小球藻的基因工程改造研究進展

張?zhí)鹛?，陳必鏈?，鄭明敏，2*

(1. 福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117；2. 福建師范大學，工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建 福州 350117)

小球藻(Chlorella)是一種單細胞真核綠藻，具有光合作用能力，生長繁殖速度快，廣泛分布在淡水、湖泊和海洋等水體中，易于大規(guī)模培養(yǎng)，是生產(chǎn)生物燃料[1]、高價值化合物[2-3]、水產(chǎn)養(yǎng)殖功能餌料及重組治療蛋白[4]的潛在宿主。從改造的小球藻中，可以提取蛋白、油脂等營養(yǎng)物質。由于小球藻能夠利用二氧化碳[5]，因此其也被研究用于緩解溫室效應等環(huán)境問題。

隨著基因工程技術的發(fā)展，加上小球藻具有易培養(yǎng)、生長快速等優(yōu)勢，為其成為外源蛋白生產(chǎn)的理想宿主提供了可能性。許多研究者開始利用基因工程技術在小球藻細胞中進行外源基因的表達，以期生產(chǎn)外源蛋白或提高小球藻生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的能力，圖1展示了運用不同方法進行小球藻的遺傳轉化操作。構建遺傳轉化體系是開展基因工程研究工作的基礎，有研究表明，小球藻可以克服其他細菌、真菌、植物和動物表達系統(tǒng)在生產(chǎn)重組蛋白中的缺點[6]。

作為外源基因或蛋白表達的潛在宿主，小球藻具有良好的發(fā)展前景和優(yōu)勢。但由于缺乏可靠高效的轉化體系，蛋白表達不穩(wěn)定以及高價值化合物產(chǎn)量相對較低，阻礙了其作為生物反應器應用的發(fā)展。因此，了解小球藻基因工程轉化體系的建立和發(fā)展，對今后的真核基因表達具有積極意義。本文闡述了近年來在真核微藻小球藻中的基因工程改造進展，詳細介紹了小球藻遺傳轉化體系的轉化系統(tǒng)、轉化方法、影響轉化的因素及相關蛋白的表達，以期為后續(xù)小球藻的基因工程改造和功能蛋白生產(chǎn)提供技術參考。

1 小球藻轉化系統(tǒng)

微藻中小球藻已實現(xiàn)細胞核和葉綠體系統(tǒng)的轉化開發(fā)，但對于線粒體系統(tǒng)的轉化，僅在萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)中實現(xiàn)。開發(fā)轉化系統(tǒng)的難點在于需要同時克服四個問題：1)DNA能夠被轉移到胞內；2)至少需要表達一個標記或報告基因；3)宿主細胞內能夠復制DNA；4)被轉化的細胞能夠恢復和增殖。除了核轉化外，小球藻葉綠體轉化也逐漸受到關注。針對不同的靶細胞器轉化系統(tǒng)，需要制定合適的轉化體系，包括轉化方法、啟動子、標記/報告基因的選擇。

1.1 核轉化系統(tǒng)

對于小球藻的遺傳轉化系統(tǒng)，核基因組轉化是最早且被應用最廣泛的方法。目前已有超過12種不同的小球藻藻種成功地進行了核轉化[7]。由于在細胞核中表達的基因能夠編碼多種功能蛋白，與核基因組嚴格相關的功能不能通過細胞器基因工程來修改，因此細胞核成為許多基因工程研究的主要目標[8]。對于小球藻而言，相對于細胞器轉化，目前人們對核基因組的轉化更為了解，操作也更為方便。Kim J等[9]利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)成功編輯了小球藻的核基因組，生成硝酸還原酶(Nitrate reductase，NR)和腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Adenine phosphoribosyl transferase，APT)基因突變體。Gomma A E等[10]利用SV40大T抗原轉化功能域，通過overlap PCR技術制備線性基因表達盒，實現(xiàn)了該抗原成分在小球藻細胞中的穩(wěn)定表達，建立了一個無抗生素標記核轉化系統(tǒng)。Run C等[11]構建含有增強型綠色熒光蛋白(eGFP)基因的載體，通過優(yōu)化電穿孔轉化的相關參數(shù)，在DNA水平上成功鑒定了NptⅡ和eGFP基因，實現(xiàn)了蛋白核小球藻的穩(wěn)定核轉化。雖然小球藻的核基因組轉化表達系統(tǒng)已逐漸成熟，但其也存在易出現(xiàn)基因失活、基因沉默、表達效率低等情況[12]。

