負(fù)載Wharton’s Jelly源間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體的水凝膠可促進(jìn)小鼠創(chuàng)面修復(fù)

徐崔博誠(chéng)，徐正保，余承洋，蔣祖福

臺(tái)州市中心醫(yī)院臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院肛腸科，浙江 臺(tái)州 318000

治療嚴(yán)重的皮膚創(chuàng)傷，如大面積皮膚傷口、糖尿病傷口和皮膚燒傷等，通常需要清創(chuàng)手術(shù)、補(bǔ)充生長(zhǎng)因子或使用生物活性敷料配合負(fù)壓治療［1］，但這些療法的治療效果對(duì)于許多患者來說往往并不令人滿意。免疫系統(tǒng)在皮膚創(chuàng)傷后的炎癥期和修復(fù)期都起著重要作用，免疫細(xì)胞和分泌的外泌體不僅直接參與創(chuàng)面修復(fù)階段，還通過旁分泌機(jī)制發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［2］。外泌體是一種由細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡，含有蛋白質(zhì)、DNA 和RNA［3］。近年研究證實(shí)，來自各種細(xì)胞的外泌體作為細(xì)胞間交流的信使參與了免疫反應(yīng)［4］，如間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體參與了抗原提呈、免疫激活和免疫抑制等免疫反應(yīng)［5］。

研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射的外泌體由于被單核吞噬細(xì)胞大量清除而導(dǎo)致半衰期較短，其治療效果因保留時(shí)間短暫而受到明顯限制，單純提供更多的外泌體并不能延長(zhǎng)其半衰期［6］。因此，目前需要開發(fā)一種新的方法來延長(zhǎng)外泌體的保留時(shí)間，以增強(qiáng)其療效。海藻酸鹽水凝膠由于具有良好的生物相容性，凝膠化過程溫和，而且其機(jī)械性能與細(xì)胞外基質(zhì)相似，因此在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［7］。將這種水凝膠注射到皮膚創(chuàng)面中，可為受損創(chuàng)面提供物理支持，從而增加疤痕厚度［8］。在最近的一項(xiàng)研究中，Shafei等［9］使用海藻酸鹽水凝膠作為生物活性物質(zhì)的載體，將裝載有脂肪干細(xì)胞來源的外泌體的凝膠注入皮膚創(chuàng)傷組織，發(fā)現(xiàn)凝膠可以延長(zhǎng)外泌體的保留時(shí)間，并增強(qiáng)外泌體對(duì)皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)作用。本研究將WEX 負(fù)載在海藻酸鈉水凝膠中，開發(fā)了一種可注射的基于海藻酸鈉的WEX 水凝膠，以期延長(zhǎng)WEX 的體內(nèi)保留時(shí)間，提高其在皮膚創(chuàng)傷中的修復(fù)效果，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞、試劑及儀器

20 只6～7 周齡雌性C57BL/6J 小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011］。所有涉及動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)均通過臺(tái)州市中心醫(yī)院機(jī)構(gòu)動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)審查（2020-02）。

巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞株購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所；WJMSC 為武漢普諾賽生命科技有限公司產(chǎn)品。胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液、DMEM/F12 培養(yǎng)基和RPMI-1640 培養(yǎng)基為Gibco 公司產(chǎn)品；巨噬細(xì)胞集落刺激因子為北京百普賽斯生物科技股份有限公司產(chǎn)品；ExoQuick-TCTM外泌體提取試劑盒為北京博邁斯生物科技有限公司產(chǎn)品；BCA 蛋白定量試劑盒、海藻酸鈉為Sigma 公司產(chǎn)品；CD9、CD86、CD81、CD206、Calnexin、VEGF 為Abcam 公司產(chǎn)品；HE染色試劑盒和Masson 三色染色試劑盒為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。大腸埃希菌（E.coliATCC 8099）和金黃色葡萄球菌（S.aureusATCC 6538）為上海魯微科技有限公司產(chǎn)品；CD31 一抗為武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

