肝細胞脂肪變性影響巨噬細胞炎癥反應(yīng)加速動脈粥樣硬化形成

李越，吳希澤，潘嘉祥，宮麗鴻，閔冬雨

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 沈陽 110032

2.南通市中醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 南通 226000

3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，遼寧 沈陽 110847

4.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥實驗中心，遼寧 沈陽 110032

慢性病是慢性非傳染性疾病，通常起病隱匿、病程長、遷延不愈、病因復(fù)雜。慢性病之間存在復(fù)雜聯(lián)系，有些常相伴發(fā)生。數(shù)據(jù)顯示，2014年美國約有59.6%的成年人同時患有兩種及以上的慢性?。?］；2015 年英國慢性病共病率為54%，預(yù)計到2035 年將增長至67.8%［2］；我國2014 年共病率為58.1%［3］。與非共病患者比較，共病患者的死亡風(fēng)險增加（HR：1.73，95%CI：1.41～2.13）［4］。動脈粥樣硬化是老年人最常見的疾病之一，在我國60歲以上的人群中發(fā)病率高達79.9%［5］。最新臨床研究表明，NAFLD 與亞臨床動脈粥樣硬化的多種標(biāo)志物之間有很強的相關(guān)性［6］。一項包括33 例NAFLD 患者和52 名對照的研究顯示，在16.6 年的隨訪中，NAFLD 患者主要心血管不良事件的發(fā)生率明顯高于對照組［7］。因此，依照單病種指南制訂的針對特定疾病的診斷和治療方案，可能并不適用于共病的老年人。

探索共病的發(fā)病機制有助于明確慢性病共病的特點，指導(dǎo)臨床治療和共病管理。NAFLD 是由于肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積所致，而脂代謝異常同時也是動脈粥樣硬化的危險因素，提示脂代謝在動脈粥樣硬化和NAFLD 共病的發(fā)病機制中可能起著重要的作用［8］。同時，脂質(zhì)積聚使肝臟長期處于炎癥浸潤狀態(tài)，肝臟會通過分泌促炎性細胞因子和趨化因子引起主動脈內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙和血管壁的增厚和硬化，從而增加動脈粥樣硬化和心血管疾病的風(fēng)險［9-10］。本研究運用代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)和方法，擬從動脈粥樣硬化和NAFLD 共病模型小鼠與正常小鼠的差異代謝產(chǎn)物中挖掘動脈粥樣硬化和NAFLD 共病相關(guān)基因，并通過體外實驗進一步驗證，探討共病模式下NAFLD 影響動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

無特定病原級野生型C57BL/6J 小鼠6 只，ApoE－/－小鼠6只，均為雄性，5～6 周 齡，體重（18±2）g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（遼）2020-0001。在12 h 光照/12 h 黑暗循環(huán)下將小鼠圈養(yǎng)在標(biāo)準溫度（20±2）℃和濕度（50%±10%）條件下。研究方案通過遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動物倫理委員會審查［2022CS（DW）-015-01］。

小鼠RAW264.7巨噬細胞（Cat.CL-0190）購自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司；小鼠NCTC1469 正常肝細胞（Cat.CL-0407）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

HE 染色液（Cat.G1004）和油紅O 染色液（Cat.G1262）為武漢賽維爾生物科技有限公司產(chǎn)品；Bodipy 493/503（Cat.1912X200515）為上海懋康生物科技有限公司產(chǎn)品；抗CD11b（Cat.PTM-6088）為杭州景杰生物科技股份有限公司產(chǎn)品；Alexa Fluor 594-山羊抗兔IgG（H+L）（Cat.AS039）為武漢愛博泰克生物科技有限公司產(chǎn)品；總膽固醇測定試劑盒（Cat.A111-1-1）、三酰甘油測定試劑盒（Cat.A110-1-1）、HDL-C測定試劑盒（Cat.A112-1-1）、LDL-C 測定試劑盒（Cat.A113-1-1）、ox-LDL 試劑盒（Cat.H248-1-2）、ALT 測試盒（Cat.C009-2-1）和AST 測試盒（Cat.C010-2-1）為南京建成生物工程研究所有限公司產(chǎn)品；CCK-8 試劑盒（Cat.K10185133EF5E）為美國APE×BIO 公司產(chǎn)品；抗熒光衰減封片劑（含DAPI）（Cat.S2110）和4%組織細胞固定液（Cat.P1110）為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；ox-LDL（Cat.YB-002）為廣州奕源生物科技有限公司產(chǎn)品；胎牛血清（Cat.10099141）和DMEM（1×）（Cat.30044333）為美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；青霉素-鏈霉素溶液（100×）（Cat.C0222）、活性氧檢測試劑盒（DCFH-DA）（Cat.S0033s）和線粒體膜電位檢測試劑盒（Rhodamine 123）（Cat.C2008S）為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；游離膽固醇檢測試劑盒（Cat.ATTOC3001）和總膽固醇檢測試劑盒（細胞）（Cat.ATTOC3001）為亞科因生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