1.2 葉綠體轉化系統(tǒng)

針對植物細胞而言，其遺傳物質不僅存在于細胞核中，還存在于葉綠體和線粒體中。1988年Boynton J E等[13]使用轟擊法成功實現(xiàn)了萊茵衣藻的葉綠體轉化，為隨后小球藻的葉綠體轉化提供了可能。Wang K等[6]通過基因槍法將兩個抗菌肽基因傳遞到普通小球藻(C.vulgaris)的葉綠體基因組中，成功構建了小球藻葉綠體轉化體系。在葉綠體轉化系統(tǒng)中，外源DNA兩側通常有與整合位點兩端同源的區(qū)域，通過同源重組將外源基因整合到葉綠體基因組的特定位點上。需要注意的是，這些同源區(qū)域要足夠短，以盡量減少自發(fā)重組。葉綠體轉化系統(tǒng)具有基因拷貝數(shù)多、表達可靠、無基因沉默現(xiàn)象等優(yōu)點，但外源DNA的進入需要穿過葉綠體膜等障礙，這可能是小球藻葉綠體轉化體系還不夠成熟的原因之一。

1.3 線粒體轉化系統(tǒng)

關于動物和植物線粒體的研究已有所完善和進步，但在細胞體內穩(wěn)定遺傳的線粒體轉化只在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和萊茵衣藻中可以實現(xiàn)[14]。Hu Z等[15]將編碼增強型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)的基因轉入萊茵衣藻線粒體中并實現(xiàn)了表達。而Yoo B C等[16]設計了一種攜帶外源DNA的“編輯質?！?，通過基因槍法將質粒成功導入酵母線粒體和萊茵衣藻葉綠體中。但是由于單個細胞可能存在多個線粒體及植物線粒體基因組通常也存在不穩(wěn)定性、缺乏強選擇性標記等[14]缺陷，線粒體轉化系統(tǒng)也沒有得到普遍應用。

2 轉化方法

目前，已有關于小球藻的轉化方法的研究，但選擇合適的轉化方法仍然是實現(xiàn)外源蛋白在小球藻中表達的關鍵步驟之一。1991年，Jarvis E E等[17]使用聚乙二醇(PEG)介導法在橢圓小球藻(C.ellipsoidea)中實現(xiàn)了熒光素酶(Luciferase)基因的瞬時表達，這是在小球藻中首次實現(xiàn)核轉化。之后，對于小球藻轉化方法的研究逐漸增多。通過開發(fā)并優(yōu)化一種可靠高效的轉化方法，可以大大提高小球藻的轉化效率。本文總結了5種轉化方法，分析并闡述其優(yōu)缺點和應用。

2.1 聚乙二醇介導法

聚乙二醇(Polyethylene glycol mediated method，PEG)介導法，又被稱為玻璃珠法，是通過利用聚乙二醇與玻璃珠協(xié)同作用，造成細胞膜產(chǎn)生瞬間空隙，從而使外源 DNA 得以進入細胞的方法[18]。PEG介導法使用設備簡單、操作方便，對宿主細胞的損傷較小[7]，是最早用于使外源基因轉移到微藻的方法之一，最初被用于模式藻萊茵衣藻的轉化[19]，之后在一些小球藻種的轉化體系中也得到了應用。Hawkins R L等[20]利用PEG介導法，將帶有胞外分泌信號序列和外源DNA的質粒轉化到小球藻細胞中，在小球藻中實現(xiàn)了人生長激素(Human growth hormone，HGH)基因的瞬時表達，并發(fā)現(xiàn)玻璃珠的大小也會影響轉化效率。楊博[18]利用PEG介導法，首次將增強型綠色熒光蛋白報告基因轉化到普通小球藻基因組中，最后獲得(356±30)個克隆子/μg DNA，建立了一套穩(wěn)定而可靠的小球藻外源基因轉化體系。然而，PEG介導法的轉化效率通常較低[21]，且只能用于無細胞壁細胞。因此，在使用該方法時，需要選用無細胞壁突變體作為受體細胞，或使用物理、化學、生物等方法[22]去除細胞壁以獲得原生質體。目前，多數(shù)研究采用復合酶解液或物理方法(如研磨或超聲破碎)對小球藻的細胞壁進行破壞和去除。