UV-2550 紫外分光光度計(jì)為島津公司產(chǎn)品；AR 1500ex 流變儀為TA Instruments 公司產(chǎn)品；S-3400I 型掃描電子顯微鏡為Hitachi 公司產(chǎn)品；NanoSight NS300 納米粒度分析儀為Malvern Panalytical 公司產(chǎn) 品 ；357 酶標(biāo)儀 為ThermoScientific 公司產(chǎn)品；GX35 倒置顯微鏡為Olympus 公司產(chǎn)品；FACSymphonyTMA3 流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

經(jīng)檢測(cè)，WJMSC無細(xì)菌、真菌、支原體和病毒污染，表達(dá)多種干細(xì)胞特異性標(biāo)志物，并具有良好的增殖和分化潛力。WJMSC 在含有10%無外泌體血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

巨噬細(xì)胞在含有10%血清、10 ng/mL 的巨噬細(xì)胞集落刺激因子、1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每隔一天更換1次。在第7天收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 WEX提取并鑒定

收集第3～5代WJMSC 的上清液，使用外泌體提取試劑按1∶5 的比例加入上清液中，在4 ℃下孵育過夜（12 h 以上），將樣品在室溫下以1500×g離心30 min，去除上清液。最后，用100～500 μL PBS重新懸浮所獲得的外泌體。

將上述提取的WEX 加入5×SDS 緩沖液［30 mmol/L Tris-Hcl（pH=6.8）、2% SDS、0.05%溴酚藍(lán)、12.5%甘油和2.5%巰基乙醇］中煮沸5 min。然后將20 μg WEX 加到10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠各個(gè)泳道中，將樣品轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用5%牛奶在室溫下阻斷1 h，加入適量CD9（稀釋度為1∶1000）和CD81（稀釋度為1∶500）一抗并在4 ℃孵育過夜。TBST 洗滌三次后，加入二抗（稀釋度為1∶10 000）室溫處理2 h，再加入DAB 顯色劑顯色，采用Bio-Rad 凝膠成像儀記錄蛋白條帶灰度并拍照。

1.4 制備WEX水凝膠和表征其物理特性

在室溫下，將海藻酸鈉粉末溶解在PBS 中，形成2%（w/v）海藻酸鈉溶液。為了確定最佳的海藻酸鈉水凝膠系統(tǒng)，使用不同濃度的氯化鈣溶液研究WEX 的控釋能力。將海藻酸鈉溶液分別與1%、2%（w/v）氯化鈣溶液以1∶4的體積比混合，形成海藻酸鈉水凝膠。然后將30 μg WEX 加入50 μL 海藻酸鈉溶液中，攪拌，形成含有WEX 的海藻酸鈉水凝膠。

WEX水凝膠經(jīng)真空冷凍干燥，取干品斷面真空噴金后使用掃描電子顯微鏡觀察水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，使用流變儀來評(píng)估水凝膠的流變行為。體外WEX釋放測(cè)試在37 ℃條件下溫和搖動(dòng)中進(jìn)行。將制備好的100 μL WEX 水凝膠轉(zhuǎn)移到200 μL PBS（pH=7.4）溶液中。每?jī)商烊コ锨逡海尤胄迈rPBS。然后用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定釋放到培養(yǎng)基中的WEX 質(zhì)量，進(jìn)而計(jì)算得到累積釋放的WEX質(zhì)量。某一時(shí)刻WEX的累積釋放率（%）=mt/m0×100%，式中mt代表t 時(shí)刻WEX 累積釋放質(zhì)量，m0代表凝膠中WEX總質(zhì)量。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞中CD86和CD206的表達(dá)

將巨噬細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種在24孔板中，分為空白對(duì)照組、水凝膠對(duì)照組、WEX對(duì)照組和WEX 水凝膠組，分別用PBS、海藻酸鈉水凝膠提取液、WEX 懸浮液（20 μg/mL）、WEX 水凝膠提取液（WEX 濃度為20 μg/mL）處理細(xì)胞并孵育24 h，收集細(xì)胞，并與Fc受體阻斷劑孵化，以減少非特異性抗體結(jié)合，細(xì)胞重新懸浮在染色緩沖液中，用熒光標(biāo)記的CD86 和CD206 抗體染色后，使用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 制備小鼠全層皮膚創(chuàng)傷模型及分組干預(yù)

