狗頭棗ACO Ⅰ基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

尚秉眾，田瑞康，雒淑婷，王真珍，陳國梁，2，3*

（1.延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；2.陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.陜西省黃土高原菌產(chǎn)業(yè)生態(tài)循環(huán)發(fā)展工程技術(shù)研究中心，陜西 延安 716000）

棗樹（ZizyphusjujubeMill）是原產(chǎn)于我國的最具特色和優(yōu)勢的果樹之一。近年來國內(nèi)外市場對(duì)鮮棗的需求量日漸增加［1］，但是鮮棗采摘后易失水、皺縮，果肉酒軟、褐變、腐爛，保鮮期極短，大大縮短了鮮棗市場的貨架期［2］。乙烯作為一種氣態(tài)的植物激素，在生理、生化和分子水平上參與果實(shí)成熟軟化［3-4］。乙烯生物合成途徑中有兩個(gè)關(guān)鍵反應(yīng)：在第一個(gè)反應(yīng)中，S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）被ACC-合酶（ACS）轉(zhuǎn)化為1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）；在第二個(gè)反應(yīng)中，ACC 被ACC 氧化酶（ACO）轉(zhuǎn)化為乙烯。其中ACO 是乙烯生物合成中的關(guān)鍵限速酶［5］。研究表明，ACO 基因?yàn)槎嗷蚣易寰幋a的，在番茄中擁有9 個(gè)ACS 和5 個(gè)ACO 基因，其中在果實(shí)成熟過程中參與乙烯代謝的ACO Ⅰ為主要表達(dá)基因［6-8］，故采用RNAi 技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行特異性沉默來提高其果實(shí)的耐儲(chǔ)藏性成為可能，而有關(guān)以ACO 基因?yàn)榘袠?biāo)利用RNAi 技術(shù)改變其耐貯性的報(bào)道較多。吳曉慶等［9］通過正義，反義ACO 基因轉(zhuǎn)化石竹得到了花期較長的石竹材料；胡春華等［10］通過反義技術(shù)抑制香蕉ACO基因，得到了成熟期相比于對(duì)照推遲了十天的轉(zhuǎn)基因香蕉；張巖等［11］也通過RNAi 技術(shù)對(duì)雙孢蘑菇的ACO 基因進(jìn)行干擾，有效的降低了其表達(dá)量，并使ACO 酶活力降低至68%以上。目前，RNAi 技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于番茄、珠子參、柑橘、草莓、馬鈴薯等［12-16］研究中。但將RNAi 技術(shù)應(yīng)用在棗屬植物研究相關(guān)基因功能還鮮有報(bào)道?；诖?，本文選取狗頭棗ACO Ⅰ基因保守序列作為靶標(biāo)構(gòu)建RNAi表達(dá)載體［17］，以木棗葉片為外植體對(duì)其進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，以期獲得轉(zhuǎn)基因材料，為培育出耐貯藏的轉(zhuǎn)基因紅棗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ZK品系木棗試管苗，由陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌LBA4404、質(zhì)粒pGM-TR（含基因片段ACO Ⅰ3-4、pART27 與pKANNⅠBAL 均為本課題組保存。實(shí)驗(yàn)所需的各種酶均購自TaKaRa公司。

1.2 引物與酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)

引物與酶切位點(diǎn)組成：

F：5′-GCGGATCCBamHⅠCTCGAGXhoⅠATGAAATT GGAGACACTAGCTGAGG-3′

R：5′-GCATCGATClaⅠGAATTCEcoRⅠAACATTAGT TTCCACTGCTTTC-3′

1.3 RNAi表達(dá)載體pART ACO I3-4的構(gòu)建

采用XhoⅠ/EcoR Ⅰ雙酶切pGM-TR（含ACO Ⅰ3-4）及pKANNⅠBAL載體，分別回收靶標(biāo)片段及線性載體并進(jìn)行連接，獲得pKF1 載體（含正向片段）；再將pGM-TR 和pKF1 載體用BamH Ⅰ/ClaⅠ雙酶切，分別回收靶標(biāo)片段及線性載體pKF1 并進(jìn)行連接，得到中間載體pKF（含正反向片段）。用NotⅠ分別酶切pKF 與pART 27 質(zhì)粒載體，回收4 200 bp 目的片段并與pART 27線性載體連接，得到了pART ACOⅠ3-4植物表達(dá)載體（圖1）。

