六例KIF1A基因變異相關常染色體顯性遺傳神經(jīng)發(fā)育障礙患兒臨床和遺傳學分析

林靜琦，李牛，姚如恩，郁婷婷，王秀敏，王劍

1.上海交通大學醫(yī)學院附屬國際和平婦幼保健院中心實驗室，上海 200030

2.上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心遺傳分子診斷科，上海 200127

3.上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心內(nèi)分泌代謝科，上海 200127

KIF1A基因位于2 號染色體q37.3 區(qū)域，編碼一種神經(jīng)元特異性ATP 依賴驅(qū)動蛋白；因可介導神經(jīng)軸突運輸囊泡、細胞器和蛋白質(zhì)復合物等，其對神經(jīng)元功能至關重要［1］。目前已知KIF1A基因變異可導致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括常染色體顯性遺傳發(fā)病的NESCAVS（OMIM#614255）、常染色體顯性或隱性遺傳發(fā)病的SPG30（OMIM#610357）以及常染色體隱性遺傳發(fā)病的HSN2C（OMIM#614213）。NESCAVS 是一種早發(fā)型兒童神經(jīng)退行性疾病，通常表現(xiàn)為全面發(fā)育遲緩，一方面是主要影響下肢的進行性痙攣所引起的行走困難，并可能導致獨立行走能力的喪失，另一方面是不同程度的智力發(fā)育遲緩、語言遲緩、學習障礙和/或行為異常；受累患者還可能合并皮質(zhì)性視覺障礙、視神經(jīng)萎縮、軸突周圍神經(jīng)病變、癲癇發(fā)作、自主神經(jīng)障礙、共濟失調(diào)和肌張力障礙等［2］。SPG30 則主要表現(xiàn)為雙側下肢痙攣和無力，伴有下肢反射亢進，下肢進行性僵硬和收縮，在部分復雜病例中還可能伴有其他神經(jīng)系統(tǒng)異常，如癲癇發(fā)作、智力障礙和周圍神經(jīng)病變等一系列異常［3］。而HSN2C 的特征是在兒童期進行性遠端感覺喪失，導致手指和腳趾潰瘍和截肢，患者還會出現(xiàn)遠端肌肉無力，主要影響下肢［4］。

目前，國內(nèi)數(shù)據(jù)庫中檢索到3例KIF1A基因變異相關病例報道［5-7］，患者表型不一。本研究對收治的6例KIF1A基因變異神經(jīng)發(fā)育障礙患兒的臨床特征及基因型進行分析，以期拓展這類疾病的基因譜和表型譜，并提高臨床醫(yī)生對這類疾病的認知。

1 對象和方法

1.1 對象

回顧性分析2018—2020 年在上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心就診的6例KIF1A基因變異患兒的臨床及基因檢測資料。6例均為臨床發(fā)病并尋求鑒定遺傳學病因患兒，其中男性4例，女性2例，確診年齡7月齡～18歲。本研究通過上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心倫理委員會審查（SCMCIRB-K2020060-1），所有檢查均獲得患兒父母知情同意。

1.2 儀器及試劑

SureSelect XT Human All Exon V6 試劑盒為美國Agilent 公司產(chǎn)品；M220 核酸打斷儀為美國Covaris 公司產(chǎn)品；NovaSeq 6000 測序儀為美國Illumina公司產(chǎn)品；ABI 3500測序儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.3 全外顯子組基因測序檢查基因變異

使用M220 核酸打斷儀將先證者基因組DNA打斷成150～200 bp 大小的片段，采用SureSelect XT Human All Exon V6 試劑盒進行外顯子組文庫構建及捕獲，NovaSeq 6000 測序儀進行高通量測序。利用美國SoftGenetics 公司NextGENe?軟件將測序數(shù)據(jù)與參考基因組（Human 37.3，SNP135）進行匹配比對，并使用上海閃譯生物科技有限公司TGexTM軟件分析基因變異；使用ABI 3500 測序儀對先證者及其家系成員對鑒定到的KIF1A基因變異進行桑格測序驗證。