2.2 電穿孔法

電穿孔是一種常用的細胞遺傳轉化方法，通過施加特定強度的脈沖電場，改變細胞膜的表面結構，在細胞膜上打開微孔，以便外源 DNA 通過此孔進入受體細胞，并在恢復狀態(tài)后整合到細胞染色體組中[23]。電穿孔法是目前小球藻遺傳轉化研究中應用最為廣泛的方法，具有操作簡便、轉化效率較高等優(yōu)點。

電穿孔法的轉化效率受到多種因素的影響，包括細胞壁、電場強度、脈沖時間、質粒濃度等。Chow K C等[24]發(fā)現(xiàn)，在較高的電場強度下，獲得的轉化效果更好，但是電壓過高會導致重組質粒無法穩(wěn)定整合到細胞染色體組中。Muoz C F等[25]在開發(fā)預測微藻最佳電穿孔條件的方法時發(fā)現(xiàn)：較低的細胞濃度、光強和小DNA片段的傳遞可以產(chǎn)生更高的轉化效率。但有些種屬，比如三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)[26]，由于其具有硅質化的細胞壁，因此無法使用電穿孔直接進行轉化。針對這種情況，通常采用制備原生質體或使用滲透液滲透細胞壁，如使用山梨醇和甘露醇預先處理受體細胞，改變細胞壁通透性，以此增加質粒 DNA 進入細胞的概率。

2.3 微粒子轟擊法

微粒子轟擊法，又叫基因槍法，是一種可以將DNA遞送到完整細胞的有效方法。它通過利用高壓氦氣或氮氣瞬間產(chǎn)生的沖擊力，向細胞中發(fā)射黏附有質粒DNA的金屬(鎢或金)微粒子，從而穿透細胞壁進入細胞[27]。Chen Y[28]等最初在橢圓小球藻中利用微粒子轟擊實現(xiàn)了β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase，GUS)基因的瞬時表達，表明微粒子轟擊是一種用于小球藻轉化的可行方法。Wang K等[6]通過直徑約550 nm的金載體微顆粒將重組質粒轟擊轉化至普通小球藻的葉綠體中，獲得了(212±48)個克隆子/μg DNA的轉化值。趙熙寧[29]通過微粒子轟擊介導蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)的轉化，最終獲得了高蛋白產(chǎn)量的優(yōu)質蛋白核小球藻工程株。

微粒子轟擊法的影響因素主要包括微粒子直徑、轟擊距離和DNA濃度等。雖然需要使用昂貴的基因槍設備，但操作簡單、適用范圍廣。葉綠體基因組轉化的唯一有效方法是微粒子轟擊或生物法[19]。但使用的金屬顆粒一般帶有生物毒性，可能會對受體細胞產(chǎn)生損傷。

2.4 農桿菌介導法

農桿菌介導法是一種常用于植物遺傳轉化的方法，其原理是將目的基因插入到根瘤農桿菌(A.tumefaciens)Ti質粒上的T-DNA 區(qū)，通過農桿菌侵染將目的基因導入到植物細胞的核基因組中[30]。近些年來，研究發(fā)現(xiàn)該方法也可用于小球藻的遺傳轉化。Sharma P K等[31]首次報道了一種在索羅金小球藻(C.sorokiniana)中高效穩(wěn)定的農桿菌介導轉化體系，最終獲得了(220±5)個克隆子/106細胞的轉化值。馮興標等[32]通過農桿菌介導法有效提高了小球藻中蝦青素的含量。與其他方法相比，農桿菌介導法具有操作簡便、宿主范圍廣泛、可轉移大片段DNA，以及準確將低拷貝數(shù)轉基因整合到轉錄活性區(qū)域等顯著優(yōu)勢[33]。

