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    自噬和凋亡在口腔黏膜下纖維性變上皮組織中的表達(dá)

    2024-01-08 06:48:20朱冰玉吳穎芳
    中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生 2023年36期
    關(guān)鍵詞:棘層陽(yáng)性細(xì)胞上皮

    朱冰玉,吳穎芳

    1.寧波大學(xué)附屬人民醫(yī)院口腔科,浙江寧波 315040;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院口腔科,湖南長(zhǎng)沙 410008

    口腔黏膜下纖維性變(oral submucous fibrosis,OSF)是一種發(fā)生于口腔黏膜的慢性、潛在惡性疾病[1]。OSF常表現(xiàn)為口干、進(jìn)食刺激性食物有燒灼感、進(jìn)行性張口受限等,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量;其主要病理改變?yōu)樯掀そM織萎縮、固有層膠原纖維的異常堆積和固有層血管閉塞、減少[2]。盡管OSF主要是成纖維細(xì)胞疾病,但上皮位于黏膜的最表面,檳榔粗糙纖維的機(jī)械摩擦及多種化學(xué)成分首先作用于口腔黏膜的上皮組織,因此上皮的變化對(duì)OSF的發(fā)生、發(fā)展有重要作用。

    自噬與凋亡是細(xì)胞程序性死亡的兩種方式,對(duì)維持細(xì)胞代謝和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義。自噬既可通過(guò)降解異常的胞質(zhì)和細(xì)胞器為細(xì)胞提供氨基酸和能量拮抗凋亡,也可協(xié)同凋亡促進(jìn)細(xì)胞的死亡,或作為凋亡的備份機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[3-4]。Zhao等[5]證實(shí),自噬通過(guò)減少肺泡上皮細(xì)胞的凋亡減輕二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化。研究發(fā)現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化中,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1可通過(guò)活性氧簇激活自噬,加重腎小管上皮細(xì)胞的凋亡[6]。但在OSF病程進(jìn)展中上皮組織自噬、凋亡的發(fā)生情況及相互關(guān)系目前尚無(wú)相關(guān)研究。本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)自噬標(biāo)志物蛋白LC3、P62與凋亡相關(guān)蛋白caspase-3在正??谇火つづcOSF早、中、晚期上皮組織中的表達(dá)水平,并分析OSF上皮組織中3種蛋白與臨床因素的相關(guān)性,為進(jìn)一步探討OSF的發(fā)病機(jī)制和治療提供一定的理論依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    收集2016-2019年于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院口腔科行組織病理活檢的90例OSF患者的頰黏膜標(biāo)本,根據(jù)《口腔黏膜病學(xué)》分為早、中、晚期各30例,分別為OSF早期組、OSF中期組、OSF晚期組[7]。同期收集30名無(wú)口腔黏膜疾病的健康者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡23~66歲;②無(wú)系統(tǒng)性疾病及免疫性疾病,無(wú)長(zhǎng)期用藥史;③OSF患者未經(jīng)特殊治療且不伴其他口腔黏膜病。排除標(biāo)準(zhǔn):①年齡<18歲;②有OSF治療史;③患有其他口腔黏膜疾病者。患者均簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)(倫理審批號(hào):201609053)。

    1.2 主要試劑

    LC3抗體(1∶50,美國(guó)CST公司)、caspase-3抗體(1∶50,美國(guó)CST公司)、P62抗體(1∶50,美國(guó)proteintech公司)、DAB顯色試劑盒、二步法免疫組化試劑盒。

    1.3 方法

    將收集的組織標(biāo)本固定于10%福爾馬林中,常規(guī)石蠟包埋切片,切片脫蠟至水,微波加熱抗原修復(fù),3% H2O2室溫孵育10min。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗,孵育一抗、二抗,PBS沖洗,DAB顯色。采用蒸餾水洗滌,蘇木精復(fù)染,蒸餾水沖洗,PBS返藍(lán)。不同濃度乙醇(60%~100%)脫水,中性樹(shù)膠封片、顯微鏡觀察。已知的陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照,PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