酶標(biāo)儀（Epoch）為美國BioTek Instruments 公司產(chǎn)品；全自動生化分析儀（TBA-120FR）為東芝醫(yī)療系統(tǒng)（中國）有限公司產(chǎn)品；組織包埋機（EG 1150H）為德國Leica 公司產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡（Eclipse Ci）為尼康精機（上海）有限公司產(chǎn)品；高速冷凍微量離心機（D3024R）為大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司（DragonLab）產(chǎn)品；熒光定量PCR儀（CFX Connect）為伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司產(chǎn)品；PCR 儀器（ETC811）為蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司（Eastwin）產(chǎn)品；超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（Orbitrap Exploris 120）為美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品。

1.2 代謝組學(xué)檢測共病模型小鼠差異代謝產(chǎn)物

1.2.1 實驗動物分組及造模 6 只野生型C57BL/6J小鼠為正常組，6只ApoE－/－小鼠進行造模為模型組。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，正常組給予正常飲食，自由飲水；模型組給予喂飼高脂飲食（60%脂肪、20%蛋白質(zhì)、20%碳水化合物）16周，構(gòu)建肝臟脂肪變性模型和動脈粥樣硬化模型［9］。

小鼠喂飼16周高脂飲食后，剖取胸主動脈組織進行HE 染色、油紅O 染色、Bodipy 和CD11b 共定位染色，取小鼠血清進行血脂水平檢測，出現(xiàn)脂質(zhì)斑塊和血脂異常即動脈粥樣硬化模型構(gòu)建成功；剖取肝臟，觀察外觀及進行HE 染色、油紅O染色，取小鼠血清進行肝功能檢測，若肝臟脂肪變性和肝功能異常即肝臟脂肪變性模型構(gòu)建成功。

1.2.2 HE 染色觀察主動脈和肝臟病理組織學(xué)改變 將主動脈、肝臟進行石蠟切片，逐步脫蠟，蘇木素中浸染8～15 min，洗去蘇木素和浮色1～2 min，分化，流水中洗滌30～60 min，伊紅液中浸染2～5 min，脫水，透明，封固后烤干，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 油紅O 染色觀察主動脈和肝臟脂質(zhì)積蓄情況 將主動脈、肝臟進行冰凍切片，滴加油紅O染液，10 min 后去掉染液，70%乙醇分化，蒸餾水洗，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 Bodipy 和CD11b 熒光檢測巨噬細胞內(nèi)膽固醇水平 主動脈石蠟切片，采用CD11b 一抗孵育，4 ℃過夜，Bodipy 493/503 在室溫下避光孵育1 h。磷酸鹽緩沖液浸洗三次，孵育熒光二抗，含DAPI 的抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡拍照［11］。

1.2.5 血生化分析儀檢測小鼠血脂及肝功能指標(biāo) 取小鼠血清，按照各試劑盒檢測操作步驟處理標(biāo)本并加樣，采用酶標(biāo)儀進行測定。

1.2.6 液相色譜-質(zhì)譜檢測共病模型小鼠代謝組學(xué)指標(biāo) 小鼠高脂飲食飼養(yǎng)16周后，腹主動脈取血，獲得小鼠血清，845×g離心15 min，取上清液，－80 ℃凍存?zhèn)溆谩? ℃ 解凍，標(biāo)本渦旋1 min，混合均勻；移取適量標(biāo)本于2 mL 離心管中；加入400 μL 甲醇溶液（－20 ℃保存），渦旋1 min；4 ℃下13 523×g離心10 min，取全部上清液轉(zhuǎn)移至新的2 mL 離心管中，濃縮干燥；準確加入150 μL 80%甲醇水配制的2-氯-L-苯丙氨酸（4 mg/L）溶液（4 ℃保存）復(fù)溶，取上清液于0.22 μm 膜過濾，過濾液加入檢測瓶中，送上海派森諾生物科技有限公司進行液相色譜-質(zhì)譜檢測。

1.2.7 處理代謝組學(xué)指標(biāo)數(shù)據(jù) 利用內(nèi)標(biāo)歸一化對代謝組學(xué)檢測數(shù)據(jù)進行處理，在樣品中加入一個或多個內(nèi)標(biāo)物，然后用樣品中所有代謝物對應(yīng)的峰面積除以該樣品中對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物峰面積得到一個相對值，即代謝組學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。對代謝組學(xué)代謝組學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)歸一化處理后的結(jié)果進行Student’st檢驗、PCA、PLS-DA 和OPLS-DA 的多元變量統(tǒng)計分析，以P＜0.05且符合變量投影重要度值＞1為標(biāo)準篩選有差異的代謝物。

1.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析共病模型小鼠差異代謝產(chǎn)物作用機制

1.3.1 篩選差異代謝產(chǎn)物靶點 在PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取差異代謝產(chǎn)物中前二十種化合物的SDF 和SMILES結(jié) 構(gòu)，并導(dǎo)入SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/），物種選 擇“Homo sapiens”，篩選出“Probability”≥10%的作用靶點，合并刪除重復(fù)后獲得差異代謝產(chǎn)物的靶點。

