田和平,鐘琦,周海航,王耿煥
嘉興市第二醫(yī)院神經(jīng)外科,浙江嘉興 314000
簇集素(clusterin,CLU)作為一種多功能分泌糖蛋白,具有調節(jié)凋亡、細胞與細胞間相互作用、蛋白質穩(wěn)定性、細胞信號傳導等多種生理功能,在多種病理狀態(tài)下表達水平升高,目前發(fā)現(xiàn)CLU在阿爾茨海默病、腦梗死、腦出血、多發(fā)性硬化、癲癇等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均呈高表達且發(fā)揮神經(jīng)元保護作用[1-2]。但其在顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)后是否表達以及能否發(fā)揮保護神經(jīng)細胞的作用等少有報道。本研究通過檢測急性中重度TBI后患者的血清及腦脊液CLU濃度,分析其與格拉斯哥昏迷評分(Glasgow coma score,GCS)、腦挫裂傷體積、鹿特丹CT評分的相關性,探討CLU在TBI中的表達及與TBI嚴重程度的關系。
選取2019年9月至2020年10月嘉興市第二醫(yī)院收治的102例急性中重度TBI患者納入研究并進行前瞻性隊列研究。納入標準:①有TBI病史;②顱腦CT檢查確診為TBI;③傷后12h內(nèi)入院;④首次GCS評分3~12分;⑤年齡20~70歲;⑥簽署知情同意書。排除標準:①神經(jīng)系統(tǒng)疾病、凝血功能障礙、惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、皮膚病者;②休克、生命體征不穩(wěn)定者;③中途退出或資料不完整者。按時間順序分為2個批次,第一批20例,行CLU在TBI后血清中時間表達研究,其中男12例,女8例;年齡20~61歲,平均(45.15±12.24)歲;體質量指數(shù)19.84~ 23.95kg/m2,平均(22.12±1.47)kg/m2;病史:高血壓6例(30%),糖尿病2例(10%)。同期選取在嘉興市第二醫(yī)院行體格檢查的20名體檢者為對照組,納入標準:同病例納入標準⑤和⑥;排除標準:同病例排除標準;其中男14名,女6名;年齡22~70歲,平均(43.75±12.98)歲;體質量指數(shù)20.70~ 23.82kg/m2,平均(22.40±1.85)kg/m2;病史:高血壓4例(20%),糖尿病4例(20%)。第一批患者與對照組體檢者之間的一般資料比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。第二批82例,參照第一批時間表達圖于血清CLU高表達時間行血清、腦脊液檢測,根據(jù)首次GCS評分分為兩組,按鹿特丹CT評分分為三組,按腦挫裂傷體積分為兩組;各組間患者的一般資料比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。本研究經(jīng)嘉興市第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過(倫理審批號:JXEY-2019JX161)。
表1 第二批患者組間一般資料比較
1.2.1 臨床資料的收集 采集首次GCS評分、鹿特丹CT評分、腦挫裂傷體積評估患者的TBI嚴重程度。GCS評分計分范圍:3~15分;鹿特丹CT評分計分范圍:1~6分;腦挫裂傷(顱腦CT掃描采集,CT值19~82Hu)體積=ABC/2(A:挫裂傷灶最大直徑;B:挫裂傷灶上與最大直徑垂直的最寬徑;C:CT軸位上挫裂傷灶累及的層面數(shù)×1cm),多處腦挫裂傷體積為單個病灶體積的總和。資料收集由本院兩名高年資神經(jīng)外科醫(yī)生完成。
1.2.2 標本的采集 血清:第一批患者為TBI后連續(xù)4d的晨血,對照組為健康體檢者化驗剩余的血清,第二批患者為參照第一批CLU時間圖上CLU高表達時間采集晨血;外周靜脈血2ml,置于促凝管中靜置2h,3000轉/min離心15min,吸取上層血清,采用上海生工血清白蛋白/免疫球蛋白清除試劑盒純化血清樣本,Bradford法測定蛋白質濃度,置于-80℃冰箱備用。腦脊液:第二批患者參照第一批CLU時間圖上CLU高表達時間當天腰椎穿刺收集腦脊液2ml,2000轉/min離心10min,置于-80℃冰箱備用。
