川中地區(qū)濃香型白酒酒醅風味物質(zhì)時空差異性比較

蒲領(lǐng)平，黃治國，饒家權(quán)，王曉平，何超，任正茂，鄒永芳*

（1.舍得酒業(yè)有限公司，四川遂寧 629200）（2.四川輕化工大學釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000）

濃香型白酒是中國白酒的代表香型之一，對中國白酒產(chǎn)業(yè)的消費格局影響重大[1]。酒醅是濃香型白酒釀造主體，是形成濃香型白酒“窖香濃郁”的關(guān)鍵[2]。在實際生產(chǎn)環(huán)節(jié)中，對濃香型白酒酒醅的研究工作主要集中于對酒醅入窖前和出窖后理化指標的監(jiān)測，而對窖內(nèi)發(fā)酵過程酒醅風味物質(zhì)的研究則相對較少，這就導(dǎo)致無法深入了解窖內(nèi)發(fā)酵過程“物系、酶系、菌系”發(fā)生了何種變化。由于酒醅樣品在發(fā)酵過程中難以獲得且發(fā)酵機理復(fù)雜，窖內(nèi)不同部位酒醅其發(fā)酵進程亦不同，使得酒醅研究需從多角度多層次進行取樣，這成為目前研究濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵機理和監(jiān)測窖內(nèi)發(fā)酵情況的一個重要阻礙因素。

在一定程度上，濃香型白酒的風味特征是由其獨特地理位置、特殊釀造工藝和釀酒原料所決定的[3]，四川不同地區(qū)生產(chǎn)的濃香型白酒也有一些差異[4]。例如，范文來等[5]采用直接進樣結(jié)合氣相色譜檢測了濃香型白酒的風味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)四川瀘州地區(qū)濃香型原酒風味物質(zhì)種類不同于四川其他3 個地區(qū)。目前，研究人員對四川瀘州[6]、樂山[7]、德陽[8]、川南地區(qū)[9]產(chǎn)出的濃香型白酒進行了大量的研究，涉及了原酒質(zhì)量分析、窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)、酒醅特征風味物質(zhì)等領(lǐng)域[10]。然而，目前對四川中部區(qū)域濃香型白酒酒醅在發(fā)酵過程中主要風味物質(zhì)與空間結(jié)構(gòu)分布差異的研究仍鮮見報道。

因此，本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）分析了不同發(fā)酵期和不同酒醅發(fā)酵部位揮發(fā)性化合物的積累，通過主成分分析結(jié)合偏最小二乘分析法比較了窖池邊緣酒醅和中心酒醅在發(fā)酵過程中風味物質(zhì)的差異性，以便深入了解濃香型酒的產(chǎn)香機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

采樣地點：酒醅樣本來自川中某名優(yōu)濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)30 年窖齡的窖池。

采樣方法：隨機選取3 個正常發(fā)酵池進行跟蹤取樣，發(fā)酵周期76 d，選擇夏季5～7 月份發(fā)酵過程研究，在每個發(fā)酵時間點（0、8、18、33、54 和76 d），分別從每個窖池中部和邊緣采集酒醅樣本，按窖池深度差異分為上（距窖頂50～60 cm）、中（距窖頂160～170 cm）、下（距窖頂180～200 cm）三個點進行混合作為代表樣本，儲存在-20 ℃冰箱中供進一步使用。

1.1.2 試劑

乙酸正丁酯（色譜純），Sigma 公司；氯化鈉（分析純），成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

AR2140 電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；7890A-5975B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗方法

采用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）法[11]，對濃香型白酒酒醅的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分析。

1.3.2 樣品前處理

稱取3.0 g 酒醅于頂空瓶中，分別加入2.0 g 的NaCl 和50 μL 的乙酸正丁酯（84 mg/100 mL）作為內(nèi)標混勻，置于已預(yù)熱至70 ℃的固相微萃取儀中平衡10 min 后，插入萃取針頭（50/30 μm 二乙烯丙基/碳分子篩/聚二甲基烷氧基）萃取30 min 備用。