圖1 pART ACO Ⅰ3-4載體構(gòu)建過程

1.4 木棗葉片分化及繼代培養(yǎng)Kan選擇壓篩選

設(shè)置了含有5、10、15、20、25、30 mg·L-1Kan 濃度梯度的葉片分化培養(yǎng)基及繼代培養(yǎng)基進(jìn)行Kan選擇壓的篩選實(shí)驗(yàn)。選取生長健壯生長20 d 左右的木棗組培苗將其葉片剪成大小約為0.5 cm2的小塊、將莖芽切段分別接種在相應(yīng)培養(yǎng)基上，觀察葉片愈傷組織形成及莖芽繼代生長情況并記錄，進(jìn)行Kan選擇壓的確定。

1.5 木棗遺傳轉(zhuǎn)化及篩選鑒定

將pART ACOⅠ3-4表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404 中獲得工程農(nóng)桿菌，對(duì)ZK 品系木棗苗葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在MS固體培養(yǎng)基礎(chǔ)上每升添加6-BA 1.0 mg，IBA 0.2 mg，TDZ 0.01 mg 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上每升添加AgNO30.5 mg 作為共培養(yǎng)基，在共培養(yǎng)基中添加適量Carb+Kan 進(jìn)行選擇抑菌培養(yǎng)基。將抗性篩選獲得的陽性再生木棗植株的葉片作為材料，利用DNA 提取試劑盒提取植物DNA組并進(jìn)行PCR與電泳鑒定。

2 結(jié)果分析

2.1 pART ACO Ⅰ3-4表達(dá)載體的成功構(gòu)建

獲得的pKF1 經(jīng)XhoⅠ/EcoR Ⅰ酶切及PCR 鑒定均獲得大小約為600 bp 的片段（圖2）與預(yù)期大小一致，表明成功獲得pKF1。將pKF 用NotⅠ酶切，經(jīng)電泳檢測得到大小約為4 200 bp 和3 100 bp 的片段（圖3）與預(yù)期結(jié)果一致，表明中間載體構(gòu)建成功。將得到的pART ACO Ⅰ3-4分別用BamH Ⅰ/ClaⅠ雙酶切及EcoR Ⅰ單酶切，電泳共檢出大小約為1 300 bp，600 bp 和750 bp 的三條帶（圖4），與預(yù)期結(jié)果一致；再用Hind Ⅲ、XhoⅠ分別酶切pART ACO Ⅰ3-4，電泳出現(xiàn)約1 000 bp、2 000 bp 大小的片段（圖5）。對(duì)pART ACO Ⅰ3-4進(jìn)行PCR 擴(kuò)增鑒定，結(jié)果出現(xiàn)了一條大小約為600 bp 的條帶（圖6），說明pART ACOⅠ3-4表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 pKF1酶切與PCR鑒定

圖3 pKF酶切圖

圖4 pART ACO Ⅰ3-4的酶切鑒定

圖5 pART ACO Ⅰ3-4的酶切鑒定

圖6 pART ACO Ⅰ3-4的電泳鑒定

2.2 Kan選擇壓的確定

木棗組培苗在10 mg·L-1Kan 的繼代培養(yǎng)基上能夠正常生長，隨著繼代培養(yǎng)基中Kan濃度的升高，木棗組培苗的葉子逐漸變黃，開始出現(xiàn)白化現(xiàn)象，生長態(tài)勢受阻。直到繼代培養(yǎng)中Kan濃度升為30 mg·L-1時(shí)，木棗組培苗葉子全部變黃、白化，并且死亡。故將30 mg·L-1Kan 濃度設(shè)為木棗遺傳轉(zhuǎn)化再生苗繼代選擇培養(yǎng)基的濃度上限。在Kan 濃度為5 mg·L-1時(shí)，葉片出愈率為98.3%，愈傷組織不定芽分化率為61.7%；當(dāng)Kan 濃度達(dá)到10 mg·L-1時(shí)，葉片出愈率為37.7%，愈傷組織不定芽分化率11.7%，當(dāng)Kan 濃度達(dá)到15 mg·L-1時(shí)，葉片出愈率為6.7%，愈傷組織不定芽1.7%。當(dāng)Kan濃度達(dá)到20 mg·L-1時(shí)，愈傷組織趨于死亡，無不定芽分化（圖7），所以可將20 mg·L-1Kan濃度設(shè)為木棗葉片遺傳轉(zhuǎn)化愈傷組織及不定芽形成的Kan標(biāo)記選擇壓濃度。