將小鼠麻醉后俯臥在手術(shù)臺(tái)上，用電剪刀和脫毛蠟依次剃除背部區(qū)域的毛發(fā)后，用活檢穿孔器在每只小鼠背部打出直徑12 mm的皮膚全層圓形傷口。所有小鼠隨機(jī)分為三組，每組6只，分別為空白對(duì)照組（50 μL PBS）、WEX 對(duì)照組（30 μg WEX 加入50 μL PBS）和WEX 水凝膠組（30 μg WEX 封裝于50 μL 海藻酸鈉水凝膠）。所有藥物每日1 次局部涂抹于傷口部位。術(shù)后第0、3、6、9、12、15 天觀察傷口部位并拍照，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行殘余創(chuàng)面百分比分析，殘余創(chuàng)面百分比=第n天創(chuàng)傷面積/第0天創(chuàng)傷面積×100%

1.7 平板計(jì)數(shù)法評(píng)價(jià)WEX水凝膠的抗菌功效

將第3 天的小鼠皮膚組織用2 mL 無菌等滲氯化鈉溶液勻漿，將100 μL勻漿添加到革蘭陰性菌培養(yǎng)基（選擇性培養(yǎng)大腸埃希菌）和甘露醇鹽瓊脂培養(yǎng)基平板（選擇性培養(yǎng)金黃色葡萄球菌）。將平板置于37 ℃的生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行倒置培養(yǎng)24 h后，對(duì)平板上的菌落形成單位進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.8 HE染色觀察組織病理學(xué)變化

手術(shù)后15 d，采用頸椎脫位法對(duì)小鼠實(shí)施安樂死，解剖出傷口組織后立即用4%多聚甲醛固定48 h，然后用梯度乙醇脫水。石蠟包埋后將皮膚組織切成5 μm 的薄片，將切片用100%二甲苯脫蠟3 min，100%乙醇水化3 min，95%乙醇水化3 min，蘇木精染色5 min，去離子水洗滌5 min；用酸性乙醇（1%鹽酸溶液溶于70%乙醇溶液中）浸泡5次，并用去離子水沖洗，氨水處理后用去離子水沖洗；用伊紅溶液在室溫下染色1 min，梯度乙醇脫水（95%乙醇2 min，100%乙醚2 min）并用二甲苯清除（100%二甲苯30 min）。切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.9 Masson染色觀察組織病理學(xué)變化

經(jīng)脫蠟和水化后，切片在56 ℃下用Bouin 溶液處理15 min，18～26 ℃的水浴中冷卻5 min 后，室溫下使用蘇木精溶液染色5 min，用去離子水沖洗，用Biebrich 堿性品紅染色5 min，去離子水沖洗1 min；室溫下用磷鎢酸/磷鉬酸溶液處理5 min，置于苯胺藍(lán)溶液中5 min，用1%乙酸處理2 min，并通過不同濃度乙醇溶液（70%、80%、90%、100%）脫水，在二甲苯中清除5 min。所有切片在蔡司掃片機(jī)下進(jìn)行圖像采集，使用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析膠原蛋白沉積率。

1.10 免疫組織化學(xué)檢測(cè)組織中CD86、CD206和CD31的表達(dá)

術(shù)后第15 天用免疫組織化學(xué)檢測(cè)創(chuàng)面組織中巨噬細(xì)胞的極化情況。皮膚組織用5%甲醛固定過夜，采用梯度乙醇脫水法將組織脫水后包埋在石蠟中切片。組織切片用10 mmol/L 檸檬酸鈉緩沖液在94 ℃下修復(fù)15 min后，冷卻至室溫并用1%牛血清白蛋白密封30 min。隨后，分別用CD86、CD206和CD31一抗處理切片，再用生物素化標(biāo)記的二抗孵化，并用蘇木精重新染色。最后在光學(xué)顯微鏡下觀察染色切片。CD86、CD206和VEGF 在細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色，CD31 表達(dá)于細(xì)胞膜中呈棕黃色。隨機(jī)選擇20 個(gè)視野并在低倍鏡下拍照，采用Image-Pro Plus 6.0 圖像處理軟件分析CD86和CD206在腫瘤組織中的積分光密度值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)用于驗(yàn)證正態(tài)性，正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，使用單因素方差分析或雙因素方差分析進(jìn)行比較，Tukey 法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，P＜0.05（兩側(cè)）為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功提取WEX

掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示，WEX呈圓形或橢圓形（圖1）；WEX 的密度為1.34×109/mL，平均直徑為（118.0±21.7）nm。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果表明，分離的外泌體富含內(nèi)體四聯(lián)跨膜蛋白，如CD9 和CD81（外泌體陽性標(biāo)志物），而外泌體陰性標(biāo)志物Calnexin 蛋白在分離的外泌體中幾乎不存在（圖2）?？梢姀腤JMSC上清液中成功提取WEX。

圖1 電子顯微鏡下WEX圖像Figure 1 Electron microscopy image of WEX

圖2 WEX中外泌體相關(guān)標(biāo)志物的蛋白電泳圖Figure 2 Exosomal markersin WEX determined by Western blotting

2.2 WEX水凝膠表征結(jié)果

結(jié)果顯示，含1%氯化鈣溶液的水凝膠在7 d內(nèi)釋放了95%的WEX，且在最初的3 d 內(nèi)有明顯的爆發(fā)性釋放效果；而含2%氯化鈣溶液的水凝膠在7 d 內(nèi)只釋放了62%的WEX（圖3）。皮膚創(chuàng)傷的炎癥期和修復(fù)期主要發(fā)生在第1 周內(nèi)［1］。因此，選擇1%氯化鈣溶液制備的海藻酸鈉水凝膠進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 含不同濃度氯化鈣的WEX 水凝膠藥物釋放曲線Figure 3 Drug release profile of WEX-gel with different concentrations of CaCl2

對(duì)WEX 水凝膠的流變學(xué)特性進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，WEX水凝膠的儲(chǔ)能模量（G'）為（1541±36）Pa，遠(yuǎn)大于損耗模量（G″），見圖4。透射電子顯微鏡圖像顯示，WEX 水凝膠表面有許多孔隙，大小從50 到150 μm 不等，高分辨率圖像可以觀察到負(fù)載在WEX水凝膠中的外泌體顆粒（圖5）。

圖4 不同時(shí)間WEX 水凝膠的儲(chǔ)能模量（G'）和損耗模量（G″）Figure 4 The storage modulus and loss modulus of WEX-gel determined by rheometer

圖5 WEX水凝膠的掃描電子顯微鏡圖像Figure 5 Representative scanning electron microscopy images of WEX-gel

2.3 WEX水凝膠可調(diào)節(jié)體外巨噬細(xì)胞極化

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，海藻酸鈉水凝膠對(duì)巨噬細(xì)胞中CD86（與M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)的表型標(biāo)志物）和CD206（與M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)的表型標(biāo)志物）的陽性表達(dá)無明顯影響（圖6）。與水凝膠對(duì)照組比較，WEX 可下調(diào)CD86 的陽性表達(dá)（P＜0.05），但對(duì)CD206 的陽性表達(dá)無明顯影響；WEX 水凝膠可明顯下調(diào)CD86的陽性表達(dá)（P＜0.05），同時(shí)顯著促進(jìn)CD206陽性細(xì)胞比例（P＜0.05）。與水凝膠對(duì)照組比較，補(bǔ)充WEX 或WEX 水凝膠后M2 型/M1 型巨噬細(xì)胞的比率增加（P＜0.05）。見表1。表明WEX 可促進(jìn)體外巨噬細(xì)胞從M1型極化為M2型。

表1 四組巨噬細(xì)胞中CD86和CD206陽性比例比較Table 1 Positive rates of CD86 and CD206 in macrophages（，n=3）

表1 四組巨噬細(xì)胞中CD86和CD206陽性比例比較Table 1 Positive rates of CD86 and CD206 in macrophages（，n=3）

與水凝膠對(duì)照組比較，*P＜0.05.WEX：Wharton’s Jelly 衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體.