1.4 生物信息學分析蛋白質(zhì)三維結構和變異的致病性

基于PDB 數(shù)據(jù)庫KIF1A 運動結構域的晶體結構（https：//www.rcsb.org/structure/2ZFI），采用Swiss model（https：//swissmodel.expasy.org/）軟 件對變異序列進行建模，并使用分子可視化軟件PyMOL（https：//pymol.org/）生成KIF1A 野生型蛋白質(zhì)和變異體的三維結構圖像。通過mCSM［8］（http：//biosig.unimelb.edu.au/mcsm/）、SAAFEC-SEQ［9］（http：//compbio.clemson.edu/SAAFEC-SEQ/index.php）和MUpro［10］（http：//mupro.proteomics.ics.uci.edu/）工具分析蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的變化。分別采用REVEL軟件［11］和Splice AI 軟件［12］對錯義突變和剪接突變的有害性進行評估，使用ACMG 聯(lián)合美國分子病理學協(xié)會頒布的遺傳變異分類標準與指南［13］對變異進行致病性分析。

2 結果

2.1 臨床特征

6 例患兒的臨床特征總結見表1。所有患兒均有不同程度的運動發(fā)育遲緩，其中4 例會走路的患兒存在步態(tài)異?；蛞姿さ?，例1尚不能獨坐，例2仍坐不穩(wěn)且不會走路；3例患兒同時合并智力發(fā)育遲緩。例1 和例2 同時存在目不追物以及癲癇或痙攣發(fā)作，而其余4 例暫未出現(xiàn)此類臨床異常。2例患兒存在肌張力異常，其中例2雙側肢體肌張力增高，例5下肢肌張力增高。3例有頭顱核磁共振記錄的患兒中，僅例2 存在兩側小腦半球腦溝裂增寬加深。6例患兒的血尿串聯(lián)質(zhì)譜檢測均未見異常。所有患兒父母未見相關臨床表現(xiàn)。

表1 6例KIF1A基因變異患兒臨床特征一覽Table 1 Clinical characteristics of 6 patients with variants in the KIF1A gene

2.2 基因檢測結果

6 例患兒共檢測到5個KIF1A基因雜合變異（NM_001244008.2），均未在gnomAD 對照數(shù)據(jù)庫（http：//gnomad.broadinstitute.org/）收錄。其中2例患兒檢出c.296C＞T（p.T99M）錯義突變，為KIF1A基因熱點突變；1 例患兒檢測到c.761G＞A（p.R254Q）錯義突變，亦有報道。其余3例患兒分別攜帶c.326G＞T（p.G109V）錯義突變、c.745C＞G（p.L249V）錯義突變和c.798+1G＞A 剪接突變（圖1），均未曾報道。桑格測序顯示6 例患兒的父母KIF1A基因均為正常野生型，提示所檢測到的變異均為新生突變（De novo）。結合臨床表型和基因檢測結果，6 例患兒均診斷為KIF1A基因變異導致的常染色體顯性遺傳神經(jīng)發(fā)育障礙。

圖1 3個KIF1A基因新發(fā)變異的桑格測序結果Figure 1 Sanger sequencing results of the three novel variants of KIF1A gene

2.3 KIF1A變異致病性分析

對首次報道的兩個錯義突變對應的蛋白質(zhì)（G109V和L249V）進行三維建模分析發(fā)現(xiàn)，109 位的甘氨酸（G）突變?yōu)槔i氨酸（V）后，將導致其與115 位的谷氨酰胺之間的氫鍵消失（圖2A）；249 位的亮氨酸（L）突變?yōu)槔i氨酸（V）后，會與218位的組氨酸形成一個新的氫鍵，并導致其與95位的丙氨酸之間的三個氫鍵消失兩個（圖2B）。通過比較變異體和野生型蛋白之間自由能變化的差值（ΔΔG）發(fā)現(xiàn)，G109V、L249V和R254Q變異均表現(xiàn)出蛋白穩(wěn)定性下降（表2）；雖然T99M 在不同工具ΔΔG 值預測上存在差異，但已有功能研究顯示該變異削弱了蛋白質(zhì)定位于神經(jīng)突起遠端的能力。此外，REVEL 軟件評估表明4 個錯義突變均為有害性變異（表2）。根據(jù)美國ACMG指南，c.296C＞T為“致病”，其余3個錯義突變?yōu)椤翱赡苤虏　薄?/p>