1.3.3 HS-SPME-GC-MS 測定條件

色譜條件：DB-WAX（60.0 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細管柱；99.999%氦氣，進樣口溫度為230 ℃；升溫程序：初溫40 ℃，保持3 min，4 ℃/min升至150 ℃，接著再以8 ℃/min升到230 ℃保持6 min，總運行時間46.5 min；載氣流速為1 mL/min；分流比為20:1。

質(zhì)譜條件：離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，電離電壓為70 eV，電離方式為電子電離（EI），質(zhì)量掃描范圍為35～400 u，溶劑延遲為3 min。

定性分析：采用NIST05a.L 標準譜庫比對，并通過GC-MS 化工作站選擇匹配度大于或等于80%（最大值為100%）的物質(zhì)進行定性分析。

定量分析：乙酸正丁酯為內(nèi)標物，通過內(nèi)標法進行定量分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果均用“平均值±標準偏差”表示；采用Sigma 14.0 進行差異性代謝產(chǎn)物分析；并利用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，對試驗結(jié)果進行SNK-q 檢驗和多重比較。各組試驗均重復(fù)進行三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃香型白酒發(fā)酵過程中酒醅風味物質(zhì)分析

采用SPME-GC-MS 法對整個發(fā)酵過程酒醅微量揮發(fā)性成分進行測定，在對窖池邊緣酒醅和中心酒醅風味物質(zhì)總類數(shù)進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：中心酒醅共檢測到127 種揮發(fā)性風味物質(zhì)，其中酯類為58 種，醇類27 種，酸類為15 種，分別占總量的45.67%、21.26%和11.81%；邊緣酒醅在發(fā)酵過程中共監(jiān)測到132 種揮發(fā)性風味物質(zhì)，其中酯類44 種，醇類26 種，酸類14 種，分別占總量的33.33%、19.70%和10.61%，這與固態(tài)發(fā)酵酒醅風味物質(zhì)的多樣性相似[12]。而0、8、18、33、54、76 d 的中心酒醅微量揮發(fā)性成分種類分別平均為23、26、30、67、94、111 種，邊緣酒醅微量揮發(fā)性成分種類分別平均為26、28、30、90、117、130 種（圖1），經(jīng)顯著性分析檢驗，表明發(fā)酵后期風味物質(zhì)種類數(shù)量間差異顯著（P＜0.05），可能源于酒醅自身所含香味物質(zhì)的差異性。

圖1 濃香型白酒窖內(nèi)酒醅風味物質(zhì)總類數(shù)Fig.1 Total number of flavor substances in Jiupei of China strong aroma baijiu

以風味物質(zhì)平均相對含量為標準（表1），邊緣酒醅發(fā)酵過程主要揮發(fā)性物質(zhì)由高到低為乳酸乙酯、十六酸乙酯、己酸、己酸乙酯、乙酸、亞油酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯，其平均相對含量分別為17.75%、16.46%、15.34%、10.49%、10.31%、4.67%、3.05%、1.98%。中心酒醅發(fā)酵過程主要揮發(fā)性物質(zhì)由高到低為乳酸乙酯、十六酸乙酯、己酸乙酯、乙酸、己酸、亞油酸乙酯、乙酸乙酯、異丙醇，其平均相對含量分別為11.35%、10.22%、10.21%、8.54%、8.15%、3.30%、2.68%、1.94%。

表1 酒醅不同部位風味物質(zhì)組成及含量Table 1 Composition and content of flavor sμbstances in different positions of Jiμpei

2.2 濃香型白酒發(fā)酵過程中酒醅風味物質(zhì)的主成分分析

采用軟件SPSS 26.0 對邊緣酒醅和中心酒醅中的132 種揮發(fā)性化合物進行PCA 分析作降維處理，進而分析其發(fā)酵過程變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：酒醅發(fā)酵期間從6 個不同發(fā)酵時間采集的樣品可分為四個區(qū)域。例如，出窖的邊緣酒醅、中心酒醅樣本分別位于在第三、四象限，從8～33 d 采集的邊緣酒醅和中心酒醅樣本集中在第一、二象限（圖2）。結(jié)果表明，整個發(fā)酵過程可分為三個階段，分別對應(yīng)于0～18 d、18～54 d 和54～76 d。同時，酒醅不同的發(fā)酵周期具有不同的特征揮發(fā)性化合物。