圖6 四組巨噬細(xì)胞中CD86和CD206的陽性表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果Figure 6 Positive expression of CD86 and CD206 in macrophages analyzed by flow cytometry

2.4 WEX水凝膠可促進(jìn)模型鼠皮膚創(chuàng)傷愈合

小鼠全層皮膚創(chuàng)傷模型中。術(shù)后3 d，空白對(duì)照組創(chuàng)面可見明顯紅腫及分泌物，其余兩組均未見明顯傷口炎癥及感染跡象。術(shù)后7 d，三組創(chuàng)面均開始結(jié)痂，傷口明顯收縮，其中WEX 水凝膠組愈合最好。術(shù)后15 d，WEX 水凝膠組皮膚創(chuàng)面幾乎完全愈合，而其他組仍可見不同程度未愈合的創(chuàng)面，空白對(duì)照組、WEX 對(duì)照組和WEX 水凝膠組殘余創(chuàng)面百分比分別為（27.5±3.4）%、（15.3±1.2）%和（7.6±1.1）%。與空白對(duì)照組比較，WEX對(duì)照組殘余創(chuàng)面百分比明顯縮?。≒＜0.05），表明單獨(dú)使用WEX 對(duì)皮膚創(chuàng)面恢復(fù)有促進(jìn)作用。與WEX 對(duì)照組比較，WEX 水凝膠組殘余創(chuàng)面百分比進(jìn)一步縮?。≒＜0.05），見圖7。結(jié)果表明，WEX水凝膠可增強(qiáng)WEX對(duì)皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)作用。

圖7 三組干預(yù)后不同時(shí)間創(chuàng)面外觀Figure 7 Wound healing in blank control，WEX control and WEX-gel groups at different time points

2.5 WEX水凝膠具有體內(nèi)抗菌作用

將第三天的創(chuàng)面組織進(jìn)行培養(yǎng)，WEX水凝膠組創(chuàng)面中大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌均減少（圖8），存活數(shù)均少于WEX 對(duì)照組（均P＜0.05），見表2。結(jié)果說明WEX 水凝膠具有優(yōu)異的抗菌性能。

表2 三組瓊脂平板菌落計(jì)數(shù)的定量結(jié)果比較Table 2 Quantitative analysis of colony counts on agar plates in three groups（，CFU×105）

表2 三組瓊脂平板菌落計(jì)數(shù)的定量結(jié)果比較Table 2 Quantitative analysis of colony counts on agar plates in three groups（，CFU×105）

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與WEX 對(duì)照組比較，#P＜0.05.WEX：Wharton’s Jelly 衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體；CFU：菌落形成單位.

圖8 三組小鼠創(chuàng)面組織大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)結(jié)果大體觀Figure 8 Cultures of E.coli and S. aureus in would tissue of mice in three groups

2.6 WEX 水凝膠可促進(jìn)創(chuàng)面皮膚組織新生

組織病理學(xué)檢查結(jié)果，三組皮膚組織均可觀察到不同程度的炎癥反應(yīng)，空白對(duì)照組的炎癥反應(yīng)最為嚴(yán)重，表現(xiàn)為局部出血、大量炎癥細(xì)胞聚集、纖維組織和結(jié)締組織大量減少；與空白對(duì)照組比較，WEX 對(duì)照組的炎癥反應(yīng)有所減輕；與WEX 對(duì)照組比較，WEX 水凝膠組創(chuàng)面組織中的炎癥細(xì)胞明顯減少。WEX水凝膠組的真皮厚度比其他組厚（均P＜0.05），且真皮內(nèi)的成纖維細(xì)胞更加豐富；與WEX 對(duì)照組比較，WEX 水凝膠組的新生毛囊數(shù)明顯增多，WEX水凝膠組的膠原蛋白沉積率也增加（均P＜0.05），見圖9和表3。

表3 三組創(chuàng)面皮膚組織中真皮厚度、新生毛囊數(shù)、膠原蛋白沉積率比較Table 3 Quantitative analysis of dermal thickness，number of new hair follicles，and collagen deposition rate of wound skin tissues in three groups（，n=3）

表3 三組創(chuàng)面皮膚組織中真皮厚度、新生毛囊數(shù)、膠原蛋白沉積率比較Table 3 Quantitative analysis of dermal thickness，number of new hair follicles，and collagen deposition rate of wound skin tissues in three groups（，n=3）

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與WEX 對(duì)照組比較，#P＜0.05.WEX：Wharton’s Jelly衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體.