圖2 KIF1A蛋白新發(fā)錯義突變的三維分子結構建模Figure 2 The three-dimensional structure of the novel missense mutations of KIF1A protein

表2 KIF1A基因錯義突變的致病性分析Table 2 Pathogenicity analysis of the missense mutations in KIF1A

c.798+1G＞A 剪接突變位于14 號內(nèi)含子第一個堿基位置，Splice AI軟件預測可能導致KIF1A基因信使RNA剪接成熟過程中15號外顯子跳躍，并因此丟失66 個堿基（c.799_864 del），從而導致22個氨基酸的閱讀框內(nèi)整碼缺失（p.267_288 del）；三維建模分析表明該段氨基酸缺失將導致KIF1A蛋白運動結構域中一個α 螺旋結構的嚴重受損（圖3）。根據(jù)美國ACMG 指南，c.798+1G＞A 被判定為“可能致病”。

圖3 KIF1A 蛋白新發(fā)剪接突變可能導致的氨基酸缺失Figure 3 The three-dimensional structure of the novel splicing variant of KIF1A protein

3 討論

既往國內(nèi)已報道的KIF1A基因變異患者中，許鋼等［5］報道的c.110T＞C（p.I37T）雜合新生突變患兒雙下肢無力且力量逐年減弱、步態(tài)異常、下肢肌張力增高，診斷為SPG30；黃延等［6］報道的c.664A＞C（p.N222H）新生突變患兒智力語言發(fā)育遲緩、社交困難，診斷為孤獨癥譜系障礙；沈茹等［7］報道的c.914C＞T（p.P305L）雜合新生突變患兒智力語言發(fā)育遲緩、走路不穩(wěn)易摔倒、雙側足內(nèi)翻，看人時雙眼角膜向上、外斜視，頭顱核磁共振顯示雙側小腦半球體積減小、腦溝增寬加深，診斷為NESCAVS。本文表1的6例患兒中，例1、2 和4 符合NESCAVS 臨床診斷，而例3、5 和6 臨床特征更傾向SPG30。雖然國內(nèi)報道例數(shù)有限，但仍可見KIF1A基因變異所致臨床表型的復雜性。

基于KIF1A基因變異引起的臨床表型異質(zhì)性較強，且NESCAVS、SPG30 和HSN2C 的表型互有重疊，臨床難以作出精準分型，近年來已有文獻將其統(tǒng)一歸類為KIF1A基因相關神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?4］。有學者建議根據(jù)基因型（以表型作為參考）對KIF1A基因變異病例進行分類，而不是傳統(tǒng)的根據(jù)表型（以基因型作為參考）分類的模式；即將重點放在患者變異位點和特定表型上，而不是單純型或復雜型綜合征的診斷上［15］。這一分類依據(jù)已在部分變異位點得以驗證，如p.S58L、p.T99M、p.E253K 和p.T258M 變異的患者往往行走困難且伴有癲癇，而p.S69L、p.A255V、p.R350G等變異的患者主要表現(xiàn)為痙攣性截癱［14］。

KIF1A 蛋白包含由氨基端第1～361 個氨基酸殘基構成的運動結構域、第516～572 個氨基酸殘基構成的叉頭相關蛋白結構域和第1676～1774個氨基酸殘基構成的普列克底物蛋白同源結構域［16］。KIF1A 通過羧基端的普列克底物蛋白同源結構域高親和力且特異性結合脂質(zhì)囊泡中的磷脂酰肌醇，氨基端的運動結構域通過其下游的卷曲螺旋相互作用形成二聚體，利用ATP 的水解作為能量來源，將物質(zhì)從細胞體沿微管運送到神經(jīng)元外周末梢［17］。KIF1A 蛋白對神經(jīng)發(fā)育至關重要，其在腦和脊髓中呈高表達［18］；研究表明，KIF1A蛋白可調(diào)節(jié)小鼠海馬區(qū)突觸的發(fā)生和學習增強［19］，Kif1a缺失小鼠表現(xiàn)出嚴重的運動和感覺障礙，并在出生后1 d 左右死亡［20］。本研究鑒定的變異均發(fā)生在KIF1A 蛋白的運動結構域中，可能阻礙了驅(qū)動蛋白與微管的正確結合，導致其沿軸突的運動能力受損［21］。