1.3.2 篩選動脈粥樣硬化和NAFLD 共病靶點以“atherosclerosis”、“non-alcoholic fatty liver disease”為關(guān)鍵詞，分別在Gencards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫進行檢索，Gencards 選取“Relevance score”≥1.0，DisGeNET 選取“Score_gda”≥0.1 的靶點。于Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）將靶點蛋白信息轉(zhuǎn)化為“Uniprot ID”，分別合并且刪除重復(fù)靶點后，取動脈粥樣硬化和NAFLD交集靶點。

1.3.3 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)和篩選核心靶點 將獲取的差異代謝產(chǎn)物的前二十種化合物的作用靶點與疾病靶點取交集，即差異代謝產(chǎn)物可能作用于動脈粥樣硬化和NAFLD 的潛在作用靶點。將交集靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//www.stringdb.org/），物種選擇“Home sapiens”，“score”≥0.7，下載tsv 格式導(dǎo)入CytoscapeV3.8.2 軟件（https：//www.string-db.org/），獲取PPI 網(wǎng)絡(luò)。運用CytoNCA插件（https：//apps.cytoscape.org/apps/cytonca）對網(wǎng)絡(luò)進行拓撲學(xué)分析，篩選出計算點度中心性、介度中心性和接近中心性均大于平均值的靶點為核心靶點。

1.3.4 KEGG 富集分析 將交集靶點導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫（https：//david.abcc.ncifcrf.gov/），物種選擇“Home sapiens”，選擇“official gene symbol”進行KEGG 分析，并運用微生信在線繪圖網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）實現(xiàn)可視化。

1.4 體外實驗驗證共病模型病理機制

1.4.1 分組和處理 模型組造模條件的篩選：運用不同濃度梯度的游離脂肪酸［油酸與棕櫚酸濃度比分別為0.00/0.00、0.16/0.08、0.32/0.16、0.62/0.31、1.25/0.63、2.50/1.25、5.00/2.50、10.00/5.00（mmol/L）/（mmol/L）］干預(yù)NCTC1469 細胞24 h，進行油紅O 染色和CCK-8 檢驗，根據(jù)半數(shù)致死率和油紅O 染色面積確認造模濃度。用不同濃度梯度的ox-LDL（0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL）干預(yù)RAW264.7 細胞24 h，進行油紅O染色和膽固醇酯含量的檢測，根據(jù)泡沫細胞、膽固醇酯水平和油紅O染色面積確定造模濃度。

體外實驗共分為八組：①RAW264.7 對照組（CR 組）：予10%胎牛血清+DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，不予其他處理；②RAW264.7模型組（MR 組）：予10%胎牛血清+DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用50.0 μg/mL ox-LDL 進行泡 沫細胞誘導(dǎo)24 h；③NCTC1469 對照組（CN 組）：予10%胎牛血清+DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，不予其他處理；④NCTC1469 模型組（MN 組）：予10%胎牛血清+DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用游離脂肪酸［油酸/棕櫚酸=1.25/0.63（mmol/L）/（mmol/L）］進行肝細胞脂肪變性誘導(dǎo)24 h；⑤對照NCTC1469 細胞與對照RAW264.7 細胞共培養(yǎng)組（CN+CR 組）：NCTC1469 接種在六孔板下層，并在其上嵌入已經(jīng)貼壁生長的RAW264.7 細胞小室，共同培養(yǎng)；⑥NCTC1469 模型組細胞與RAW264.7 對照細胞共培養(yǎng)組（MN+CR 組）：NCTC1469接種在六孔板下層，待游離脂肪酸誘導(dǎo)其脂肪變性后，換液，并在其上嵌入已經(jīng)貼壁生長的RAW264.7 細胞小室，共同培養(yǎng)；⑦對照NCTC1469 細胞與模型RAW264.7 細胞共培養(yǎng)組（CN+MR 組）：予10%胎牛血清+DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)NCTC1469 細胞，予10%胎牛血清+DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用50 μg/mL ox-LDL 進行泡沫細胞誘導(dǎo)24 h后，兩種細胞共同培養(yǎng)；⑧模型NCTC1469 細胞與模型RAW264.7 細胞共培養(yǎng)組（MN+MR 組）：予10% 胎牛血清+DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)NCTC1469 細胞后，采用游離脂肪酸［油酸/棕櫚酸=1.25/0.63（mmol/L）/（mmol/L）］進行肝細胞脂肪變性誘導(dǎo)24 h，同時予10%胎牛血清+DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用50.0 μg/mL ox-LDL 對RAW264.7 細胞進行泡沫細胞誘導(dǎo)24 h 后，兩種細胞共同培養(yǎng)。共培養(yǎng)體系采用六孔板Transwell，肝細胞和巨噬細胞在實驗前均用磷酸鹽緩沖液清洗。

1.4.2 油紅O 染色觀察肝細胞和巨噬細胞脂質(zhì)沉積情況 將NCTC1469、RAW264.7 細胞培養(yǎng)于六孔板細胞爬片，磷酸鹽緩沖液沖洗三次，4%多聚甲醛固定20 min，室溫下采用油紅O 試劑盒對細胞進行染色，按說明書操作。顯微鏡觀察，采用Image J軟件進行統(tǒng)計。