1.2.3 Western blot法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測CLU的表達 Western blot法:取血清蛋白樣本各50g,經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離后電泳轉移至硝化纖維素濾膜(購自美國Amersham公司,孔徑:0.2μm),用5%脫脂牛奶封閉后,特異性一抗,CLU小鼠抗人單克隆抗體(購自美國Quidel公司)或內(nèi)參照β-actin(購自美國SantaCruz公司)孵育4℃過夜。之后三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(tris-buffered saline Tween-20,TBST)洗膜3次,每次15min,孵育二抗山羊抗小鼠lgG(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)2h,TBST洗膜3次,化學發(fā)光儀(購自美國Amersham公司)曝光顯影。用UVP imagestore7500成像系統(tǒng)成像,Chemilmager5500軟件分析條帶吸光度A值。ELISA:用CLU-ELISA試劑盒(購自武漢博士德生物工程有限公司)檢測樣本吸光度并計算CLU水平。
采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析,計數(shù)資料以例數(shù)(百分率)[n(%)]表示,比較采用χ2檢驗;符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用t檢驗或F檢驗,不符合正態(tài)分布的以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(Q1,Q3)]表示,組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗或Kruskal-WallisH檢驗;Spearman相關系數(shù)分析CLU濃度與其他因素的相關性;多元線性回歸分析影響CLU濃度的因素,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
與對照組入選者比較,第一批患者的血清CLU含量在TBI后1d增加并持續(xù)至傷后2d,于傷后3d顯著增加,約為對照組的3.5倍,傷后4d含量下降,見圖1。TBI傷后不同時間患者的血清CLU含量與對照組入選者分別進行兩兩比較,傷后1d、2d、3d與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);傷后3d分別與1d、2d比較,CLU差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明CLU在患者TBI后3d血清中顯著表達。
圖1 Western blot法檢測中重度顱腦損傷后患者的血清CLU表達
TBI后患者的血-腦脊液屏障被破壞,血清、腦脊液中蛋白表達時間基本一致,因血清CLU含量于傷后3d達到峰值,于是選取傷后3d這一時間采集第二批患者的血清、腦脊液,通過ELISA檢測CLU濃度。按GCS評分分組的中度(9~12分)、重度(3~8分)兩組和按鹿特丹CT評分分組的1~2分、3~4分、5~6分三組及按腦挫裂傷體積分組的<15ml、≥15ml兩組之間的患者血清CLU濃度差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖2A、C、E;腦脊液CLU濃度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且GCS評分重度組腦脊液CLU濃度高于中度組,見圖2B,鹿特丹CT評分的三組中腦脊液CLU濃度在5~6分組最高,3~4分組次之,1~2分組最低,見圖2D,腦挫裂傷體積≥15ml組腦脊液CLU濃度高于<15ml組,見圖2F。
圖2 按不同評估方法分組后比較TBI后患者的CLU濃度