2.7 WEX水凝膠可調(diào)節(jié)體內(nèi)巨噬細(xì)胞極化和血管新生

CD86 在各組創(chuàng)面組織中均有不同程度表達(dá)。與空白對(duì)照組比較，WEX 對(duì)照組和WEX 水凝膠組中CD86 的陽性表達(dá)均減少（P＜0.05），同時(shí)WEX 水凝膠組CD86 的陽性表達(dá)少于WEX 對(duì)照組（P＜0.05）。與空白對(duì)照組比較，WEX 對(duì)照組CD206陽性表達(dá)增加（P＜0.05）；與WEX 對(duì)照組比較，WEX 水凝膠組CD206 陽性表達(dá)進(jìn)一步增加（P＜0.05）。見圖10、表4。提示W(wǎng)EX 水凝膠可促進(jìn)創(chuàng)面組織中的巨噬細(xì)胞從M1 型極化為M2 型巨噬細(xì)胞。

表4 三組創(chuàng)面組織中巨噬細(xì)胞極化和血管新生相關(guān)標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of macrophage polarization and angiogenesis related biomarkers in wound tissues of each group（，n=3）

表4 三組創(chuàng)面組織中巨噬細(xì)胞極化和血管新生相關(guān)標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of macrophage polarization and angiogenesis related biomarkers in wound tissues of each group（，n=3）

*與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；與WEX 對(duì)照組比較，#P＜0.05.WEX：Wharton’s Jelly 衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體；VEGF：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子.

圖10 三組創(chuàng)面組織中巨噬細(xì)胞極化和血管新生相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)（免疫組織化學(xué)法）Figure 10 The expression of CD86，CD206，CD31 and VEGF in skin tissue of each group（immunohistochemical method）

與空白對(duì)照組比較，WEX 對(duì)照組CD31 陽性表達(dá)增加（P＜0.05）；與WEX 對(duì)照組比較，WEX 水凝膠組CD31 陽性表達(dá)進(jìn)一步增多（P＜0.05）。與空白對(duì)照組比較，WEX 對(duì)照組VEGF 陽性表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；與WEX 對(duì)照組比較，WEX 水凝膠組VEGF 陽性表達(dá)增多（P＜0.05），見圖10、表4。提示W(wǎng)EX 水凝膠可促進(jìn)創(chuàng)面組織的血管新生。

3 討論

WJMSC等干細(xì)胞療法可以加速創(chuàng)面愈合，從而在組織再生和傷口修復(fù)中發(fā)揮重要作用?；诖?，本研究構(gòu)建了海藻酸納水凝膠和WEX 的復(fù)合體，并應(yīng)用于小鼠全層皮膚創(chuàng)傷模型，結(jié)果表明這種復(fù)合材料能促進(jìn)小鼠皮膚創(chuàng)傷后的創(chuàng)面恢復(fù)，其作用機(jī)制與WEX 促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1型極化為M2型有關(guān)。