在農桿菌附著植物細胞的過程中，植物細胞缺口會釋放酚類化合物如乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)，然后誘導毒力基因Vir進行表達，從而將外源DNA轉移到細胞基因組中[30]。Yang B等[7]研究發(fā)現(xiàn)小球藻只有在加入AS后才能進行轉化。Sharif N等[34]的研究結果表明，細菌密度為OD600=1.0、共培養(yǎng)溫度為25 ℃、共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH為5.5、共培養(yǎng)3 d、乙酰丁香酮濃度為100 μmol/L是農桿菌轉化普通小球藻的最佳條件。在農桿菌介導的轉化體系中，可對農桿菌濃度、小球藻細胞狀態(tài)、共培養(yǎng)條件及乙酰丁香酮濃度等參數(shù)進行優(yōu)化，以提高小球藻的轉化效率。

2.5 納米載體介導法

納米載體介導法是一種新型的小球藻遺傳轉化方法。磁性納米粒子是從金屬氧化物中制備的基因載體。它可以通過修飾表面與大量核酸分子靜電吸附結合，形成復合體，在磁場作用下滲透到細胞中，從而將目的基因傳遞到核基因組中。曹蘇珊等[35]使用磁性納米顆粒介導法成功將報告基因EGFP傳遞到核基因組，在橢圓小球藻中獲得了EGFP綠色熒光的瞬時表達。磁性納米顆粒與質粒緊密結合形成的靜電吸附可以防止外源基因被胞內核酸酶酶解，從而避免了細胞轉化效率的降低[36]。作為一種新型的轉化方法，該技術具有轉化速度快、操作方便、表達穩(wěn)定等特點，但也存在轉化效率低、成本高等缺陷。

3 轉化影響因素

3.1 細胞壁

微藻的細胞壁是由碳水化合物、碳氫化合物、蛋白質和其他成分組成的復雜多聚體[8]。小球藻的細胞壁隨著生長發(fā)育會逐漸形成兩層結構，厚度約為17～21 nm[37-38]，這種細胞壁是外源DNA進入微藻細胞的一個巨大物理屏障。

若使用農桿菌或PEG介導法進行轉化，需要獲得細胞壁缺陷型藻株或制備原生質體。酶解法是制備藻細胞原生質體的常用方法，具有條件溫和、對細胞損傷程度小等優(yōu)點。纖維素是大多數(shù)小球藻種細胞壁的主要成分[39]。研究表明，同時使用纖維素酶和崩潰酶預處理小球藻，可以顯著提高原生質體制備率[39]。Yang B等[5]使用了含有纖維素酶、離析酶和果膠酶的酶混合液預處理小球藻的細胞壁，最終得到了超過80%的原生質體產(chǎn)率。盡管破壞細胞壁不是所有藻類成功轉化的必要條件，但它是細胞滲透到足以有效穿透外源DNA和細胞死亡之間的微妙平衡[8]，可以有效提高轉化效率。在萊茵衣藻中，高效率轉化通常只報道在無細胞壁突變體或已去除細胞壁的原生質體細胞中[8]。因此，在小球藻基因轉化研究中，細胞壁的處理是提高轉化效率的關鍵步驟之一。

3.2 選擇標記和報告基因

在轉化體系中，通常會將帶有某一特定抗性的選擇標記或帶有熒光報告基因的質粒與目的DNA融合后，轉化到細胞中，便于后續(xù)陽性轉化子的篩選。選擇標記是指將編碼某一抗生素的抗性基因導入細胞中表達，從而使轉化細胞具有對該抗生素的抗性特質。表1列出了目前常用于小球藻遺傳轉化篩選的抗生素抗性選擇標記。

表1 用于不同種類小球藻的抗生素抗性基因及最佳篩選濃度Tab.1 The resistant genes and optimal screening concentration of antibiotic for different species of Chlorella

不同的藻種對抗生素有不同的敏感濃度，在選擇抗生素時，需要提前考慮藻的種類和其本身的抗性，并設置一系列抗生素濃度梯度，觀察抑制野生型藻株生長的最佳作用濃度，這是小球藻基因工程改造中的重要部分。

