鴨病毒性肝炎病毒的分離與鑒定

于 柳

（大連市金普新區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 大連 116100）

鴨病毒性肝炎病毒是一種高致病性傳染性疾病，其病程短、發(fā)病急、傳播速度快、致死率高，臨床癥狀為抽搐、痙攣、角弓反張等癥狀。此病毒主要危害1月齡內(nèi)的雛鴨，周齡越小死亡率越高，嚴(yán)重制約著養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。本文對鴨病毒性肝炎病毒分離與鑒定方法進(jìn)行綜述，為此病的防控提供參考。

1 病毒分離與鑒定

鴨病毒性肝炎病毒常用鑒定方法是分離培養(yǎng)病毒。動物培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)和鴨胚尿囊腔接種是3種病毒分離方法。在細(xì)胞培養(yǎng)中，國外研究者報道此病毒可在鴨胚（雞胚）腎細(xì)胞、鴨胚（雞胚）成纖維細(xì)胞和鴨胚肝細(xì)胞中生長增殖。鑒于不同毒株毒力強弱與對不同細(xì)胞適應(yīng)性存在的差異，該病毒在細(xì)胞上會產(chǎn)生輕微病變或不發(fā)生細(xì)胞病變。通常情況下，病毒初代分離使用鴨胚，連續(xù)傳若干代之后易增殖。死亡鴨胚的主要特征為皮膚水腫、出血、侏儒癥、肝臟水腫呈綠色。在傳代中，病死率升高，死亡特征顯著。采集死胚尿囊液，采用中和試驗和電鏡技術(shù)等方法進(jìn)行鑒定。

2 血清學(xué)方法

2.1 中和試驗

檢測鴨病毒性肝炎肝炎病毒最可靠、最經(jīng)典的方法時中和試驗。此方法可在雞胚、鴨胚、雛鴨進(jìn)行固定血清—稀釋病毒。研究者發(fā)現(xiàn)，在56℃條件下，被檢血清滅活半小時，將病毒與血清的混合液在接8日齡雞胚前37℃水浴40分鐘，檢出率可明顯提高。

2.2 間接血凝與血凝抑制試驗

間接血凝試驗通過不斷改進(jìn)可用于檢測血清中存在的各種病原抗體，與酶聯(lián)免疫吸附測定相比，此方法操作簡便、迅速、設(shè)備要求不高。我國研究者將間接血凝抑制試驗同中和試驗進(jìn)行比較，檢測陽性結(jié)果符合率達(dá)85%。

2.3 乳膠凝集試驗

研究人員使用提純濃縮的抗鴨病毒性肝炎病毒抗體致敏乳膠建立了快速檢測抗原的反向乳膠凝集試驗法。結(jié)果顯示，抗體致敏乳膠未出現(xiàn)自凝情況、特異性強、可重復(fù)，安全可靠。并且，通過競爭凝集的原理，采用提純濃縮的抗Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒抗體致敏乳膠結(jié)合待測血清抗體，建立了乳膠凝集試驗檢測法，此方法對抗原純度要求不嚴(yán)格，避免鴨病毒性肝炎病毒難以純化的情況。經(jīng)試驗檢測，0.02毫克/毫升為結(jié)合最小抗原量。此方法與其他病原不發(fā)生任何反應(yīng)，阻斷效果顯著，檢測Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒抗體可達(dá)1∶800，比瓊脂擴散試驗高50倍。該檢測法對Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒檢測敏感性強、特異性高、可重復(fù)、質(zhì)量穩(wěn)定可靠，適合應(yīng)用于臨床流行病調(diào)查。

2.4 瓊脂擴散試驗

鴨病毒性肝炎病毒為無囊膜病毒。研究者選用不同的鴨肝炎病料，采用反透析法和氯仿去脂法對病毒進(jìn)行提純濃縮，應(yīng)用瓊脂擴散試驗對鴨病毒性肝炎病毒進(jìn)行檢測，結(jié)果表明用抗體血清檢測病毒抗原，檢出率可達(dá)80%。此方法操作簡便，但靈敏度與特異性還有待于提高。

3 分子生物學(xué)方法

3.1 RT-PCR

PCR的優(yōu)點為靈敏度、特異性高，迅速，易于操作。隨著研究者對鴨病毒性肝炎病毒基因序列的深入研究，PCR已廣泛應(yīng)用于本病毒病原的檢測。研究者參照鴨病毒性肝炎病毒保守區(qū)設(shè)計物，建立了Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒的RT-PCR方法。為高效防治鴨病毒性肝炎病毒提供了參考，并降低養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟損失。

3.2 套式RT-PCR

我國研究人員陸續(xù)建立了Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒的套式RTPCR檢測法。此檢測法多用于該病的早期診斷、病理檢測等。研究者采用雙重RT-PCR檢測法對Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒和N型鴨病毒性肝炎病毒進(jìn)行鑒別診斷。

3.3 熒光定量RT-PCR

研究者基于Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒3D區(qū)域序列設(shè)計TaqMan探針和引物，建立了熒光定量RT-PCR檢測法。此方法研究了Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒弱毒在雞胚內(nèi)部的分布情況和強毒在鴨胚內(nèi)部的分布情況，對人工感染Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒的動態(tài)分布情況進(jìn)行定量檢測。

4 結(jié)束語

鴨病毒性肝炎病毒的快速傳播與高致病性，是嚴(yán)重危害雛鴨的傳染病之一。近些年，分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，PCR和熒光定量PCR檢測法廣泛應(yīng)用于病毒病原的檢測。通過進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究，將建立一套快速、高效、完整的鴨病毒性肝炎病毒檢測法，以促進(jìn)鴨養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展。