作為一種新型的非細(xì)胞療法，外泌體在皮膚創(chuàng)傷后的創(chuàng)面愈合和皮膚重塑中發(fā)揮重要作用［3-5］。目前普遍認(rèn)為，干細(xì)胞衍生的外泌體具有與干細(xì)胞本身相同甚至更好的組織修復(fù)能力。更重要的是，與細(xì)胞移植比較，外泌體介導(dǎo)的干細(xì)胞療法具有更高的穩(wěn)定性和可儲(chǔ)存性，無異位組織形成的風(fēng)險(xiǎn)，而且發(fā)生免疫排斥的可能性更小。然而，外泌體應(yīng)用于皮膚創(chuàng)傷治療存在一定挑戰(zhàn)，因?yàn)橥饷隗w會(huì)從注射部位迅速流失，且在體內(nèi)存活時(shí)間很短。因此，將外泌體與生物材料結(jié)合起來，在不影響其生物活性的情況下，延長(zhǎng)外泌體在移植部位的保留時(shí)間，以促進(jìn)外泌體的療效已成為開發(fā)基于外泌體療法的研究重點(diǎn)。許多研究表明，水凝膠可以增強(qiáng)細(xì)胞的特性和過程，如細(xì)胞生長(zhǎng)速度、骨形成和血管吻合等；水凝膠還可以包裹細(xì)胞，形成支架并作為藥物載體，從而提高藥物的生物利用度［10］。Shi等［11］使用可生物降解和生物相容性的殼聚糖/絲綢水凝膠海綿，將人類牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體輸送到小鼠的糖尿病傷口組織，這種水凝膠復(fù)合物可以通過增強(qiáng)再上皮化、膠原蛋白沉積和血管新生來促進(jìn)傷口愈合。此外，一種PF-127 水凝膠被發(fā)現(xiàn)對(duì)保留人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體有好處，并且這種組合促進(jìn)了小鼠大面積皮膚創(chuàng)傷修復(fù)［12］。但很少有研究調(diào)查干細(xì)胞源性外泌體與海藻酸鹽水凝膠的組合對(duì)皮膚創(chuàng)傷的治療效果。海藻酸鹽水凝膠具有良好的耐受性，不良事件發(fā)生率低［7］。因此，將海藻酸鹽水凝膠與具有治療作用的生物活性因子聯(lián)合應(yīng)用，可以提供一個(gè)更好的治療方法。然而，海藻酸鹽水凝膠是否能影響WEX 對(duì)皮膚創(chuàng)傷的療效仍是未知數(shù)。為了確定最佳的海藻酸鈉水凝膠系統(tǒng)，本研究檢測(cè)了1%和2%的氯化鈣溶液對(duì)WEX 水凝膠控釋能力的影響。考慮到皮膚創(chuàng)傷的炎癥期和修復(fù)期主要發(fā)生在第1 周內(nèi)［1］，本研究選擇了1%氯化鈣溶液制備的水凝膠，其能在1周內(nèi)釋放幾乎全部的WEX，符合創(chuàng)面修復(fù)的病理生理過程。除此以外，由1%氯化鈣組成的水凝膠表現(xiàn)出的儲(chǔ)能模量值也更適合于皮膚組織工程［10］。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，本研究將WEX 水凝膠應(yīng)用到皮膚創(chuàng)面，與預(yù)期一致的是，WEX 水凝膠增強(qiáng)了WEX 對(duì)皮膚創(chuàng)面的修復(fù)效果，表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)減輕、真皮厚度和新生毛囊數(shù)增加、膠原蛋白沉積區(qū)域擴(kuò)大和豐富的新生血管。表明WEX水凝膠可延長(zhǎng)WEX 的保留時(shí)間，從而加強(qiáng)了WEX在皮膚創(chuàng)傷中的治療作用。