圖2 不同發(fā)酵階段酒醅風味物質(zhì)綜合得分散點圖Fig.2 The distribution points of flavor compounds in different fermentation stages

2.3 濃香型白酒發(fā)酵過程中酒醅風味物質(zhì)的偏最小二乘分析

采用軟件SIMCA-P 14.0 對所檢出的132 種風味成分進行PLS-DA 分析，以強化邊緣酒醅和中心酒醅的差異。可變重要性（VIP）值≥1 的化合物為差異化合物。因此，邊緣酒醅和中心酒醅的差異代表化合物有7 種，包括乙酸、丁酸、己酸、乳酸乙酯、己酸乙酯、亞油酸乙酯、十六酸乙酯（圖3），這與已有研究認為己酸乙酯、丁酸、乳酸乙酯、己酸、乙酸是酒醅重要的香氣化合物的結(jié)論相似[13]。邊緣酒醅和中心酒醅發(fā)酵生香的差異性，可能來源于不同部位微生物群落構(gòu)成及代謝活動的差異性[14]。又由于醇、酸、酯是決定濃香型白酒的風味和質(zhì)量的重要風味物質(zhì)，因此進一步對酒醅發(fā)酵過程中的揮發(fā)性總醇、揮發(fā)性總酸、揮發(fā)性總酯以及酒醅發(fā)酵過程的主要差異性代謝產(chǎn)物進行分析。

圖3 邊緣酒醅和中心酒醅偏最小二乘法判別分析VIP值分布圖Fig.3 Distribution diagram of VIP values of marginal Jiupei and centeral Jiupei by partial least squares discriminant analysis

2.4 濃香型白酒發(fā)酵過程中酒醅揮發(fā)性總醇含量的變化規(guī)律

醇類物質(zhì)是濃香型白酒中醇甜和助香的重要物，同時也是其它香味物質(zhì)形成的前驅(qū)物質(zhì)[15]。因此，通過研究窖內(nèi)揮發(fā)性總醇含量的變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：同一發(fā)酵時間（除76 d），不同部位酒醅總醇含量在整個發(fā)酵過程中無顯著性差異（P＞0.05）。酒醅的總醇含量總體呈先升后降變化（圖4），這可能是因為發(fā)酵前期酒醅中的淀粉和還原糖可被微生物分解利用生成醇類物質(zhì)，導(dǎo)致總醇含量增加；而后隨著發(fā)酵時間的延長，由于酒醅中的能量被逐漸消耗殆盡，導(dǎo)致微生物活性減弱，且利用醇類物質(zhì)作為前體物質(zhì)進一步合成酸、酯類等物質(zhì)，使得酒醅的揮發(fā)性性醇類物質(zhì)含量總體呈下降變化[16]。中心酒醅的總醇含量在發(fā)酵過程中呈先增后降再增的變化趨勢，邊緣酒醅的揮發(fā)性總醇含量在發(fā)酵54 d 前，發(fā)酵52 d 后趨于穩(wěn)定，醇類風味化合物的變化趨勢大致邊緣部位略高[16]。

圖4 濃香型白酒發(fā)酵過程中酒醅揮發(fā)性總醇含量變化Fig.4 Changes of total alcohol content in volatile Jiupei during China strong aroma baijiu fermentation

