基因功能驗證方法及研究進(jìn)展

雷 華,趙廣展,林志藝*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院/生態(tài)公益林重大有害生物防控福建省高校重點實驗室,福州 350002;2.福建省閩侯縣廷坪鄉(xiāng)林業(yè)站,福建 閩侯 350104 )

目前,基因研究方向已由結(jié)構(gòu)研究轉(zhuǎn)向功能研究,在探索早期中,Thomopsson創(chuàng)建的ES細(xì)胞基因敲除小鼠模型,為基因敲除技術(shù)奠定了基礎(chǔ)[1]。近幾年來,出現(xiàn)了許多基因功能驗證方法,如基因敲除技術(shù)、ZFN技術(shù)、TALEN技術(shù)、RNA干擾等,這些方法被廣泛運用于植物、動物、細(xì)菌等生物群中。上述技術(shù)極大縮短了基因功能驗證所需要的時間,且這些方法的作用機(jī)制具有較高的特異性。對基因功能的深入研究有助于推進(jìn)醫(yī)學(xué)、植物學(xué)和昆蟲學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展,探究其發(fā)展具有重要的意義。

1 基因敲除技術(shù)

基因敲除技術(shù)是目前研究基因功能最直接和最有效的方法之一,主要分為傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)和新興基因敲除技術(shù)。傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)依靠細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源染色體的隨機(jī)交換或者大規(guī)模隨機(jī)插入突變來達(dá)到基因敲除的目的,如同源重組技術(shù)、T-DNA插入突變技術(shù)和轉(zhuǎn)座子插入突變技術(shù)等[2]。新興基因敲除技術(shù)為可控的定點敲除,如ZFN、TALEN和CRISPR-Cas9技術(shù)等,這些技術(shù)在基因敲除的效率方面有所提高,為基因功能驗證提供了新的途徑[2]。

1.1 同源重組

利用已知序列及功能的DNA片段與目的基因發(fā)生同源重組來改變生物的遺傳基因,使得目的基因功能表達(dá)被中斷,進(jìn)而觀察生物形態(tài)和行為的變化,推測出目的基因在生物學(xué)上的功能[2]。該技術(shù)由于生物體內(nèi)自發(fā)的同源染色體隨機(jī)交換效率極其低下,以至于實際操作量大,限制了其發(fā)展[2]。

目前,在小鼠研究中已具有的完備胚胎干細(xì)胞系統(tǒng)以及可行胚胎重建技術(shù),因此,該技術(shù)廣泛運用于小鼠基因敲除模型的構(gòu)建。但由于這兩項技術(shù)的發(fā)展速度緩慢,導(dǎo)致該技術(shù)并未運用于眾多大動物。且隨著新基因編輯技術(shù)(ZFN、TALEN和CRISPR-Cas9等)的出現(xiàn),更多的基因敲除模型不僅僅局限于該技術(shù),如基因修飾兔的構(gòu)建[3]、糖原貯積癥0型斑馬魚疾病模型的構(gòu)建[4]、FOXN1基因敲除豬模型的構(gòu)建[5]。

1.2 插入突變

1.2.1 T-DNA插入突變 通過農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將目的基因的DNA序列整合到基因組DNA上。該技術(shù)能便捷地進(jìn)行正反向的遺傳學(xué)研究,但其具有較強的限制性,主要是由于植物的生物學(xué)、遺傳學(xué)特性及T-DNA標(biāo)簽載體的不完善,使該技術(shù)僅能運用于少數(shù)模式植物[6]。

近年來,在擬南芥與水稻的研究中廣泛運用[7],在擬南芥基因組中已有超過225000個T-DNA插入系,已知超過88000個T-DNA插入的精確位置,且已鑒定了大約29454個預(yù)測擬南芥基因中的21700的突變[8]。在水稻的基因組中已有至少200000的T-DNA插入系,也已經(jīng)產(chǎn)生了用于反向遺傳學(xué)方法的標(biāo)記系[9]。

