentsch 等[9]研究發(fā)現(xiàn)敲低PHD-2 的巨噬細(xì)胞HIF-1α 蛋白穩(wěn)定化，HIF 靶基因丙酮酸脫氫酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK1）的表達(dá)增強(qiáng)，導(dǎo)致丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）磷酸化，PDH 失活，細(xì)胞代謝向糖酵解轉(zhuǎn)變。因此EGLN1 可能通過調(diào)控HIF-1α/PDK1 途徑影響細(xì)胞糖酵解。

1.2.3 EGLN1 與鐵代謝 EGLN1 編碼的PHD2 是一種氧/鐵傳感器，屬于2-氧代戊二酸（2-Oxoglutaric acid，2-OG）依賴性雙加氧酶超家族。哺乳動(dòng)物中的鐵調(diào)節(jié)蛋白2（iron regulatory protein 2，IRP2）可被2-OG 依賴性雙加氧酶特異性抑制劑二甲基草甘氨酸穩(wěn)定。有研究提示，HIF-1α 也是一種鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)蛋白[10]。因此，EGLN1 很可能通過下調(diào)HIF-1α和IRP2 抑制鐵代謝。腦鐵代謝功能障礙，特別是黑質(zhì)中的鐵積累，通過增加氧化應(yīng)激、損害泛素蛋白酶體系統(tǒng)和α-突觸核蛋白聚集促進(jìn)帕金森病的發(fā)生。Chiang 等[11]通過對(duì)EGLN1 基因的c.380 G＞C（p.C127S）變異體在臺(tái)灣帕金森患者中作用的研究，發(fā)現(xiàn)EGLN1 的保護(hù)性C127S 變異體與降低帕金森病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。

2 EGLN1在腫瘤中的表達(dá)及意義

2.1 抑制腫瘤血管形成

腫瘤的快速生長需要新生毛細(xì)血管為其提供足夠的氧氣和營養(yǎng)。Chan 等[12]研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中，與鄰近正常結(jié)直腸組織相比，腫瘤中PHD2 的mRNA 和蛋白質(zhì)水平均降低。敲低PHD2 的結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116）條件培養(yǎng)基有明顯的體外血管形成，而未敲低PHD2 的對(duì)照HCT116 細(xì)胞條件培養(yǎng)基卻無體外血管形成，且PHD2 被敲低的HCT116細(xì)胞條件培養(yǎng)基中促血管生成因子血管生成素（angiopoietin，ANG）和白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）蛋白水平升高。在PHD2 沉默的細(xì)胞中，核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活性升高，而IL-8 是一種特征明確的NF-κB 靶標(biāo)，ANG 的啟動(dòng)子也可與NF-κB 結(jié)合，這些結(jié)果提示EGLN1 可能通過影響NF-κB/ANG、IL-8 信號(hào)通路抑制腫瘤血管形成。

2.2 促進(jìn)p53泛素化

腫瘤蛋白p53 被稱為基因組的守護(hù)者，與腫瘤發(fā)生、自我更新、分化和重編程中的可塑性有關(guān)。研究提示，p53 的缺失或突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞去分化和獲得癌干細(xì)胞特性[13]。Sun 等[14]研究提示EGLN1的表達(dá)與鼻咽癌患者的腫瘤臨床分期呈正相關(guān)，EGLN1 的過表達(dá)可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移，誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞干細(xì)胞樣表型，降低鼻咽癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，并進(jìn)一步證實(shí)了其內(nèi)部機(jī)制是EGLN1 與p53 的相互作用促進(jìn)了泛素化酶系統(tǒng)介導(dǎo)的p53 破壞，并以羥化酶依賴性方式減少了p53 途徑的激活。

2.3 羥基化HIF-1α抑制VHL與其他底物結(jié)合

VHL 是一種重要的抑癌基因。EGLN1 羥基化的HIF-1α 是VHL 的重要底物，可與VHL 的其他底物競爭VHL 的結(jié)合位點(diǎn)，抑制VHL 與其他底物結(jié)合。Liu 等[15]研究發(fā)現(xiàn)Scm 樣含四mbt 域1（scm-like with four mbt domains 1，SFMBT1）可能為VHL 的另一種底物。EGLN1 羥基化的HIF-1α與VHL 結(jié)合，抑制了SFMBT1 與VHL 的結(jié)合，導(dǎo)致SFMBT1 的泛素化和降解減少，從而促進(jìn)了腎腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。Price 等[16]研究發(fā)現(xiàn)EGLN1的基因敲除和小分子抑制降低了卵巢癌腫瘤細(xì)胞的生長并抑制了腫瘤增殖，HIF-1α 低表達(dá)的癌癥對(duì)EGLN1 治療無反應(yīng)，而HIF-1α 高表達(dá)的部分患者會(huì)有反應(yīng)，提示EGLN1 的促癌作用表現(xiàn)出很強(qiáng)的HIF 依賴性。