報告基因是指編碼具有酶活性或易于從各種細胞蛋白中識別的蛋白質[7]。例如在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光的綠色熒光蛋白[11]、增強型綠色熒光蛋白和藍綠色熒光蛋白[38]。成功表達熒光報告基因的細胞，在一定的激發(fā)波長下，會發(fā)出相應的熒光，以此來驗證質粒是否整合成功。但考慮到小球藻細胞具有固有的光合色素和一些熒光物質，如葉綠體紅色熒光[46]，因此熒光報告基因需要在強啟動子的驅動下才能達到高表達水平，以此區(qū)別于背景熒光。

除了肉眼可以觀察到的顯性選擇標記外，還有一些隱性選擇標記可用于篩選轉化子。NR基因編碼了一種介導硝酸鹽向亞硝酸鹽轉化的酶，NR基因突變體不能利用硝酸鹽，因此在僅以硝酸鹽為氮源的培養(yǎng)基中無法生長。另外，APT基因編碼一種催化腺嘌呤轉化為腺苷酸的蛋白質，APT突變體會導致細胞在含有2-氟腺嘌呤的培養(yǎng)基中不受抑制地生長[9]。這種通過基因突變導致翻譯提前終止，蛋白無法表達的隱性選擇標記可以減少外源基因的插入和抗生素的使用，具有提高經(jīng)濟效益和減少環(huán)境污染等優(yōu)點。

3.3 啟動子和增強子

啟動子是基因表達的關鍵因子，強啟動子會調控基因的高表達[47]?；ㄒ嘶ㄈ~病毒35S (CaMV35S)啟動子是小球藻中應用最廣泛的組成型啟動子之一[7]，已被成功用于普通小球藻[5]、橢圓小球藻[17]、蛋白核小球藻[48]。來自植物的組成型啟動子也可以發(fā)揮作用。如玉米的泛素啟動子已成功驅動GUS報告基因在小球藻中的高效表達[44]，而水稻肌動蛋白的Actin1啟動子也被認為可以促進小球藻中的基因表達。Niu Y F等[45]克隆了NR基因的啟動子和終止子，驅動誘導氯霉素乙酰轉移酶(Chloramphenicol acetyltransferase，CAT)報告基因的表達，結果顯示CAT的表達會受到硝酸鹽的誘導，提出了一種誘導型啟動子在小球藻中的應用體系。

一般來說，外源啟動子的表達效率低于內源啟動子。在小球藻中被鑒定并分離出的光系統(tǒng)Ⅰ蛋白D (psaD)啟動子，是首次報道的可以驅動真核微藻和高等植物基因表達[49]的小球藻內源性啟動子。Shin J H等[50]從小球藻核基因組中分離到兩個氮饑餓誘導型啟動子，通過添加信號肽，成功實現(xiàn)了人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)多肽的表達和分泌。為了高效驅動基因表達，研究者會在構建質粒時加入一些調控元件，如增強子來激活啟動子發(fā)揮功能。研究表明在中性粒細胞肽(Neutrophil peptide-1，NP-1)基因上游區(qū)域添加一個ω增強子后，可以增加基因表達[51]。在Liu J等[52]構建的小球藻(C.zofingiensis)轉化體系中，將內源性八氫番茄紅素去飽和酶啟動子的第一個內含子序列克隆后，添加到啟動子序列上游，轉化效率提高了91%。這些研究證實了增強子或調控元件在促進小球藻轉基因表達中可以發(fā)揮重要的作用。

4 蛋白表達

小球藻擁有完整的真核細胞表達系統(tǒng)，因此可以對外源蛋白進行翻譯后修飾和加工。此外，小球藻具有生長周期短、食用安全性高、生產(chǎn)效率高等優(yōu)勢，被廣泛應用于基因工程領域。表2列出了不同種類小球藻轉化系統(tǒng)中的轉化率或蛋白表達量。

表2 不同種類小球藻的轉化率或蛋白表達量Tab.2 The transformation rate or expressed proteins in different species of Chlorella

Hawkins R L等[20]發(fā)現(xiàn)在小球藻中表達的異源蛋白HGH的產(chǎn)量約為200～600 ng/mL。雖然比報道的大腸桿菌(Escherichiacoli)中的HGH(0.5～2.4 μg/mL)產(chǎn)量低。但該研究為在小球藻中表達生產(chǎn)外源蛋白提供了良好的開端。