1.4.3 CCK-8 法檢測細胞活性 細胞以2×105個/孔為密度接種在96 孔板中，用不同濃度的游離脂肪酸及ox-LDL處理NCTC1469、RAW264.7細胞24 h，換液，每孔重新加入100 μL 培養(yǎng)液和10 μL CCK-8 試劑，37 ℃孵育2 h，按試劑說明書設(shè)置空白孔，酶標(biāo)儀450 nm 波長下測量吸光度值。

1.4.4 試劑盒檢測膽固醇酯含量 采用游離膽固醇含量檢測試劑盒和總膽固醇檢測試劑盒測量細胞脂質(zhì)水平，膽固醇酯（%）=（總膽固醇－游離膽固醇）/總膽固醇×100%。

1.4.5 熒光探針檢測活性氧含量 采用活性氧試劑盒對細胞染色，按試劑盒說明書操作，熒光顯微鏡拍照，并采用Image J軟件進行統(tǒng)計分析。

1.4.6 JC-1 染色檢測線粒體水平 JC-1 染色按試劑盒說明書進行操作，處理細胞后，熒光顯微鏡拍照，并采用Image J軟件進行統(tǒng)計分析。

1.4.7 透射電鏡觀察肝臟及細胞內(nèi)線粒體形態(tài)變化 電鏡固定液固定，漂洗，1%鋨酸溶液固定樣品1～2 h，磷酸鹽緩沖液漂洗三次，50%、70%、80%、90%、95%乙醇梯度脫水，每個濃度15 min，100%乙醇及純丙酮分別處理20 min，包埋、加熱聚合，切片，染色，觀察并拍照。

1.4.8 RT-PCR 法檢測基因表達 于NCBI 基因數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得到的核心基因（PPARA、PPARG、STAT3、NFKB1、PTGS2、SCD、PTPN1、GAPDH）的身份識別號，于Primer 軟件中得出引物雙向序列，進行引物設(shè)計和合成（表1）。TRIzol 試劑一步法提取NCTC1469 細胞和RAW264.7 細胞標(biāo)本中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用擴增試劑盒進行cDNA 的擴增。擴增條件如下：95 °C 2 min，95 °C 30 s，60 °C 30 s，72 °C 30 s，共39 個循環(huán)。結(jié)果采用2－ΔΔCT方法分析，用GAPDH的相對量表示。

表1 RT-PCR中使用的引物序列Table 1 Primers used in the RT-PCR

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（）描述，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSDt檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠動脈粥樣硬化和NAFLD 共病模型構(gòu)建成功

HE 染色結(jié)果顯示，正常組動脈內(nèi)膜光滑，細胞未見明顯增殖，彈力板連續(xù)，未見明顯斑塊及脂質(zhì)沉積；模型組可見主動脈內(nèi)膜增生，細胞排列不規(guī)則，空泡狀，可見明顯的斑塊形成及脂質(zhì)沉積。油紅O 染色結(jié)果顯示，正常組管腔內(nèi)未見明顯紅染；模型組動脈內(nèi)膜下及管腔內(nèi)均可見明顯紅染。染色結(jié)果見圖1。

圖1 動脈粥樣硬化和非酒精性脂肪性肝病共病模型小鼠主動脈組織病理學(xué)改變Figure 1 Pathologic staining pictures of the aorta in the atherosclerosis and nonalcoholic fatty liver disease comorbid model mice and in the normal mice

Bodipy 與CD11b 共定位染色結(jié)果顯示，正常組巨噬細胞表達量少，且其內(nèi)未見明顯脂質(zhì)沉積；模型組巨噬細胞表達量增多，其內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯，發(fā)生明顯共定位情況（圖2）。

圖2 動脈粥樣硬化和非酒精性脂肪性肝病共病模型小鼠主動脈巨噬細胞內(nèi)脂滴沉積情況Figure 2 Lipid droplet deposition in aortic macrophages of the atherosclerosis and nonalcoholic fatty liver disease comorbid model mice and the normal mice

正常組小鼠肝臟顏色呈暗紅色，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰；模型組小鼠肝臟顏色呈黃色，肝體積增大，腫脹。HE 染色結(jié)果顯示，正常組肝細胞間未見明顯單核細胞浸潤，細胞形態(tài)正常；模型組肝細胞間見大量單核細胞浸潤，細胞腫脹。油紅O 染色結(jié)果顯示，正常組未見明顯紅色脂滴；模型組可見明顯紅染，細胞質(zhì)內(nèi)可見明顯著色脂滴。見圖3。血脂水平檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組總膽固醇、三酰甘油、LDL-C 和ox-LDL明顯升高（t=－5.2、－4.7、－3.6 和－5.7，均P＜0.01），HDL-C 水平明顯下降（t=5.5，P＜0.01）。肝功能指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組ALT 和AST 均明顯升高（t=－10.2和－8.0，均P＜0.01），見表2。以上結(jié)果提示，小鼠動脈粥樣硬化和NAFLD共病模型構(gòu)建成功。