    1.4 結(jié)果判斷

    采用雙盲法,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野(400倍),通過(guò)染色程度(未染色計(jì)0分;淡黃色計(jì)1分;黃色計(jì)2分;棕黃色計(jì)3分)和陽(yáng)性細(xì)胞的比例(無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分;陽(yáng)性細(xì)胞<10%計(jì)1分;陽(yáng)性細(xì)胞10%~50%計(jì)2分;陽(yáng)性細(xì)胞50%~75%計(jì)3分;陽(yáng)性細(xì)胞>75%計(jì)4分)進(jìn)行分析。最后將染色程度與陽(yáng)性細(xì)胞的比例得分相乘,結(jié)果<3分為陰性表達(dá),≥3分為陽(yáng)性表達(dá)。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分率)[n(%)]表示,比較采用χ2檢驗(yàn),相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 上皮細(xì)胞層厚度的比較

    分析比較對(duì)照組健康者的口腔黏膜和OSF患者的上皮細(xì)胞層厚度(epithelial cell layer thickness,ET)。結(jié)果顯示與對(duì)照組健康者比較,OSF患者的ET顯著降低,且OSF晚期組患者的平均ET值最低。OSF早期組、OSF中期組、OSF晚期組患者的ET值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。所有OSF標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)上皮異常增生。

    表1 對(duì)照組健康者和OSF患者的ET比較(±s)

    表1 對(duì)照組健康者和OSF患者的ET比較(±s)

    注:與對(duì)照組比較,*P<0.05;與OSF早期組比較,#P<0.001;與OSF中期組比較,ΔP<0.001

    組別 對(duì)照組(n=30) OSF早期組(n=30) OSF中期組(n=30) OSF晚期組(n=30) 上皮細(xì)胞層厚度(層) t P27.3±2.9 24.6±3.3 3.458 <0.05*17.3±2.5 9.755 <0.001#12.1±3.2 6.895 <0.001Δ

    2.2 LC3、P62和caspase-3蛋白在各組中的表達(dá)比較

    LC3和caspase-3主要在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜中表達(dá),呈棕黃色或淺黃色;在正??谇火つぶ兄饕诮腔瘜?、顆粒層和棘層上部表達(dá),基底層幾乎不表達(dá),而在OSF中期和晚期患者的整個(gè)上皮組織中都有表達(dá),見(jiàn)圖1和圖2。OSF患者的上皮組織中LC3和caspase-3的蛋白表達(dá)水平顯著高于健康者(P<0.001);OSF早期組、OSF中期組和OSF晚期組患者的上皮組織中LC3和caspase-3的蛋白表達(dá)水平呈遞增趨勢(shì),各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。P62主要在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中表達(dá),呈棕黃色或淺黃色。在正常黏膜整個(gè)上皮組織細(xì)胞中均有染色,在OSF中、晚期主要在上皮中的基底層至棘層表達(dá),角化層的表達(dá)較少,見(jiàn)圖3。OSF中期組和OSF晚期組患者的上皮組織中P62的蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05);OSF早期組與對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);OSF早期組、OSF中期組和OSF晚期組患者的上皮組織中P62的蛋白表達(dá)水平呈遞減趨勢(shì),各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

    圖1 LC3在正??谇火つぜ癘SF上皮組織中的表達(dá)(SP×400)

    圖2 caspase-3在正常黏膜及OSF上皮組織中的表達(dá)(SP×400)

    圖3 P62在正常黏膜及OSF上皮組織中的表達(dá)(SP×400)

    表2 LC3、P62和caspase-3蛋白在各組中的表達(dá)情況比較[n(%)]

    2.3 OSF上皮組織中LC3、P62和caspase-3蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

    LC3與caspase-3的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.320,P<0.05);P62和caspase-3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.554,P<0.001);LC3和P62的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.710,P<0.001),見(jiàn)表3。

    表3 LC3、P62和caspase-3蛋白在OSF上皮組織中的相關(guān)性分析[n(%),n=90]

    2.4 OSF患者的上皮組織中LC3、P62和caspase-3蛋白表達(dá)與臨床因素的關(guān)系分析

    OSF患者的上皮組織中LC3、P62和caspase-3蛋白表達(dá)在不同性別、年齡、吸煙因素的比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LC3、P62和caspase-3蛋白表達(dá)在張口度>3cm、2~3cm及<2cm中的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表4。

    表4 LC3、P62和caspase-3蛋白的表達(dá)與臨床因素的關(guān)系分析[n(%),n=90]

