基于新抗原篩選的腫瘤疫苗改造策略研究進展

趙董麗，朱影，黃常新

1.浙江中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院，浙江杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，浙江杭州 310000；3.杭州師范大學附屬醫(yī)院腫瘤科，浙江杭州 310000

腫瘤細胞基因組突變可轉錄、翻譯產生異常蛋白質，異常蛋白質酶解生成的異源性肽與正常細胞表達的氨基酸序列并不一致，其可被抗原提呈細胞中的主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）所識別，MHC可將抗原肽提呈至抗原提呈細胞表面，供T細胞受體（T cell receptor，TCR）所識別和活化，最終激活細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）發(fā)揮特異性抗腫瘤免疫反應。自腫瘤特異性抗原、腫瘤相關抗原等相關研究開展至今，抗原的發(fā)現(xiàn)與抗原改造便如影隨形，成為基于抗原肽抗腫瘤免疫治療中最主要的兩大問題。

1 腫瘤新抗原的鑒定篩選技術

腫瘤新抗原的體外篩選是將腫瘤組織全外顯子測序、轉錄組測序、蛋白質譜、T細胞組庫測序、計算機機器學習預測新抗原與體外實驗等技術聯(lián)合，鑒定具有抗腫瘤免疫效應的高效腫瘤新抗原，見圖1。

圖1 腫瘤新抗原的體外篩選技術

1.1 外顯子測序技術

研究人員使用高通量測序技術，將腫瘤細胞中的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）與正常健康組織進行比較，找到腫瘤患者個體化的非同義突變，以預測腫瘤特異性新抗原。2017年，Sahin等[1]首次將個體化突變體疫苗應用于人體，通過外顯子測序技術全面識別個體突變，設計和合成針對黑色素瘤患者的個體化腫瘤疫苗，結果發(fā)現(xiàn)所有接種該疫苗的受試者體內均產生強大且高效的特異性抗腫瘤T細胞應答，5例轉移瘤患者中的2例患者表現(xiàn)出與疫苗相關的客觀緩解，此研究開辟新抗原免疫治療道路。

外顯子測序技術的測序數據量大、測序深度高，測序技術已較為成熟，檢測到的突變基因較可靠，已在臨床和科研中廣泛應用。但RNA轉錄、蛋白質翻譯修飾及后續(xù)酶解等一系列“黑箱”過程中的不可預知性也極大地制約其應用。

1.2 蛋白質譜技術

基于蛋白質譜技術從腫瘤細胞表面分離人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）結合的肽段是鑒定HLA限制性新抗原的可靠方法。Bassani-Sternberg等[2]率先應用先進的質譜技術直接從黑色素瘤患者的原始腫瘤組織中找到突變的肽配體，這些肽段被認為是與腫瘤免疫治療策略高度相關的真正新表位。Chong等[3]利用基于質譜技術的分析方法表征非常規(guī)的HLA肽庫，該方法可準確鑒定數百種共享的腫瘤特異性非常規(guī)HLA肽。

質譜技術可鑒定數以千計的非典型多肽，大多數非典型多肽來自于蛋白質編碼區(qū)域以外序列或由非典型抗原加工產生[4-6]。這反映從基因表達到蛋白質翻譯，再到蛋白酶體酶解為抗原肽等過程需經歷漫長“幕后”操作，但因大多數抗原表位與HLA結合時間較短，洗脫時易發(fā)生分離，質譜技術檢測突變多肽的敏感度較低、假陰率較高，且質譜技術對樣本要求較高，單純依靠質譜技術鑒定與HLA結合的肽段，很難全面獲取真實表達的新抗原。

1.3 T細胞測序技術

鑒于程序性死亡蛋白1單抗抗腫瘤免疫治療的顯著獲益，TCR等表面分子已成為有發(fā)展前景的生物標志物[7]。TCR表達的豐度差異可部分解決新抗原篩選、肽加工和MHC呈遞候選表位靶標的臨床實用性考量等問題，從而輔助疫苗設計[8]。

作為基于新抗原等多種免疫治療的生物標志物，TCR可間接反映新抗原能否引起特異性抗腫瘤免疫應答及應答的程度，其具有敏感度高且所需樣本較少等特點，并可應用于新型TCR或嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）的工程化免疫細胞治療等領域。TCR應用的主要問題是其在免疫應答過程中的動態(tài)變化，僅靠瞬時檢測結果缺乏客觀準確性，且現(xiàn)階段無法僅靠TCR準確預測新抗原表位，測序費用較高，故其尚未在臨床得到廣泛應用。