c.296C＞T（p.T99M）是KIF1A熱點突變，此前已有至少9 例病例報道［16，21-25］。與本研究納入的2例患兒類似，受累患者往往表型較為嚴重，存在中度到極重度不等的智力障礙和發(fā)育遲緩，大多喪失行走能力，出現(xiàn)痙攣或癲癇癥狀，多有眼部異常如視神經(jīng)病變或萎縮，部分患者還可合并小頭畸形。Thr99 位于KIF1A 運動結構域高度保守的p 環(huán)共識ATP 結合位點，在原代大鼠海馬神經(jīng)元中的實驗顯示，與野生型比較，T99M 變異的KIF1A 遠端定位大大減少，整個細胞體和近端神經(jīng)元的聚集增加［22］。R254Q變異已在2例病例中報道，分別為一例8 歲男童（5 歲起?。?6］和一例5歲女童（2～3歲起?。?7］。與本研究中攜帶R254Q變異的患兒類似，3例患兒均癥狀較輕，盡管存在步態(tài)障礙，但能夠獨立行走，病程進展較慢。L249V 雖為本研究首次發(fā)現(xiàn)，但已有L249Q［21］和L249P［28］的病例報道，表型均比本研究中攜帶L249V 變異的患兒嚴重，除了共同存在的運動發(fā)育遲緩和痙攣，2 例已報道患兒還合并中等程度的智力障礙。此外，攜帶L249Q 變異的患兒行走需要輔助，伴有視神經(jīng)萎縮；攜帶L249P變異的患兒存在痙攣性截癱、全身性癲癇發(fā)作、眼震顫，興趣有限、溝通不暢，并且小腦萎縮。已報道的c.798+1G＞T 患兒存在中度痙攣步態(tài)［27］，但與本研究中c.798+1G＞A 變異患兒僅有運動發(fā)育遲緩和步態(tài)異常表現(xiàn)明顯不同的是，前者還存在興趣有限、社交困難等類似自閉癥譜系障礙的特征?？梢奒IF1A基因相同位置的不同變異可造成表型和嚴重程度的不同。

目前已鑒定到的KIF1A變異主要集中在運動結構域，且大部分源自散發(fā)病例；目前已報道的200 余例KIF1A基因變異患者中［2，15-16，27，29-30］，近70%為患兒自發(fā)新生突變。除上述少數(shù)變異位點外，大部分KIF1A基因變異尚未建立顯著的基因型-臨床表型關聯(lián)，仍需積累更多病例數(shù)據(jù)觀察。最近有假說提出了一種變異特異性的劑量效應：一些變異可能僅涉及遠端軸突順行運輸?shù)妮p微損傷，導致較輕微的表型；而另一些變異可能損害近端軸突及其他神經(jīng)元群體，導致嚴重的表型；少數(shù)已報道的功能喪失型變異會造成KIF1A 蛋白水平降低而導致運輸減少［3］。然而即使是同一變異的患者也存在臨床異質(zhì)性，或許需要考慮其他驅(qū)動蛋白的補償機制以及其他未知的遺傳或環(huán)境因素。

綜上所述，本研究總結分析了6例KIF1A基因變異致神經(jīng)發(fā)育障礙患兒，擴大了KIF1A基因變異相關疾病的基因型和臨床表型譜，為患者的臨床診斷和家系生殖遺傳咨詢提供了依據(jù)。

志謝研究得到國家重點研發(fā)計劃（2020YFA0804001）支持

AcknowledgementsThis work was supported by the National Key R&D Program of China (2020YFA0804001)

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of InterestsThe authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)