    3 討論

    OSF具有很高的癌變潛能,研究顯示OSF的惡性轉(zhuǎn)化率達(dá)6%[8]。近年來(lái)有研究者認(rèn)為上皮組織是OSF發(fā)生的起點(diǎn),上皮屏障受損,細(xì)胞釋放炎癥因子,促進(jìn)黏膜下層成纖維細(xì)胞異?;罨?,膠原蛋白的合成和分泌增加[9]。堆積的膠原纖維和阻塞的血管,加劇上皮層缺血、缺氧的情況,造成營(yíng)養(yǎng)供給障礙,形成惡性循環(huán)[10]。本研究證實(shí)與正??谇火つそM織相比,OSF患者的口腔上皮組織變薄。

    凋亡通過(guò)清除衰老或異常細(xì)胞在機(jī)體中發(fā)揮維持細(xì)胞功能的關(guān)鍵作用[11]。caspase蛋白酶家族在凋亡中起至關(guān)重要的作用,激活的caspase切割多種底物,引發(fā)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞核DNA斷裂、細(xì)胞質(zhì)收縮和細(xì)胞膜破裂等[12]。caspase-3是caspase家族中的重要成員之一,在細(xì)胞凋亡調(diào)控中一旦被激活,凋亡便進(jìn)入不可逆的階段[13]。本研究發(fā)現(xiàn)OSF患者上皮組織中caspase-3的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組健康者,且隨著OSF的加重呈遞增趨勢(shì)。Li等[14]研究表明,檳榔堿誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞凋亡與caspase-3的激活有關(guān)。因此,筆者推測(cè)在上皮細(xì)胞中,檳榔堿的細(xì)胞毒性可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。這種凋亡增加可能導(dǎo)致上皮細(xì)胞數(shù)量減少,從而引起上皮組織萎縮。

    自噬是細(xì)胞通過(guò)吞噬降解自身蛋白質(zhì)或細(xì)胞器的自我調(diào)節(jié)過(guò)程[15]。LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺的結(jié)合是自噬過(guò)程中的一個(gè)重要步驟,該結(jié)合形成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ被定位在自噬體的內(nèi)外膜上,從而發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。P62作為自噬標(biāo)志物蛋白與LC3在自噬體膜上結(jié)合,然后傳遞到自噬體中,在隨后形成的自噬溶酶體中降解[17]。因此,本研究聯(lián)合檢測(cè)LC3和P62的表達(dá),發(fā)現(xiàn)OSF患者的LC3表達(dá)增加且P62的表達(dá)降低,提示OSF上皮組織中自噬活性增強(qiáng),且與OSF的病理階段顯著相關(guān)。

    自噬和凋亡是細(xì)胞程序性死亡的兩種方式,二者既可相互拮抗促進(jìn)細(xì)胞存活,也可相互協(xié)同共同促進(jìn)細(xì)胞死亡。正常生理情況下,自噬一般處于基礎(chǔ)水平,將受損及衰老的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)降解再次循環(huán)利用以平衡細(xì)胞穩(wěn)定。本研究顯示OSF早、中、晚期患者出現(xiàn)自噬增強(qiáng)的情況,可能是上皮細(xì)胞受損,破壞細(xì)胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器,激活自噬溶酶體途徑,且隨著OSF的進(jìn)展自噬活性逐漸增加;在上皮組織中,角化層、顆粒層和棘層是LC3的主要表達(dá)區(qū)域,而P62主要在上皮中基底層至棘層表達(dá),這可能是該層次位于上皮組織的外層,承受來(lái)自外界環(huán)境的機(jī)械摩擦和檳榔堿等化學(xué)刺激的影響,導(dǎo)致上皮角化層至棘層上部的細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3與自噬活性表達(dá)呈正相關(guān),且隨著OSF加重,上升越明顯。筆者推測(cè)自噬和凋亡在OSF病變進(jìn)程中均發(fā)揮重要作用,并可能存在協(xié)同作用。在中期和晚期的OSF患者的口腔黏膜中,檳榔的長(zhǎng)期暴露可導(dǎo)致外層上皮細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變,從而引發(fā)一系列細(xì)胞反應(yīng),包括自噬活性的增加和細(xì)胞凋亡的顯著增加。

    通過(guò)相關(guān)因素分析,OSF患者的上皮組織中LC3、P62和caspase-3蛋白表達(dá)在不同性別、年齡、吸煙因素的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在張口度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    綜上所述,自噬標(biāo)志物蛋白LC3、P62與凋亡相關(guān)蛋白caspase-3異常表達(dá)在OSF的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用,確切的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。LC3、P62和caspase-3聯(lián)合檢測(cè)可為進(jìn)一步探討OSF上皮萎縮的發(fā)病機(jī)制和治療方法提供一定的理論依據(jù)。

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