1.2.2 轉(zhuǎn)座子插入突變 轉(zhuǎn)座子是一類可移動遺傳因子,可引發(fā)基因重組和變異,該技術(shù)利用插入轉(zhuǎn)座子來產(chǎn)生易于識別的突變[10]。目前,高通量DNA測序與轉(zhuǎn)座子插入突變相結(jié)合形成轉(zhuǎn)座子插入測序(TIS)。TIS迄今為止運用對象多為細(xì)菌物種,不僅解決與細(xì)菌基因相關(guān)的基本問題,還證明了細(xì)菌在眾多人類疾病中起著主要作用。另外有一些相似于TIS的方法已開發(fā)運用于哺乳動物,真菌,寄生蟲和古菌[11]。如通過PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)成功地將轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入小鼠和人的成纖維細(xì)胞, 并產(chǎn)生了穩(wěn)定的iPS細(xì)胞[12],Zhu等人基于PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)篩選出畢赤酵母的3個碳源代謝阻遏基因以及126個可能參與甲醇利用途徑的功能基因[13]。TIS技術(shù)的發(fā)明擴(kuò)展了以往轉(zhuǎn)座子插入突變目標(biāo)的局限,可見該技術(shù)具有著巨大的發(fā)展?jié)摿陀猛尽?/p>

1.3 靶向核酸酶介導(dǎo)基因編輯技術(shù)

1.3.1 ZFN靶向基因敲除技術(shù) 鋅指核酸酶(ZFN)是由鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域與FokⅠ切割結(jié)構(gòu)域融合而成的人工核酸酶。當(dāng)兩個ZFN單體各自與目標(biāo)位點特異性結(jié)合且在DNA雙鏈的距離和方向符合一定要求時,FokⅠ能夠形成二聚體的活性形式,從而切割兩個結(jié)合位點的間隔區(qū),產(chǎn)生DNA雙鏈切口,再利用細(xì)胞本身的同源重組或非同源末端連接修復(fù)機(jī)制進(jìn)行切口修復(fù),最終便可以達(dá)到基因敲除的目的[14]。

ZFN技術(shù)已成功應(yīng)用在植物中的基因組修飾,且在果蠅、秀麗隱桿線蟲和斑馬魚中已有研究。目前,還運用于小鼠研究中,對比于誘變與轉(zhuǎn)座子插入突變而言,其特異性較強,工作量也更小[15]。但由于其特異性結(jié)合到不同的基因序列的過程需要較大的鋅指蛋白,而鋅指蛋白連接在一起時會相互干擾,導(dǎo)致容易出現(xiàn)脫靶的現(xiàn)象。因此,ZFN技術(shù)還具有較大的進(jìn)步空間,如何降低其脫靶率是該技術(shù)重點突破方向。

1.3.2 TALEN靶向基因敲除技術(shù) TALEN是由TALE與FokⅠ構(gòu)成。它與ZFN相比,其識別序列不受位點上下游序列影響是作為第二代基因敲除技術(shù)的一個突出特點,但其作用原理與ZFN大致相同。其中,TALE蛋白是通常由串聯(lián)的33～35個氨基酸組成,其除了第12、13個氨基酸位置高度可變(RVD)外,其他重復(fù)序列高度保守。因此在TALEN技術(shù)中RVD就起到了堿基特異性識別的功能。而FokⅠ核酸內(nèi)切酶則負(fù)責(zé)制造出切口,誘導(dǎo)DNA修復(fù)[16]。

該技術(shù)在成功應(yīng)用于酵母后,便迅速運用在植物、人類細(xì)胞、小鼠、斑馬魚等研究中。如Y Tatsumi等通過TALEN介導(dǎo)的誘變獲得了2種rspo2斑馬魚突變體,一種是缺乏所有功能結(jié)構(gòu)域的空突變體,另一種是缺乏兩個N末端結(jié)構(gòu)域的亞態(tài)突變體,這兩個突變體的獲取有助于識別rspo2在骨骼發(fā)育過程中的作用[17]。Wang等通過TALEN介導(dǎo)的基因編輯破壞了小鼠的兩個Y連鎖基因(Sry和Uty),促進(jìn)了對Y染色體基因功能的研究[18]。Wu等采用TALEN技術(shù)對豬的Tiki1進(jìn)行定點修飾,成功構(gòu)建了豬Tiki1敲除的大動物模型,為實現(xiàn)大動物高效的基因編輯提供了一定的技術(shù)基礎(chǔ)[19]。此外,TALEN技術(shù)顯著的缺點就是其模塊組裝的過程極其復(fù)雜,且具有一定的毒性。