圖3 動脈粥樣硬化和非酒精性脂肪性肝病共病模型小鼠肝組織病理學(xué)改變Figure 3 Pathologic staining pictures of the liver tissue in the atherosclerosis and nonalcoholic fatty liver disease comorbid model mice and in the normal mice

表2 動脈粥樣硬化和非酒精性脂肪性肝病共病模型小鼠與正常小鼠血脂和肝功能檢測結(jié)果比較Table 2 Lipid and liver function levels in the atherosclerosis and nonalcoholic fatty liver disease comorbid model mice and in the normal mice（，n=6）

表2 動脈粥樣硬化和非酒精性脂肪性肝病共病模型小鼠與正常小鼠血脂和肝功能檢測結(jié)果比較Table 2 Lipid and liver function levels in the atherosclerosis and nonalcoholic fatty liver disease comorbid model mice and in the normal mice（，n=6）

—：無相關(guān)數(shù)據(jù)；NAFLD：；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；ox-LDL：氧化型低密度脂蛋白；ALT：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；AST：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶.

2.2 動脈粥樣硬化和NAFLD 共病模型差異代謝產(chǎn)物

非靶向代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示，多元統(tǒng)計中正離子的PCA、PLS-DA、OPLS-DA 圖顯示每組標(biāo)本的組內(nèi)具有良好的一致性，組間具有良好的差異性（圖4）。85 種代謝產(chǎn)物表達存在差異（附圖1），其中差異顯著性前二十位的代謝產(chǎn)物見表3。結(jié)果提示，動脈粥樣硬化和NAFLD 共病模型小鼠的代謝產(chǎn)物發(fā)生改變。

圖4 動脈粥樣硬化和非酒精性脂肪性肝病小鼠與正常小鼠代謝組學(xué)分析結(jié)果Figure 4 Metabonomic analysis between atherosclerosis and nonalcoholic fatty liver disease mice and normal mice

表3 動脈粥樣硬化和非酒精性脂肪性肝病共病模型小鼠與正常小鼠前二十種差異代謝產(chǎn)物Table 3 Top 20 differential metabolites between the atherosclerosis and nonalcoholic fatty liver disease comorbidity model mice and the normal mice

2.3 差異代謝產(chǎn)物作用于動脈粥樣硬化和NAFLD的核心靶點及可能的作用機制

將差異代謝產(chǎn)物顯著的前二十種化合物于Swiss TargetPrediction 預(yù)測，合并刪除重復(fù)后獲得256 個潛在靶點。同時，從數(shù)據(jù)庫獲取動脈粥樣硬化和NAFLD的疾病靶點，合并刪除重復(fù)后獲得動脈粥樣硬化靶點2819個，NAFLD 靶點3640個，取交集獲得動脈粥樣硬化和NAFLD 相關(guān)靶點1491 個。1491 個疾病靶點與20種差異代謝產(chǎn)物靶點取交集獲得60 個差異代謝產(chǎn)物作用于動脈粥樣硬化和NAFLD 的潛在靶點。將交集靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，有60個節(jié)點，104條邊（圖5），運用CytoNCA 插件對網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，得到核心靶點11個（表4）。

圖5 差異代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化和非酒精性脂肪性肝病的交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Figure 5 The PPI network of intersecting targets of differential metabolite regulation of atherosclerosis and nonalcoholic fatty liver disease

表4 基于拓撲學(xué)篩選動脈粥樣硬化和非酒精性脂肪性肝病共病發(fā)病機制的核心靶點Table 4 Topology-based screening of core targets for pathogenesis in atherosclerosis and nonalcoholic fatty liver disease comorbidity models

對60 個交集靶點進行KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，共涉及68 條信號通路（P＜0.05），前十位信號通路為PPAR 信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、酒精性肝病、催乳素信號通路、胰島素抵抗、TNF信號通路、乙型肝炎、松弛素信號通路、IL-17信號通路、非酒精性脂肪肝，提示共病模型的差異代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化和NAFLD 的作用靶點主要在糖脂代謝和炎癥相關(guān)通路（附圖2），其中PPARG、PPARA、PTPN1、SCD靶點與脂代謝密切相關(guān)，STAT3、NFKB1、PTGS2靶點與炎癥密切相關(guān)。

2.4 體外實驗驗證病理機制

2.4.1 細胞共病模型構(gòu)建 采用不同濃度的游離脂肪酸干預(yù)NCTC1469細胞24 h，結(jié)果顯示，各濃度游離脂肪酸［油酸與棕櫚酸濃度比分別為0.00/0.00、0.16/0.08、0.32/0.16、0.62/0.31、1.25/0.63、2.50/1.25、5.00/2.50、10.00/5.00（mmol/L）/（mmol/L）］干預(yù)后細胞油紅O染色面積分別為0.20、0.77、2.65、3.33、5.93、8.34、11.61、11.94 像素，與不加游離脂肪酸相比均增加（附圖3）；細胞活性檢測結(jié)果顯示，隨著游離脂肪酸濃度逐步增加，細胞活性逐步減弱，分別為1.13%、1.00%、0.95%、0.78%、0.54%、0.27%、0.04%、0.03%。根據(jù)半數(shù)致死率和油紅O 染色結(jié)果，確定后續(xù)實驗中游離脂肪酸濃度采用油酸與棕櫚酸濃度比為1.25/0.63（mmol/L）/（mmol/L）。