采集第二批患者的研究數(shù)據(jù)行Spearman相關性分析顯示,腦脊液CLU濃度與GCS評分呈負相關(r=-0.542,P<0.05),與鹿特丹CT評分、腦挫裂傷體積呈正相關(r=0.414、0.738,P<0.05),見表2、圖3。將上述與腦脊液CLU濃度相關的因素行多元線性回歸分析,提示回歸方程顯著,F(xiàn)=42.566,P<0.05,TBI后腦挫裂傷體積對腦脊液CLU濃度的影響有統(tǒng)計學意義(β=8.074,P<0.001),見表3。
圖3 TBI患者腦脊液CLU濃度與GCS評分、鹿特丹CT評分、腦挫裂傷體積的線性散點圖
表2 Spearman相關性分析腦脊液CLU濃度與其他因素的相關性
人類CLU基因編碼定位于8號染色體(8p21-p12)上[3]。在發(fā)育和多種疾病病理過程中,CLU mRNA和蛋白表達均上調,且表達上調的CLU對心肌細胞、視網(wǎng)膜上皮細胞及肺細胞等均發(fā)揮重要的細胞保護作用[4-9]。CLU在腦組織內(nèi)同樣表達,且在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中表達增高,如阿爾茨海默病,Pick病、癲癇、缺血性腦血管病和多發(fā)性硬化等,高表達的CLU對缺血缺氧性疾病、退行性疾病均有拮抗作用[2,10-11]。本研究中,TBI后血清中CLU含量逐漸增高,并于傷后3d達到高峰,因此,CLU在TBI后同樣高表達。但CLU作為一種應激性細胞保護蛋白,也在機體處于緊張或嚴重應激狀態(tài)下表達增加[12]。為明確CLU含量的增高是TBI后機體應激反應導致還是與TBI嚴重程度有關,本研究對TBI嚴重程度與血清CLU含量進行相關分析。在評估TBI嚴重程度的方法中,臨床上最常使用GCS評分,其主要體現(xiàn)大腦的意識水平,因其缺乏解剖學及病理生理的客觀資料,所以具有一定的局限性;鹿特丹CT評分利用頭顱CT的5個病理解剖學特征包括環(huán)池的受壓程度、蛛網(wǎng)膜下腔出血或腦室出血、大腦中線移位程度及顱內(nèi)血腫等,直接反映腦損傷的病理解剖學程度。本研究利用腦挫裂傷體積評價腦損傷范圍作為補充,分別于整體意識水平、病理解剖學特征、腦損傷范圍等多方面行組間CLU濃度比較[13-14]。結果發(fā)現(xiàn),TBI后不同分組組間患者血清CLU濃度差異無統(tǒng)計學意義。分析原因:①CLU廣泛表達于各組織中,除大腦分泌CLU外,在人體還有多個臟器如心、肝、脾、肺、前列腺等也可表達CLU并分泌至血液中;另外,糖尿病、冠心病患者的血液中CLU含量也升高。因此,外周血CLU水平與多個臟器及系統(tǒng)的病理狀態(tài)相關,不能單一用腦組織的病理改變來解釋;②CLU隨腦脊液循環(huán)途徑轉運至血液的過程中可被多種受體攝取,因此,外周血中CLU水平并不能準確地反映其在腦組織內(nèi)或腦脊液中的真實表達[15]。
腦脊液成分的改變可直接反映腦組織的病理變化[16]。腦脊液中CLU含量較低(1.2~3.6μg/ml),Western blot法難以檢測,因此本研究采用ELISA替代[15]。腰椎穿刺獲取腦脊液是一項有創(chuàng)操作,為減少對受試者的創(chuàng)傷,本研究僅選取TBI后CLU峰值的單一時間行腰椎穿刺檢查。結果表明不管是按意識水平的GCS評分分組,還是按病理解剖學角度、腦損傷范圍行鹿特丹CT評分、腦挫裂傷體積分組,組間患者腦脊液CLU濃度差異均有統(tǒng)計學意義,且在GCS評分重度組、鹿特丹CT高評分組、腦挫裂傷體積較大組,患者腦脊液CLU濃度均較高,表明TBI嚴重程度加重,腦脊液CLU濃度升高;Spearman相關性分析表明腦脊液CLU濃度與TBI嚴重程度的GCS評分、鹿特丹CT評分、腦挫裂傷體積均相關,說明CLU在TBI后高表達,主要體現(xiàn)在腦脊液中,可作為評估TBI嚴重程度的指標;多元回歸分析發(fā)現(xiàn)腦挫裂傷體積是影響腦脊液CLU的主要因素,表明損傷范圍越大,腦組織CLU表達越高,可能與傷后星形膠質細胞增生、聚集表達CLU有關[17]。
綜上,腦脊液CLU隨TBI嚴重程度呈高表達,且損傷范圍是其主要影響因素,但本研究尚不能明確CLU的細胞來源,后續(xù)可進一步開展細胞及組織學研究,以取得更深入的發(fā)現(xiàn)。