2.5 濃香型白酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性總酸含量的變化規(guī)律

酸類物質(zhì)對酒體能起到緩和調(diào)味的作用，也是白酒中酯類化合物的前體物質(zhì)，其種類、濃度直接影響了白酒發(fā)酵風味物質(zhì)的產(chǎn)生[17,18]。通過研究酒醅發(fā)酵過程中揮發(fā)性總酸含量的變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：同一發(fā)酵時間（除第54 天），不同部位酒醅揮發(fā)性總酸含量不具有顯著差異（P＞0.05）。不同部位酒醅揮發(fā)性總酸含量在發(fā)酵過程中變化趨勢基本一致，且均呈先升后降的變化趨勢。在發(fā)酵0～33 d 兩者均呈上升趨勢，這可能由于發(fā)酵前期窖內(nèi)微生物通過代謝產(chǎn)生酸，使得總酸含量上升，這也與Jung 等[19]的研究結(jié)果相一致。發(fā)酵后期（54～76 d），酒醅總酸含量呈下降趨勢（圖5），可能是酸類物質(zhì)被利用生成其它物質(zhì)，使總酸含量降低[20]；也有可能是由于芽孢桿菌屬（Bacillμs）能代謝生成白酒醇、酸、酯等風味物質(zhì)[21,22]，其豐度芽孢桿菌在發(fā)酵后期急劇降低，導(dǎo)致總酸含量降低。

圖5 濃香型白酒發(fā)酵過程中酒醅揮發(fā)性總酸含量變化Fig.5 Changes of total acid content in volatile Jiupei during China strong aroma baijiu fermentation

2.6 濃香型白酒發(fā)酵過程中酒醅揮發(fā)性總酯含量的變化規(guī)律

酒醅酯類物質(zhì)是在酒曲以及脂肪酶催化作用下由酸和醇反應(yīng)生成，酯的種類和數(shù)量決定著白酒的香味和風格[23,24]。酒醅酯類物質(zhì)可給白酒提供怡人的果香香氣，使酒體變得清甜醇香。本試驗通過研究酒醅中揮發(fā)性總酯含量的變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在發(fā)酵后期（第54～76 天），不同部位酒醅的揮發(fā)性總酯含量顯著差異（P＜0.05）。邊緣酒醅的揮發(fā)性總酯含量在發(fā)酵0～18 d 緩慢上升，在發(fā)酵18～54 d 后快速上升（圖6），說明該階段仍存在酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)，此變化規(guī)律與晉湘宜等研究結(jié)果一致[25,26]。中心酒醅揮發(fā)性總酯含量在發(fā)酵0～33 d 緩慢上升，之后快速下降，這可能是因為發(fā)酵中后期酒醅中酸類物質(zhì)大量減少，進而使得酒醅中的揮發(fā)性酯類物質(zhì)逐漸減少。

圖6 濃香型白酒發(fā)酵過程中酒醅揮發(fā)性總酯含量變化Fig.6 Variations of Jiupei total esters in the fermentation of China strong aroma baijiu

2.7 主要差異性代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律

2.7.1 酸類物質(zhì)的變化規(guī)律

窖池不同部位酒醅的發(fā)酵進程，受窖內(nèi)氣溫、厭氧條件、微生物群落等諸多因素影響，結(jié)果表現(xiàn)為酒醅的風味物質(zhì)隨發(fā)酵時間變化，并具有顯著差異[27,28]。因此決定對乙酸、丁酸、己酸、乳酸乙酯、己酸乙酯、亞油酸乙酯、十六酸乙酯的時空變化規(guī)律深入跟蹤監(jiān)測。

通過研究酒醅發(fā)酵過程的差異性酸類物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同部位酒醅的己酸、丁酸整體上呈現(xiàn)先增加較緩（0～33 d），中后期呈迅速增加的趨勢；整體上邊緣酒醅的己酸、丁酸含量高于中心酒醅，其己酸、丁酸含量均在76 d 達到峰值，分別為199.70、26.67 μg/g。隨發(fā)酵時間增加，中心酒醅的乙酸含量在0～33 d 左右呈上升趨勢，隨后開始降低至發(fā)酵結(jié)束。Hu 等[29]研究結(jié)果表明：發(fā)酵環(huán)境、微生物種群和原材料顯著影響有機酸的含量，發(fā)酵后期酒醅的有機酸主要為乙酸，部分乙酸將被某些群落中的微生物代謝，因此發(fā)酵過程中乙酸含量顯著增加然后逐漸減少的現(xiàn)象。邊緣酒醅的乙酸含量增加明顯，到54 d 時達到峰值，最高達132.08 μg/g，略高于中心酒醅乙酸含量（圖7），這可能是因為邊緣酒醅靠近窖泥，窖泥中乙酸菌群落的生理活動利于乙酸生成[30]。發(fā)酵過程中，丁酸含量最低，可能因為丁酸作為己酸代謝途徑的中間物，合成己酸消耗了丁酸。由此可知，在發(fā)酵前期，酒醅己酸、乙酸和丁酸并未大量積累[31]，表明在濃香型白酒釀造工藝中，延長發(fā)酵周期，可以提高酒醅中風味物質(zhì)的含量。