采用不同濃度ox-LDL 干預(yù)RAW264.7 細胞24 h，細胞油紅O染色結(jié)果見附圖4。與0.0 μg/mL組（1.47 像素）比較，50.0、100.0、200.0 μg/mL 時細胞油紅O 染色面積分別為8.59、9.84、10.77 像素，均明顯增加（P＜0.01）；根據(jù)膽固醇酯含量測定結(jié)果，50.0、100.0、200.0 μg/mL 時細胞內(nèi)膽固醇酯含量為50.77%、54.70%、58.70%，均大于50%。因此，后續(xù)實驗選擇50.0 μg/mL ox-LDL進行造模。

2.4.2 共病模型脂代謝和炎癥相關(guān)基因表達水平改變 脂代謝相關(guān)核心基因選擇PPARG、PPARA、PTPN1、SCD于肝細胞中進行RT-PCR驗證，結(jié)果表明，與CN 組比較，MN組PPARG和PTPN1mRNA 表達水平均增加（t=－8.9 和－10.1，均P＜0.01），PPARA和SCDmRNA表達水平均減少（t=8.9 和 9.2，均P＜0.01）；MN+CR組PPARG和PTPN1mRNA 表達水平均增加（t=－6.4 和－4.7，均P＜0.01），PPARA和SCDmRNA 表達水平均減少（t=26.0 和16.3，均P＜0.01）；MN+MR組PPARG和PTPN1mRNA表達水平均增加（t=－5.5 和－8.4，均P＜0.01），PPARA和SCDmRNA 表達水平均減少（t=5.7 和18.1，均P＜0.01）；與MN 組比較，MN+MR組SCDmRNA表達水平減少（t=4.2，P＜0.05），見表5。結(jié)果提示，脂代謝相關(guān)基因在肝細胞模型中變化明顯，與泡沫細胞共培養(yǎng)后影響脂代謝基因的表達。

表5 小鼠肝細胞脂代謝相關(guān)基因mRNA相對表達水平Table 5 RT-PCR to verify the relative mRNA expression levels of lipid metabolism-related genes in mouse hepatocytes（）

表5 小鼠肝細胞脂代謝相關(guān)基因mRNA相對表達水平Table 5 RT-PCR to verify the relative mRNA expression levels of lipid metabolism-related genes in mouse hepatocytes（）

與CN 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與MN 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01.PPARA：過氧化物酶體增殖物激活受體α；PPARG：過氧化物酶體增殖物激活受體γ；PTPN：非受體型蛋白酪氨酸磷激酶；SCD：細胞硬脂酰輔酶A去飽和酶.

炎癥相關(guān)核心基因選擇STAT3、NFKB1、PTGS2于巨噬細胞中進行RT-PCR驗證，結(jié)果顯示，與CR組比較，MR 組巨噬細胞STAT3、NFKB1和PTGS2mRNA表達水平均增加（t=－7.6、－13.5和－5.4，均P＜0.01），CN+CR 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），MN+CR組STAT3、NFKB1和PTGS2mRNA表達水平均增加（t=－11.4、－6.0 和－6.7，均P＜0.01），CN+MR組STAT3、NFKB1和PTGS2mRNA表達水平均增加（t=－7.6、－10.2 和－3.4，均P＜0.05），MN+MR組STAT3、NFKB1和PTGS2mRNA 表 達水平均增加（t=－9.5、－23.8和－5.3，均P＜0.01）；與MR 組比較，MN+MR組STAT3和NFKB1mRNA表達水平均增加（t=－3.5 和－5.0，均P＜0.05），見表6。結(jié)果提示脂肪變性的肝細胞影響巨噬細胞炎癥相關(guān)基因的表達。

表6 小鼠巨噬細胞炎癥相關(guān)基因mRNA相對表達水平Table 6 RT-PCR to verify the relative mRNA expression levels of inflammation-related genes in mouse macrophages（）

表6 小鼠巨噬細胞炎癥相關(guān)基因mRNA相對表達水平Table 6 RT-PCR to verify the relative mRNA expression levels of inflammation-related genes in mouse macrophages（）

與CR 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與MR 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01.STAT：信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子；NFKB1：核因子-κB p105亞基；PTGS：前列腺素G/H合酶.