盡管EGLN1 是一種對(duì)HIF 通路具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的氧傳感器，但它也與一些其他非HIF 蛋白的調(diào)節(jié)有關(guān)，例如表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）[17]、NF-κB[18]、N-myc下游調(diào)節(jié)基因3（N-myc downstream-regulated gene 3，NDRG3）[19]。EGLN1 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、頭頸癌、腎癌、肝癌和肺癌中通常上調(diào)，但在結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌中可能下調(diào)[20]。因此EGLN1 在癌癥進(jìn)展中的作用仍存在爭議，考慮與其在不同細(xì)胞環(huán)境下具有多種功能有關(guān)。

3 EGLN1與肺癌的關(guān)系

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見的癌癥，也惡性程度最高的腫瘤之一。然而，肺癌的發(fā)病機(jī)制和預(yù)后標(biāo)志物均不完全清楚。Chen 等[21]利用TCGA 和GEO數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)13 個(gè)與肺癌生存顯著相關(guān)的基因，其中8 個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因（CBFA2T3、DENR、EGLN1、FUT2、FUT4、PCDH7、PHF14 和STX3）中6 個(gè)基因可作為獨(dú)立的肺癌預(yù)后標(biāo)志物，CBFA2T3 和STX3是保護(hù)基因，而DENR、EGLN1、FUT4 和PCDH7 是危險(xiǎn)基因。EGLN1 作為肺癌相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因與腫瘤增殖和炎性浸潤有關(guān)，在肺癌中具有潛在功能和預(yù)后價(jià)值。

鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的非凋亡性細(xì)胞死亡模式，在腫瘤生物學(xué)和治療中發(fā)揮重要作用，激活鐵死亡可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡，染色質(zhì)重塑蛋白淋巴特異性解旋酶（lymphoid-specific helicase，LSH）通過促進(jìn)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因在癌變過程中發(fā)揮重要的鐵死亡抑制劑的作用。Jiang 等[22]研究提示，LSH 在肺癌中作為致癌基因起作用，而EGLN1 可通過抑制HIF-1α 誘導(dǎo)LSH 表達(dá)。Lanikova 等[23]發(fā)現(xiàn)選定的西藏EGLN1/PHD2 單倍型與肺癌之間存在顯著關(guān)聯(lián)，其發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加兩倍。

EGLN1 上調(diào)與非小細(xì)胞肺癌的不良預(yù)后相關(guān)[24]。然而，非小細(xì)胞肺癌的主要組織學(xué)亞型肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鱗狀細(xì)胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）在分子和臨床特征上存在顯著差異。Xu 等[25]研究發(fā)現(xiàn)LUAD和LUSC 患者癌組織中EGLN1 表達(dá)水平均高于其各自相鄰的正常組織。然而，Kaplan-Mei-er 生存曲線顯示，與低表達(dá)組相比，高EGLN1 表達(dá)的LUAD 患者總生存期（overall survival，OS）和無復(fù)發(fā)生存期（relapse-free survival，RFS）顯著縮短，但在LUSC 患者中卻無這些差異。提示EGLN1 基因的高表達(dá)可能僅作為LUAD 患者預(yù)后不良有價(jià)值的生物標(biāo)志物。

為深入了解EGLN1 在肺腺癌發(fā)生中的作用，Reggiani 等[26]評(píng)估了EGLN1 在（TCGA）-LUAD隊(duì)列和其所在研究所的生物庫中檢索到的一組患者樣本中的表達(dá)水平，結(jié)果腫瘤組織中EGLN1 基因的mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著高于周圍健康肺組織，高EGLN1 表達(dá)也與較差的預(yù)后相關(guān)，并且在Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rats arcomaviral oncogene homolog，KRAS）突變的患者中，OS 的差異更為明顯。用EGLN1 抑制劑莫立司他處理的肺腺癌細(xì)胞系均對(duì)莫立司他敏感，并且KRAS 突變的細(xì)胞系顯示出最高的靈敏度，這些提示EGLN1 基因在KRAS 突變的肺腺癌中具有更明顯的促癌功能。肺腺癌是最常見的肺癌亞型，而化療藥物和分子藥物對(duì)部分KRAS 突變的肺腺癌患者的治療幾乎是無效的，因此EGLN1 很可能成為KRAS 突變肺腺癌新的治療靶點(diǎn)。

4 展望

EGLN1 已被廣泛報(bào)道為導(dǎo)致HIF 泛素化和蛋白酶體降解的因子。HIF 在腫瘤中的功能已得到很好的表征，但對(duì)EGLN1 在腫瘤中功能的了解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。EGLN1 活性的調(diào)節(jié)，可能成為缺氧、鐵代謝異常等疾病，尤其是腫瘤疾病治療的切入點(diǎn)。EGLN1 在不同疾病中的作用機(jī)制不同，其mRNA 水平、蛋白水平、蛋白活性調(diào)控、穩(wěn)定性的相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和證實(shí)。肺癌的發(fā)病率不斷上升，病死率居高不下，給社會(huì)帶來巨大負(fù)擔(dān)。隨著對(duì)分子免疫機(jī)制的研究以及腫瘤對(duì)放化療敏感度的下降，靶向治療越來越受到人們的青睞。了解EGLN1在癌癥中的具體作用機(jī)制，將會(huì)為靶向藥物的研發(fā)提供新的思路。