皮膚創(chuàng)面愈合過程一般可分為止血期、炎癥期、增殖期和成熟期［13］。止血期通常在皮膚損傷出血后幾十秒內(nèi)停止；隨后，炎癥期在皮膚創(chuàng)傷后數(shù)小時(shí)內(nèi)開始，在促炎性細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集在傷口區(qū)域，殺死入侵的病原體并清除壞死的組織碎片；在創(chuàng)傷后24 h 內(nèi)開始增殖期，典型特征是表皮基底層細(xì)胞大量增殖和創(chuàng)面邊緣新生血管形成；在創(chuàng)傷后第3 天開始的成熟期，創(chuàng)面開始出現(xiàn)新生肉芽組織和疤痕組織，以增強(qiáng)傷口部位的完整性并最終閉合傷口［14］。先前研究表明，皮膚創(chuàng)面愈合涉及皮膚細(xì)胞、免疫細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)成分之間復(fù)雜的相互作用［15］。巨噬細(xì)胞在傷口愈合過程的不同階段發(fā)揮著關(guān)鍵作用［2］。巨噬細(xì)胞大致分為M1型和M2 型，M1 型巨噬細(xì)胞多見于損傷修復(fù)早期，可以清除傷口中的外來病原體和壞死組織碎片，其特點(diǎn)是產(chǎn)生大量促炎性細(xì)胞因子，如IL-1β和腫瘤壞死因子-α，從而導(dǎo)致創(chuàng)傷部位早期的器官功能障礙［16］。M1 型巨噬細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為M2 型，活化的M2 型巨噬細(xì)胞可以通過參與抗炎因子的產(chǎn)生和分泌來緩解炎癥反應(yīng)［17］。同時(shí)，M2 型巨噬細(xì)胞通過招募附近的成纖維細(xì)胞，促進(jìn)損傷部位膠原蛋白沉積，從而促進(jìn)創(chuàng)面的成熟和修復(fù)［18］。越來越多的證據(jù)表明，傷口環(huán)境中高比例的促炎型巨噬細(xì)胞和低比例的抗炎型巨噬細(xì)胞是傷口愈合的巨大障礙［19］。在傷口局部注射胰島素可以促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞極化為M2 型巨噬細(xì)胞，從而影響炎癥反應(yīng)過程，最終加速術(shù)后感染傷口的愈合［20］。最近的一項(xiàng)研究表明，作為一種Th2型免疫誘導(dǎo)劑，IL-33添加到皮膚傷口中可以顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞中的M2型/M1型比值，從而增強(qiáng)皮膚細(xì)胞增殖和血管新生來加速小鼠糖尿病傷口模型的愈合［21］。上述研究表明，促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1 型向M2 型極化可以為難治性傷口愈合提供有效的治療方法。本文資料顯示，WEX可有效降低體外CD86 陽性表達(dá)的巨噬細(xì)胞比例，同時(shí)上調(diào)CD206 陽性表達(dá)的巨噬細(xì)胞比例，表明WEX 可以調(diào)節(jié)體外巨噬細(xì)胞的表型。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相仿，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中WEX 水凝膠可有效促進(jìn)創(chuàng)面組織中的巨噬細(xì)胞由M1 型極化為M2 型，充分表明WEX 水凝膠可能主要通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化過程，從而發(fā)揮對(duì)皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)作用。除此以外，微生物感染會(huì)嚴(yán)重阻礙傷口愈合，理想的傷口敷料應(yīng)具有良好的抗菌性能［10］。大多數(shù)獲得性傷口感染的微生物來源是多種的，其中金黃色葡萄球菌最常見［19］。在本研究中，WEX水凝膠可有效抑制創(chuàng)面中細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果更加明顯。推測(cè)其原因是WEX 水凝膠可緩慢釋放WEX 到創(chuàng)面微環(huán)境中，通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化，從而產(chǎn)生優(yōu)異的抗菌功能。M2 型巨噬細(xì)胞可以通過釋放轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、VEGF 等血管生長(zhǎng)因子來刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的活化［22］。新血管的形成對(duì)于協(xié)調(diào)傷口愈合至關(guān)重要。慢性傷口不愈合主要是由于血管生成受損，無法為受傷部位提供足夠的營(yíng)養(yǎng)［23］。本研究也觀察到WEX 水凝膠顯著提高了創(chuàng)面組織中CD31 的表達(dá)，同時(shí)創(chuàng)面組織中VEGF 的表達(dá)也在WEX 水凝膠的作用后得以明顯上調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了WEX 水凝膠通過調(diào)節(jié)M2 型巨噬細(xì)胞的極化來促進(jìn)血管新生和細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的效果，這為WEX 水凝膠在難愈性創(chuàng)面修復(fù)中的臨床轉(zhuǎn)化提供了實(shí)用的治療方法。

總之，本研究開發(fā)了一種基于藻酸鹽水凝膠的負(fù)載WEX 水凝膠系統(tǒng)，可延長(zhǎng)WEX 在創(chuàng)面的停留時(shí)間，通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1 型極化為M2型，達(dá)到促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合的效果。本研究結(jié)果為創(chuàng)傷性皮膚缺損的臨床治療提供理論依據(jù)。然而，值得注意的是，治療創(chuàng)傷性皮膚損傷需要多管齊下，WEX 水凝膠可以與其他治療方法（如手術(shù)換藥、血糖控制、抗生素等）相結(jié)合，從而達(dá)到理想的治療效果。

志謝研究得到浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)臨床科研基金（2019ZYCA182）支持

AcknowledgementsThis study was supported by Clinical Research Fund of Zhejiang Provincial Medical Association

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of InterestsThe authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)