小球藻中表達的重組蛋白可用于生產(chǎn)天然餌料。Kim D H等[40]在橢圓小球藻中穩(wěn)定轉化了比目魚生長激素(Flounder growth hormone，fGH)基因，最后測定fGH的蛋白量超過了400 μg。將轉化后的小球藻喂養(yǎng)比目魚30 d后，其生長速度提高了25%。Reddy P H等[48]將含有傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)VP2基因的表達載體轉化到蛋白核小球藻中，Western blot分析證實了IBDV VP2蛋白可以在蛋白核小球藻中表達，該蛋白可以保護雞免受雞傳染病病毒IBDV的侵害。這些研究證實了小球藻中外源蛋白穩(wěn)定表達的可行性，為工業(yè)化生產(chǎn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的食用蛋白提供了可靠依據(jù)。

目前也有許多針對小球藻進行的外源抗菌肽的表達研究。Koo J等[41]將牛乳鐵蛋白N葉基因進行密碼子優(yōu)化，在普通小球藻中實現(xiàn)了乳鐵蛋白的穩(wěn)定表達。乳鐵蛋白是一種可以在非免疫防御系統(tǒng)中起作用的抗菌肽，對革蘭氏陽性和陰性細菌都具有抗菌活性。何藝賓[54]利用電穿孔轉化法，在轉基因小球藻中實現(xiàn)了抗菌肽融合基因的穩(wěn)定表達，并證實了該抗菌肽能夠抑制嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的生長。

小球藻作為表達治療性蛋白質的潛在平臺也引起了人們的關注。Bai L L等[43]將突變的防御素(Mutated NP-1)NP-1基因轉化到橢圓小球藻中，并分離出了具有生物活性的防御素。藏花酸是稀有藥用植物藏紅花的主要活性成分之一，是一種潛在的藥用藥物。Lou S等[42]通過將藏花酸合成途徑中的關鍵基因crtRB和ZCD1引入普通小球藻中，成功產(chǎn)生了具有活性的藏花酸。雖然小球藻能夠進行復雜的蛋白質折疊和修飾，產(chǎn)生的活性蛋白質可以用作抗原和抗體[55]，但其生產(chǎn)量往往低于細菌或植物系統(tǒng)。適當添加信號肽序列[50]和核糖體結合位點(RBS)序列[37]或許有助于建立高效的蛋白表達和分泌系統(tǒng)。

CRISPR/Cas9通過使用gRNA序列將核酸酶(Cas9)引導到受體細胞的基因組中，可以精確編輯原核和真核物種的基因組。盡管在萊茵衣藻中首次成功應用了CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術，但結果顯示其轉化效率很低，這可能是因為Cas9對藻細胞具有細胞毒性[56]。除了較低的轉化效率外，需要用于篩選的明顯表型也是目前CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在微藻中使用的局限之一[8]。通過蛋白質組學技術[56]和高效基因表達框的改良，可能有利于基因編輯技術在小球藻轉化中的應用。

5 總結與展望

小球藻是高值生物產(chǎn)物和功能蛋白質的一種重要來源。通過利用各種技術工具對小球藻進行基因組編輯和蛋白表達，擴展其作為表達宿主，具有經(jīng)濟性和環(huán)境可行性。目前，電穿孔和基因槍法是小球藻轉化的常用方法，其中基因槍法是用于葉綠體基因組轉化的最有效方法。常用于植物轉化系統(tǒng)的農桿菌介導法，不需要提前制備原生質體，在小球藻轉化體系中也有巨大的應用潛力。啟動子、功能表達載體和合適的選擇標記是小球藻轉化體系的重要組成部分。構建和利用植物病毒載體，密碼子優(yōu)化、插入調控元件、使用內源性啟動子等操作可以提高外源基因插入的效率和穩(wěn)定性，并增加蛋白表達量。

小球藻作為一種生命活動簡單的真核微藻，在功能營養(yǎng)餌料和改善生態(tài)環(huán)境方面都有可觀的前景。盡管不斷的探索和研究使小球藻基因工程改造領域取得了相當大的進展，但在其成為成熟的表達系統(tǒng)之前仍有許多障礙需要克服。開發(fā)一種適合小球藻高效、穩(wěn)定表達蛋白的轉化體系，對于生產(chǎn)高價值產(chǎn)品和功能性營養(yǎng)品具有重要而深遠的意義。