圖7 Kan選擇壓的確定

2.3 轉(zhuǎn)化植株的篩選與PCR鑒定

共侵染木棗葉塊600片，共培養(yǎng)之后，放入暗箱進(jìn)行暗培養(yǎng)3 d，之后移到光下進(jìn)行培養(yǎng)。4 周后分化出愈傷組織及并逐漸分化成苗（圖8A）；而對(duì)照組葉片沒有愈傷組織形成及分化并且開始發(fā)黃（圖8B）。以分化成苗植株葉片DNA 為模板（圖9），經(jīng)過PCR 與電泳檢測鑒定，陰性對(duì)照只能擴(kuò)增出一個(gè)條帶，大小約為750 bp，然而轉(zhuǎn)化再生植株除可以擴(kuò)增出兩條條帶，除了陰性對(duì)照組的750 bp 條帶外，還能擴(kuò)增出一條大小約為600 bp 的特異性目的條帶（圖10），初步證明目的基因轉(zhuǎn)化成功。

圖8 木棗愈傷組織及不定芽的形成在分化培養(yǎng)基上

圖9 陽性苗在30 mg·L-1 Kan選擇壓下的生長情況

圖10 陽性植株的PCR檢測

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

鮮棗采收后不易保鮮、不耐貯藏，其果實(shí)保鮮期的長短是影響鮮果銷售價(jià)值的關(guān)鍵品質(zhì)，是影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要因素之一，嚴(yán)重制約著紅棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［18］。目前采用RNAi 技術(shù)賦予植物抗性和調(diào)控植物代謝等領(lǐng)域已研發(fā)出多種具有優(yōu)良性狀的作物，如已成功培育出耐貯藏轉(zhuǎn)基因番茄、桃子、哈密瓜等［19-21］，表明通過調(diào)控ACO 基因的表達(dá)可達(dá)到調(diào)控乙烯的生成，緩解果實(shí)成熟衰老速度，提高果實(shí)的耐貯性。人們在棗基因組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)有ZjACO1、ZjACO2和ZjACO3等3 個(gè)ACO 同源基因且其相對(duì)表達(dá)量與果實(shí)成熟度呈顯著正相關(guān)，其中ZjACO1在棗果實(shí)七個(gè)不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式具有極顯著差異［22］，因此ZjACO1與果實(shí)成熟度相關(guān)性最高，而我們沉默的靶標(biāo)基因正是ZjACO1。

棗品種繁多，呼吸類型復(fù)雜，薛夢林等［23］認(rèn)為棗為非呼吸躍變型果實(shí)，由于非躍變型果實(shí)成熟衰老過程產(chǎn)生的乙烯遠(yuǎn)低于躍變型果實(shí)，乙烯被認(rèn)為在非躍變型果實(shí)成熟衰老中發(fā)揮的作用非常有限。然而，在對(duì)柑橘果實(shí)的研究表明，低水平的內(nèi)源乙烯調(diào)控了果實(shí)的成熟衰老。近年來，隨著乙烯參與非躍變型果實(shí)成熟衰老相關(guān)研究陸續(xù)報(bào)道，研究人員發(fā)現(xiàn)，非躍變型果實(shí)諸多成熟相關(guān)過程也直接受乙烯調(diào)控，且非躍變型果實(shí)和躍變型果實(shí)品質(zhì)變化的某些分子調(diào)控途徑非常相似［24］。越來越多的研究表明，乙烯在非躍變型果實(shí)成熟衰老的調(diào)控中扮演著重要的角色。如在香蕉、荔枝、柑橘和番茄等［25-28］果實(shí)的延遲成熟、延長保質(zhì)期等方面取得成功。雖然ACO 是催化乙烯生物合成途徑的最后關(guān)鍵步驟，并作為靶向基因構(gòu)建了內(nèi)含子嵌入的倒置重復(fù)序列載體對(duì)其進(jìn)行調(diào)控，但干擾效果如何及該基因?qū)椀某墒旌蛢?chǔ)藏影響如何，還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2 結(jié)論

成功構(gòu)建了ihRNAi 植物表達(dá)載體，初步篩選到木棗葉片愈傷組織分化培養(yǎng)基，其配方為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1+TDZ 0.01 mg·L-1，添 加0.5 mg·L-1Carb+20 mg·L-1Kan 可作為篩選培養(yǎng)基。確定了木棗葉片愈傷組織形成Kan 篩選濃度為20 mg·L-1，再生苗的Kan 篩選濃度為30 mg·L-1。采用葉盤法對(duì)木棗進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)抗生素篩選和PCR 檢測，初步得到了16株陽性木棗轉(zhuǎn)基因植株。