1.4 計算機新抗原預測技術

隨著生物信息學、人工智能和機器學習的日益發(fā)展，計算機預測新抗原成為可能。目前，常用的數據庫是將HLA-配體組數據整合到機器學習算法（如線性回歸和人工神經網絡）中，采用大量的訓練集和測試集以提高HLA等位基因型限制性新抗原預測能力，主流的預測數據庫包括NetCTL和NetCTLpan[9]。pMHC復合物能否被TCR識別是至關重要的預測因素，T-Scan作為一種TCR表位掃描方法，可系統(tǒng)鑒定T細胞有效識別的抗原，高通量發(fā)現(xiàn)和分析CTL的靶標，這非常有助于研究候選新抗原的免疫原性，為免疫治療提供新靶點[10]。

數據庫預測簡單便捷，但僅靠數據庫預測新抗原存在著大量與體外實驗不一致的結果，仍需更全面的肽表位信息及體外實驗驗證結果提高計算機預測的精度。

2 有效抗原表位的特征

免疫系統(tǒng)不僅能通過免疫監(jiān)視消除腫瘤，也能通過免疫編輯促使腫瘤復發(fā)轉移?；诖耍[瘤細胞會掩蓋其免疫原性特征，并誘導出利于免疫抑制的腫瘤微環(huán)境[11]。因此，鑒定并應用高免疫原性的特異性腫瘤抗原表位，才能有效預防腫瘤逃逸的發(fā)生，見圖2。

圖2 有效抗原表位的特征

2.1 MHC限制性肽表位的殘基特征

2.1.1 抗原表位的HLA錨定殘基特征 Robbins等[12]將黑色素瘤細胞系2098上表達的3種突變抗原鑒定為TIL2098的3個靶標，對應的特異性過繼細胞治療使得腫瘤發(fā)生消退，并在這一過程中發(fā)現(xiàn)靶標之一的酪蛋白激酶1α1中作為主要錨定位點之一的第2位殘基由絲氨酸突變?yōu)榱涟彼岷?，酪蛋白激?α1肽與HLA-A * 0201結合親和力提高近10倍。另有研究發(fā)現(xiàn)，HLA配體的氨基端或羧基端特定位置上常存在某些氨基酸的顯著富集和（或）耗盡現(xiàn)象。如在HLA-Ⅱ配體中，酪氨酸常在配體兩端的序列中顯著富集，而組氨酸和脯氨酸通常在這些區(qū)域中缺失[13]。在HLA-Ⅰ配體中，丙氨酸、賴氨酸、絲氨酸和精氨酸常在配體羧基端顯著富集，而脯氨酸在配體兩端耗盡，同時酸性殘基和某些疏水殘基在HLA相關肽下游表達不足[14]。研究者們所觀察到的肽側翼特征可反映蛋白酶的切割偏好，有利于腫瘤疫苗的研制。

2.1.2 殘基特定表達與免疫原性的關系 MHC結合預測工具對25%的含半胱氨酸表位的抗原肽預測親和力均低估至1/3甚至更多[15]，另有研究發(fā)現(xiàn)，色氨酸耗竭所導致的色氨酸-苯丙氨酸替代物可擴大細胞表面呈遞的抗原表位，以激活T細胞反應[16]。這些特定氨基酸殘基的特征可有效應用于抗原肽的改造。

2.1.3 抗原表位殘基修飾的特征 Bassani-Sternberg等[17]在利用質譜洗脫的免疫肽段中檢測到大量的磷酸化HLA多肽，發(fā)現(xiàn)78%的磷酸化發(fā)生在絲氨酸上，且這種修飾在HLA-Ⅰ配體的9-11肽第4位最為突出，同時發(fā)現(xiàn)檢測到的磷酸化HLA多肽中有一個非常保守的基序，其第1位氨基酸殘基（P1）首選精氨酸和賴氨酸，第4位氨基酸殘基（P4）為磷酸化位點，該基序可增加低親和力肽HLA結合力，并通過P4的磷酸化向TCR直接呈遞磷酸化位點提高免疫原性。

在基于人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）腫瘤疫苗研究中發(fā)現(xiàn)，自身免疫耐受可阻止HER2疫苗誘導更持久高效的抗腫瘤免疫；但在通用T細胞表位中引入對硝基苯丙氨酸可打破HER2的自我耐受，誘導強烈的HER2特異性體液免疫和細胞免疫，顯著抑制HER2+B16F10腫瘤細胞的生長[18]。這對開發(fā)治療性癌癥疫苗具有重要意義。

2.2 肽表位的固有特性與HLA相互作用

研究發(fā)現(xiàn)，HLA等位基因偏好于九肽的肽配體，這些HLA等位基因結合位點更優(yōu)先允許這些短肽嵌入到其“口袋”中；同時，同源肽的高表達豐度可提高MHC-肽的結合穩(wěn)定性[14]。另有研究表明，TCR接觸殘基的疏水性是免疫原性表位的標志，暴露疏水結構域可顯著提高蛋白酶體降解和MHC呈遞的速度[19]。以上這些特點可為腫瘤疫苗的研發(fā)改進提供重要的可行性依據。