圖7 酒醅發(fā)酵過程重要酸類物質(zhì)的變化情況Fig.7 Content changes of important acid in Jiupei

2.7.2 酯類物質(zhì)的變化規(guī)律

通過研究窖池邊緣酒醅和中心酒醅重要酯類物質(zhì)含量的變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：邊緣酒醅的十六酸乙酯和亞油酸乙酯含量整體上呈現(xiàn)先增加較緩（0～33 d），中后期呈迅速降低的趨勢，而中心酒醅的十六酸乙酯和亞油酸乙酯含量在不同發(fā)酵時間段呈上升趨勢（圖8），這與酒醅中大量風味物質(zhì)在發(fā)酵前期形成的結(jié)果一致。中心酒醅的十六酸乙酯、亞油酸乙酯含量均在76 d 達到峰值，分別為23.14、12.90 μg/g，在發(fā)酵后期其含量皆低于邊緣酒醅。亞油酸乙酯具有抗癌、調(diào)控代謝、促進動物生長發(fā)育等性能[32]，這說明白酒可能具有一定的保健功效在發(fā)酵中期（8～33 d），乳酸乙酯含量處于較快的上升階段，此后乳酸乙酯含量呈下降趨勢，但在18～33 d 中心酒醅乳酸乙酯含量迅速上升，隨后呈下降趨勢。整體上，己酸乙酯和乳酸乙酯的生成在前54 d 為正相關(guān)，而隨后中心酒醅的己酸乙酯含量有所減少，可能是由于酒醅中微生物需要補充能源物質(zhì)來維持其生理需要，此時酯類物質(zhì)主要起分解作用，酯類合成較少。而邊緣酒醅的己酸乙酯含量在發(fā)酵后期保持平穩(wěn)，這可能是因為酒醅中的己酸主要用于合成己酸乙酯，在發(fā)酵中后期己酸累計量增多，滿足己酸乙酯的合成需要，因此，己酸乙酯的含量呈增加趨勢。

圖8 酒醅重要酯類物質(zhì)含量變化結(jié)果Fig.8 Content changes of important ester in Jiupei

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME-GC-MS 法對濃香型白酒不同部位酒醅的主要風味物質(zhì)和發(fā)酵過程差異性代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律進行了分析。邊緣酒醅檢出132 種風味物質(zhì)，其中酯類44 種，醇類26 種，酸類14 種；中心酒醅的風味物質(zhì)有127 種，其中酯類為58 種，醇類27 種，酸類為15 種，發(fā)酵后期風味物質(zhì)種類數(shù)量間變化較大。

使用SIMCA-P 軟件根據(jù)定量結(jié)果分析出了7 差異代謝物，包括乙酸、丁酸、己酸、乳酸乙酯、己酸乙酯、亞油酸乙酯、十六酸乙酯。己酸、丁酸、乙酸含量在發(fā)酵前期快速增加，之后略有緩慢增加趨勢，而丁酸和己酸的含量在發(fā)酵50 d 后持續(xù)增加，直至發(fā)酵結(jié)束。在發(fā)酵前期，酒醅的十六酸乙酯和乳酸乙酯整體上呈現(xiàn)先增加較緩（0～33 d），中后期呈逐漸降低的趨勢，酒醅中的亞油酸乙酯和己酸乙酯呈緩慢增加趨勢。

本文比較分析了濃香型白酒酒醅發(fā)酵過程主要風味物質(zhì)在時空層面的差異性，為進一步研究固態(tài)發(fā)酵過程提供了理論依據(jù)。