1.3.3 CRISPR-Cas9基因敲除技術(shù) CRISPR-Cas9技術(shù)是基于細(xì)菌與古生菌免疫防御機(jī)制所開發(fā)出的基因敲除技術(shù)。其使用被sgRNA激活的Cas9蛋白進(jìn)行雙鏈DNA位點切割,再由低保真度的修復(fù)使位點突變失活[20]。

ZFN與TALEN技術(shù)作為第一代和第二代技術(shù),存在著識別率低、成本高、脫靶率高、設(shè)計復(fù)雜等缺點,相比之下,作為第三代基因敲除技術(shù)的CRISPR-Cas9技術(shù)只需要可編程RNA即可產(chǎn)生序列特異性,因此其更為方便,制作更為簡單,脫靶率也有所降低。Zhou等通過胚胎共顯微注射Cas9-mRNA和靶向小鼠B2m,Il2rg,Prf1,Prkdc和Rag1的多種sgRNA產(chǎn)生了不同種類的免疫缺陷小鼠品系[21]。Zhang等實現(xiàn)了用CRISPR-Cas9系統(tǒng)把人的293T細(xì)胞的PVALB、EMX1基因、小鼠的Th基因定點突變。CRISPR-Cas9系統(tǒng)也被證明在根莖農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的番茄毛根中起作用,并且是甜橙的第一個基因組編輯平臺[22]。CRISPR-Cas9系統(tǒng)一出世便引起了一系列基因編輯熱潮,直到現(xiàn)在仍未止步,相信伴隨著眾多對CRISPR-Cas9系統(tǒng)的改良運用,該技術(shù)將在基因功能驗證的發(fā)展上繼續(xù)發(fā)揮著巨大的作用。

2 RNA干擾技術(shù)

RNA干擾技術(shù)利用生物對未知病毒侵害、外源基因的固有防御機(jī)制,使用與靶基因序列具有同源性的雙鏈RNA引發(fā)高效且具有特異性的對應(yīng)mRNA降解的技術(shù),屬于轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默[23]。由于siRNA與靶標(biāo)mRNA的結(jié)合嚴(yán)格遵循堿基互補配對原則,因此具有極強的特異性,且其操作簡單,周期短,抑制作用明顯,在大量基因未知功能的驗證上具有著極大的運用前景。在植物、秀麗隱桿線蟲、果蠅等生物群中已有較為突出的成果,如Kamath等人已通過RNA干擾預(yù)測了秀麗隱桿線蟲19427個基因中86%的功能[24]。Dietzl等人通過RNA干擾與二元GAL4/UAS系統(tǒng)生成了22270個轉(zhuǎn)基因系,覆蓋了果蠅88%的預(yù)測蛋白質(zhì)編碼基因[25]。另外,其作為遺傳工具已廣泛運用于哺乳動物的研究中,Beth Shafer等運用長dsRNA成功沉默了小鼠細(xì)胞的部分基因表達(dá)[26]。然而,在近年來在原核生物的研究中也發(fā)現(xiàn)了其存在RNA干擾機(jī)制,Man等人建立了atsRNA篩選模型,為研究原核生物的基因表達(dá)提供了一種新的工具[27]。

3 基因過表達(dá)技術(shù)

基因過表達(dá)技術(shù)是將目的基因的編碼區(qū)構(gòu)建到載體上,后導(dǎo)入細(xì)胞達(dá)到目的基因過量表達(dá),從而觀察表型分析目的基因的功能的技術(shù)。其中最重要的就是載體的構(gòu)建,可以分為非病毒表達(dá)載體和病毒表達(dá)載體。由于選擇不同的基因表達(dá)載體會影響到目的基因在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率與穩(wěn)定表達(dá),所以在設(shè)計實驗時,載體的選擇需要慎重考慮[28]。