2.4.3 共病模型肝細胞脂肪變性促進巨噬細胞泡沫化 RAW264.7 細胞油紅O 染色結(jié)果顯示，單獨培養(yǎng)巨噬細胞，未用ox-LDL 誘導(dǎo)時，CR 組胞內(nèi)未見明顯紅染（1.34像素）；與CR組比較，經(jīng)ox-LDL 誘導(dǎo)后，MR組（10.26 像素）和CN+MR組（10.61 像素）單個巨噬細胞油紅O 染色面積明顯增加（均P＜0.01）；共培養(yǎng)時，CN+CR組（1.31 像素）未見明顯紅染，而MN+CR組（9.44 像素）油紅O 染色面積明顯增加；與MR 組比較，MN+MR組（13.43 像素）油紅O 面積明顯增加。見圖6。結(jié)果提示，脂肪變性的肝細胞促進泡沫細胞的形成，且加重泡沫細胞的脂質(zhì)積蓄。

圖6 各組巨噬細胞油紅O染色結(jié)果Figure 6 Results of oil red O staining of macrophages in each group

2.4.4 肝細胞脂肪變性影響線粒體功能和形態(tài) 活性氧探針檢測結(jié)果顯示，與CN 組比較，MN組、MN+CR組和MN+MR 組活性氧平均熒光強度明顯增強（t=－9.2、－16.7 和－7.9，均P＜0.01）；與MN 組比較，MN+MR 組活性氧熒光強度明顯增強（t=－3.7，P＜0.05），見圖7、表7。

圖7 各組肝細胞活性氧熒光圖Figure 7 Fluorescence map of reactive oxygen species in hepatocytes of each group

表7 小鼠肝細胞線各組粒體功能Table 7 Mitochondrial function in each group of the mice hepatocyte cell line（）

表7 小鼠肝細胞線各組粒體功能Table 7 Mitochondrial function in each group of the mice hepatocyte cell line（）

與CN組比較，**P＜0.01；與MN組比較，##P＜0.01.

透射電鏡觀察線粒體形態(tài)發(fā)現(xiàn)，CN 組和CN+CR 組肝細胞線粒體形態(tài)正常，呈長形或橢圓形，線粒體脊清晰，排列致密，未見線粒體腫脹；與CN組比較，MN 組、MN+CR 組及MN+MR 組線粒體形態(tài)明顯改變，呈圓形，腫脹，線粒體脊模糊不清，甚至消失，斷裂，細胞內(nèi)見大量脂滴，CN+MR 組線粒體改變不明顯，細胞內(nèi)可見少量脂滴，見圖8。

圖8 各組肝細胞線粒體形態(tài)電鏡圖Figure 8 Detection of mitochondrial morphology

線粒體JC-1染色結(jié)果顯示，與CN組比較，MN組、MN+CR組和MN+MR組紅色熒光強度/綠色熒光強度值明顯減?。╰=6.5、7.4和10.9，均P＜0.01）；與MN 組比較，MN+MR 組紅色熒光強度/綠色熒光強度值明顯減?。╰=4.1，P＜0.05），見圖9、表7。以上結(jié)果提示，脂肪變性后的肝細胞線粒體受損、形態(tài)破壞、功能受損，活性氧產(chǎn)生增加，而泡沫細胞形成加重線粒體損傷。

圖9 各組肝細胞線粒體膜電位功能熒光圖Figure 9 Detection of mitochondrial membrane potential

3 討論

本研究基于代謝組學(xué)探討動脈粥樣硬化和NAFLD 共病模型小鼠的差異代謝產(chǎn)物，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘其潛在機制，并驗證了共病發(fā)病機制與炎癥和脂代謝密切相關(guān)，同時肝細胞脂肪變性促進巨噬細胞泡沫化，也表明NAFLD 會促進動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展。這是由于肝臟是脂代謝的主要器官，脂代謝障礙使肝糖原轉(zhuǎn)化在脂肪，儲存在肝臟中，也使肝細胞和脂肪細胞脂質(zhì)積蓄，引起肝細胞脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致線粒體損傷。肝細胞線粒體功能受損后又會進一步產(chǎn)生過多活性氧，氧化修飾低密度脂蛋白后，ox-LDL 被巨噬細胞吞噬成泡沫細胞，激活炎癥反應(yīng)，形成動脈粥樣硬化，可見脂代謝障礙促進炎癥反應(yīng)可能是NAFLD促進動脈粥樣硬化形成的重要因素。