2.3 復雜的變異結構

融合蛋白、剪接異構體、突變基因的異常表達內含子等復雜的變異結構可能是高免疫原性抗原肽的主要來源。相當大比例的HLA結合肽可通過剪接/融合來自一個或兩個不同蛋白質的不連續(xù)肽片段而產生[20-21]。在剪接肽中，半胱氨酸殘基常在剪接肽的裂解位點富集，對抗原肽的制備意義重大[22]。

多項研究證實，復雜變構對新抗原的制備具有重大意義和應用價值。Yang等[23]在一位頭頸部鱗狀細胞癌患者中發(fā)現(xiàn)DEK-AFF2融合衍生的九肽，其在免疫治療反應期間出現(xiàn)DEK-AFF2特異性T細胞反應。Hoyos等[24]研究發(fā)現(xiàn)，異常剪接衍生的外顯子-外顯子連接產生的抗原肽具有MHC-I結合潛力，有望作為腫瘤新抗原。

3 基于免疫原性的肽表位改造

3.1 抗原表位的殘基替換

將位于黑色素細胞上的酪氨酸酶相關蛋白2抗原表位與HLA-A*0201分子作用的位點進行殘基替換，替換后肽段的親和力和穩(wěn)定性有所提升，其對T細胞的刺激活化能力及對腫瘤細胞的殺傷能力均優(yōu)于野生型酪氨酸酶相關蛋白2表位[25]。Uchtenhagen等[26]研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤相關表位gp10025-33的第3位置（p3）P修飾（將肽位置3替換為脯氨酸）可直接提高該表位與TCR的親和力?？乖慕Y合基序的氨基端錨定位點（主要是p2和p3）對穩(wěn)定pMHC-I復合物起關鍵作用[27]?？乖膒2以酪氨酸代替天冬氨酸，或在氨基端用亮氨酸代替脯氨酸/精氨酸可加固肽的構象穩(wěn)定性以利于MHC結合的肽[28]。依據殘基間的pi-pi堆砌相互作用對單殘基進行替換，特別是p9（如p9F和p9W）被替換后，提高弱抗原的免疫原性、抗原與HLA之間的結合自由能及CTL活化水平[29]。

3.2 抗原殘基結構的修飾

較小的多肽具有化學合成優(yōu)勢，但易受內源性蛋白酶的快速降解。系列研究發(fā)現(xiàn)，引入足夠數量和分布的α螺旋骨架修飾來阻礙蛋白酶作用，可解決小分子肽易被降解的不足[30-31]。糖尿病研究發(fā)現(xiàn)天然表位翻譯后修飾（包括瓜氨酸化、氯化、脫酰胺和氧化）后，44%胰島素-B衍生肽與HLA-A * 02：01的結合能力增強，產生與HLA結合親和力更強的肽，增強T細胞識別和活化[32]。腫瘤新抗原肽是否有此類修飾效應，尚需實驗予以證實。

3.3 抗原多肽偶聯(lián)胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（cytidinephosphate-guanosine，CpG）

免疫佐劑可部分解決新抗原肽弱免疫原性的問題。其中，胞嘧啶-硫代磷酸鹽-鳥嘌呤寡聚脫氧核苷酸（CpG oligonucleotide，CpG ODN）因具有低毒、高效等特點而成為近年來常用的免疫佐劑，其包含未甲基化的CpG二核苷酸序列，類似于細菌DNA中常見的序列，可特異性觸發(fā)Toll樣受體9，有效觸發(fā)樹突狀細胞的活化和成熟，使其分泌大量細胞因子、趨化因子和干擾素，有助于增強抗原的呈遞，并誘導極化輔助性T細胞1型免疫應答，見圖3。研究表明抗原肽和CpG ODN須在同一抗原提呈細胞中共定位，如將抗原肽與CpG以共價偶聯(lián)、物理吸附、納米載體包裹等多種方式形成新型多肽疫苗，使疫苗進入同一抗原提呈細胞內并同步釋放，以產生最有效的抗原特異性免疫應答[33]。

圖3 新型多肽疫苗活化CD8+T細胞

4 小結與展望

綜合國內外對新抗原篩選與免疫原性改進的相關研究發(fā)現(xiàn)，新抗原的大規(guī)模臨床推進與應用仍需深入研究，從而簡化篩選流程、鑒定高效腫瘤新抗原。目前，新抗原免疫原性的改造仍聚焦于提高TCR-HLA-peptide三者復合物的親和力與穩(wěn)定性，積極研究并探索其他可能影響免疫效應的因素，并基于體內外實驗及臨床研究的結果，對其安全性和有效性進行評估。