作為技術(shù)最成熟的基因功能驗證技術(shù)之一,近年來在動植物生物群中運用較為廣泛。Sun等構(gòu)建了向日葵HaACO1的表達(dá)載體進(jìn)行過表達(dá)分析,證明了其與植物耐鹽性有關(guān)[29]。Zhou等對芝麻SiSAD基因進(jìn)行了克隆與過表達(dá)分析,探究了其在油酸合成過程中的作用[30]。Jia等利用過表達(dá)技術(shù)建立了豬GHR基因顯負(fù)性突變體的慢病毒載體,為后續(xù)研究相關(guān)基因功能筑造了基石[31]。在飛速發(fā)展的分子生物學(xué)時代,技術(shù)所展示的效率顯得尤為重要,在今后的使用過程中,需要更為注重表達(dá)載體的構(gòu)建,選擇合適的啟動子、增強子、多聚腺苷酸信號等元件,都能夠提高目的基因在功能上的表達(dá)效率。

4 微陣列分析

微陣列分析是Schena等人首次開發(fā)的一種高通量檢測基因表達(dá)的系統(tǒng),是生物學(xué)發(fā)展史上的一座里程碑[32]?，F(xiàn)今依據(jù)不同的作用對象,被分為DNA微陣列、蛋白質(zhì)微陣列、染色體微陣列、組織微陣列等。微陣列具有體積微小、成本較低、分析快且可多個樣品同時進(jìn)行實驗等優(yōu)勢,大大提高了基因功能驗證的效率。近幾年來,微陣列分析大量地運用于醫(yī)療疾病方面的基因功能檢測,如Tian等利用DNA微陣列檢測方法實現(xiàn)了對流感病毒的分類,簡化了診斷程序[33]。Wang等運用染色體微陣列分析表明了胎兒染色體非整倍體的發(fā)生率與年齡密切相關(guān),而染色體拷貝數(shù)變異發(fā)生率與年齡無關(guān)[34]。He等結(jié)合蛋白微陣列分析得出WNT5A和COL1A1可能在軟骨損傷中起重要作用[35]。在使用過程中,蛋白質(zhì)類微陣列雖然比DNA微陣列更為復(fù)雜,操作難度更大,但蛋白質(zhì)作為基因最終表達(dá)的代表產(chǎn)物,其更加全面地反映基因的本質(zhì)性功能。因此,改良蛋白質(zhì)類微陣列分析方法對于微陣列分析的發(fā)展具有一定的重要性[36]。

5 基因誘捕技術(shù)

基因誘捕技術(shù)是一種將誘捕載體和小鼠胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)所結(jié)合的高通量基因突變方法。與傳統(tǒng)的僅依靠生物體內(nèi)同源重組突變基因相比,使用基因誘捕的無啟動子基因誘捕載體的同源重組效率高了50%[37]。

該方法具有簡單性和高效性,近幾年來,主要運用于小鼠、斑馬魚、擬南芥。Kawakami提出了使用Tol2轉(zhuǎn)座元件在斑馬魚中進(jìn)行基因捕獲的方法,為研究脊椎動物發(fā)育提供了新的思路[38]。Patricia通過基因誘捕證明了擬南芥中PRL與啟動DNA復(fù)制的MCM2-3-4酵母基因家族相關(guān)[39]。David等使用基因誘捕技術(shù)證明了小鼠活力、生長和肺發(fā)育與Sulf2基因有關(guān)[40]。目前該技術(shù)主要受限的原因是使用范圍較小,只能夠去除ES細(xì)胞表達(dá)的基因,在近年來常與其他技術(shù)結(jié)合使用。

6 結(jié)論與展望

在生命科學(xué)爆炸式發(fā)展的時代,作為探究生命本質(zhì)不可或缺的基因功能驗證領(lǐng)域受到了更多的關(guān)注,其研究方法多種多樣,各種技術(shù)也都具有著獨特的優(yōu)勢。但目前看來,仍然存在著特異性不足,使用效率不高、脫靶率較高、通用性不強等問題,這些研究瓶頸仍需要我們對其分子機(jī)制進(jìn)一步研究來打破,發(fā)展出更為高效的基因功能驗證方法。盡管如此,現(xiàn)今的基因功能研究已在醫(yī)療、病蟲害防治、改良作物等領(lǐng)域展露出不可替代的作用。同時,隨著科學(xué)家們的不斷探求,基因功能驗證技術(shù)正在不斷地被完善走向成熟,相信在今后的時代里,基因功能驗證能夠爆發(fā)出更多不可取代的價值。