本研究代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示，模型組的尿酸、高瓜氨酸顯著升高，苯乙酸、磷脂酰膽堿和5-羥基-L-色氨酸顯著降低。尿酸是體內(nèi)嘌呤代謝的最終產(chǎn)物，尿酸升高與NAFLD 的發(fā)病率增加有關(guān)，是NAFLD 的獨立危險因素，其可通過刺激果糖激酶促進果糖代謝和肝細胞中的脂肪沉積［12-13］；而且尿酸還具有顯著的促炎作用，通過激活NOD 樣受體蛋白1 炎癥小體觸發(fā)IL-3β 介導(dǎo)的炎癥［14］。苯乙酸代謝物的升高反映了苯丙氨酸和酪氨酸降解的增強，而有研究發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸和酪氨酸會通過影響脂質(zhì)代謝相關(guān)途徑促進NAFLD的進展［15］；苯乙酸還能通過刺激血管內(nèi)皮細胞中活性氧的產(chǎn)生和TNF-α 的分泌，調(diào)節(jié)炎癥，影響動脈粥樣硬化的發(fā)展［16］。磷脂酰膽堿具有調(diào)節(jié)血清膽固醇的作用［17-18］，還能抑制泡沫細胞的形成，具有抗動脈粥樣硬化作用［19］。高瓜氨酸是通過氨基甲?；苌鴣淼?，以往研究發(fā)現(xiàn)，高瓜氨酸分別在動脈粥樣硬化和NAFLD 患者中顯著上調(diào)，而且其濃度與冠狀動脈疾病嚴重程度呈正相關(guān)，本研究與其一致［20-21］；高瓜氨酸可能通過誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙，增加活性氧產(chǎn)生，導(dǎo)致內(nèi)皮一氧化氮合酶解偶聯(lián)，從而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生［22］。5-羥基-L-色氨酸是一種血清素前體，可通過抑制食欲減少脂肪的攝取［23-24］。為了明確以上差異代謝產(chǎn)物如何影響共病的進展，研究者基于代謝組學(xué)得到的顯著差異代謝產(chǎn)物進行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果得到差異代謝產(chǎn)物影響動脈粥樣硬化和NAFLD 共病的11 個關(guān)鍵基因，其中PPARG、PPARA、PTPN1、SCD與脂代謝密切相關(guān)，STAT3、NFKB1、PTGS2與炎癥密切相關(guān)。PPARG和PPARA是過氧化物酶體增殖物激活受體的一員，作為脂肪酸傳感器，是多種人類脂質(zhì)代謝疾病的治療靶點，可通過與類視黃醇X受體結(jié)合形成PPAR-RXR 異二聚體，調(diào)節(jié)脂肪酸氧化基因的轉(zhuǎn)錄，抑制炎癥因子的表達，影響巨噬細胞膽固醇的轉(zhuǎn)運，影響動脈粥樣硬化［25］。PTPN1是PTP 超家族的成員，研究發(fā)現(xiàn)用高脂肪飲食喂養(yǎng)的PTP8B敲除小鼠對體重增加具有抵抗力，并且三酰甘油水平顯著降低，因此，PTP1B是治療脂代謝異常相關(guān)疾病的潛在靶點［26-27］。PTPN1還參與巨噬細胞極化，敲除PTPN1將巨噬細胞向抗炎M2 表型轉(zhuǎn)移，從而促進腸屏障完整性并抑制巨噬細胞的炎癥反應(yīng)［28］。SCD影響脂肪酸合成途徑，在調(diào)節(jié)參與脂肪生成的基因的表達和調(diào)節(jié)線粒體脂肪酸氧化方面發(fā)揮重要作用，在NAFLD 患者中可見SCD基因表達上調(diào)［29］。巨噬細胞是炎癥細胞的重要組成部分，包括促炎M1型和抗炎M2型，M1型巨噬細胞的促炎反應(yīng)依賴于NFKB1的激活；M2 型巨噬細胞會通過募集STAT3抑制炎癥［30］。PTGS2基因的重要功能之一是參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，其翻譯的環(huán)氧合酶通過催化花生四烯酸代謝和前列腺素合成的初始步驟，是炎癥的主要介質(zhì)，可作為治療炎癥性疾病的治療靶點［31］。KEGG通路富集分析結(jié)果得到的信號通路有PPAR 信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、酒精性肝病、胰島素抵抗、TNF 信號通路等，因此推測差異代謝物影響了共病模型中的脂代謝及炎癥表型。

為了驗證假說，本研究采用細胞共培養(yǎng)技術(shù)，驗證了脂肪變性的肝細胞發(fā)生線粒體形態(tài)和功能的改變，與巨噬細胞共培養(yǎng)后，加重了巨噬細胞泡沫化及炎癥改變，證實了前文的假說。

綜上，本研究通過分析動脈粥樣硬化與NAFLD 共病模型的差異代謝產(chǎn)物，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化與NAFLD 共病的發(fā)生與脂代謝異常和炎癥相關(guān)。肝臟是糖脂代謝最重要的器官，肝臟脂肪變性導(dǎo)致肝功能異常，游離脂肪酸增多，損傷線粒體，活性氧累積并從細胞器中釋放時，導(dǎo)致炎癥的激活，構(gòu)成動脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展的重要因素。但本研究在動物模型上采用普通飲食喂飼野生型C57BL/6J 小鼠作為對照組，采用高脂喂飼ApoE－/－小鼠的經(jīng)典造模方法，由于兩種小鼠存在不同的基因背景，可能會對差異代謝物存在一定的影響，這也是本研究的不足之一。后續(xù)將以普通飲食喂養(yǎng)的ApoE－/－小鼠作為對照組，在相同的基因背景下進一步研究和分析。

本文附圖見電子版。

志謝本研究得到遼寧省教育廳科學(xué)研究經(jīng)費項目（L202048）、遼寧省教育廳基本科研項目（青年項目）（LJKQZ2021064）的支持.感謝遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥實驗中心提供的科研平臺，感謝審稿專家及編輯的幫助

AcknowledgementsThis work was supported by Scientific Research Funding Project of Liaoning Provincial Department of Education (L202048),Basic Research Projects of Liaoning Provincial Department of Education (LJKQZ2021064).We would like to thank the Experimental Center of Traditional Chinese Medicine,the First Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine for providing a research platform,and thank the reviewers and editors for the help

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of InterestsThe authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)