殼寡糖對中華絨螯蟹非特異性免疫的影響

高榆嘉，徐 美，許云舒，徐田田，張敏娜，許青松

(大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)，俗稱河蟹、大閘蟹，是中國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟物種之一，因生長快速、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟價值高，其養(yǎng)殖規(guī)模逐年攀升。但隨著企業(yè)集約化養(yǎng)殖的發(fā)展壯大，養(yǎng)殖密度增加等因素導(dǎo)致中華絨螯蟹發(fā)病率上升。此外，環(huán)境惡化，細菌、病毒等對中華絨螯蟹養(yǎng)殖的威脅不斷增加，如愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌等致病菌使中華絨螯蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。因此，豐富中華絨螯蟹免疫防御基礎(chǔ)理論知識、尋找安全有效的病害防控方法成為中華絨螯蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中亟待解決的問題。

殼寡糖(Chitosan oligosaccharides，COS)，又稱低聚殼聚糖，是由2～10個氨基葡萄糖經(jīng)β-1，4-糖苷鍵連接而成的低分子量聚糖，可由甲殼素生物酶解而獲得。殼寡糖因含有多個活潑的氨基和羥基基團，而具有抗氧化、抗菌、增強免疫、調(diào)節(jié)腸道、保護肝臟等多種生物學(xué)活性，現(xiàn)已在醫(yī)藥及農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域被廣泛研究和應(yīng)用[2]。作為飼料添加劑或免疫增強劑，殼寡糖不僅能調(diào)節(jié)動物生理功能，加快新陳代謝，而且具有替代抗生素的潛質(zhì)，對提高動物生長速度、降低死亡率、改善產(chǎn)品品質(zhì)等方面均有明顯的作用[3-4]，因而其在畜、禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究不斷增多。Zhang B Z[5]將殼寡糖應(yīng)用到泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)的養(yǎng)殖中，發(fā)現(xiàn)殼寡糖不僅能改善泥鰍的生長性能、體蛋白含量、腸道消化酶活力和抗氧化能力，還提高了泥鰍對嗜水氣單胞菌的抗性。Rahimnejad S等[6]發(fā)現(xiàn)殼寡糖能顯著提高凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)肝胰臟谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力，同時上調(diào)其crustin、Pen3和proPo等抗菌肽基因的表達。李振達等[7]在三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)基礎(chǔ)飼料中添加一定量的殼寡糖，可以顯著提高其血清中酸性磷酸酶、溶菌酶、總超氧化物歧化酶和過氧化物酶等活力。袁春營等[8]發(fā)現(xiàn)在中華絨螯蟹飼料中適量添加低聚殼聚糖，可以改善其免疫功能，增強機體抵御病原菌的能力。張干等[9]發(fā)現(xiàn)飼料中添加低聚殼聚糖，可以提高中華絨螯蟹生長性能、抗氧化能力和非特異性免疫力，減少機體脂肪的沉積。目前，殼寡糖在中華絨螯蟹上的研究多停留在現(xiàn)象描述，如生長性能、抗氧化能力和免疫指標的測定上，而免疫調(diào)節(jié)分子機制研究并未見報道。因此，本實驗通過研究中華絨螯蟹非特異性免疫和抗氧化能力，以及免疫調(diào)節(jié)機制，旨在為殼寡糖在中華絨螯蟹中的研究和應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設(shè)計

實驗用殼寡糖為本實驗室通過生物酶解殼聚糖制備而獲得，脫乙酰度≥90%，聚合度分布在2～8，其中殼二糖至殼八糖的占比分別為5.5%、21.1%、31.5%、26.7%、10.9%、2.9%、1.3%。實驗用(20±2)g中華絨螯蟹購自江蘇省連云港市中華絨螯蟹養(yǎng)殖場，在20～22 ℃淡水中暫養(yǎng)，每天定時更換養(yǎng)殖水體并投喂適當(dāng)?shù)酿D料。暫養(yǎng)7 d后，選擇45只附肢完整、個體均勻、健康的中華絨螯蟹，隨機分為3組，每組15只，第1組分別注射0.1 mL生理鹽水(對照組)，第2組分別注射0.1 mL 50 μg·mL-1殼寡糖，第3組分別注射0.1 mL 200 μg·mL-1殼寡糖。

1.2 樣品采集

中華絨螯蟹注射殼寡糖24 h后，使用一次性無菌注射器從第三步足基部插入，采集血淋巴并按1∶1與抗凝劑(氯化鈉510 mmol·L-1、檸檬酸200 mmol·L-1、葡萄糖100 mmol·L-1、檸檬酸三鈉30 mmol·L-1，pH 7.3)混勻，800 g，4 ℃離心10 min，收集血淋巴細胞，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清免疫指標檢測

取中華絨螯蟹血淋巴離心后的上清液，用于超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、溶菌酶(LZM)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、一氧化氮(NO)等活性或含量的檢測。以上指標均采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)進行檢測。

1.4 RNA提取及實時熒光定量PCR

參考Yu A Q等[10]RNA提取及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)的方法，利用Trizol試劑(Invitrogen，USA)進行中華絨螯蟹血淋巴細胞總RNA的提取，然后用分光光度計Nanodrop 2000(Thermo Scientific)對提取的RNA進行定量分析，取2 μL RNA用于瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA的完整性。根據(jù)試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，Japan)的說明書進行cDNA的合成。以獲得的cDNA為模板，使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa)，按說明書要求設(shè)置PCR反應(yīng)體系和程序，結(jié)合表1中基因種類和引物序列，以中華絨螯蟹的β-actin基因作為內(nèi)參基因，采用ABI-Q6-Flex實時熒光定量PCR儀進行擴增，定量結(jié)果采用2-ΔΔCt計算方法進行計算。

表1 研究中采用的引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.5 統(tǒng)計分析

從每組中隨機選取9只中華絨螯蟹，將3只蟹的血淋巴細胞混合為一個樣本，每組3個生物學(xué)重復(fù)樣品(n=3)。實驗數(shù)據(jù)用SPSS 20軟件進行統(tǒng)計分析，利用單因素方差分析方法(ANOVA)對不同處理組的差異進行比較，P<0.05表示顯著差異，P<0.01表示極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖對中華絨鰲蟹抗氧化能力和非特異性免疫的影響

與對照組相比，2組殼寡糖處理均極顯著提高了中華絨螯蟹血清中SOD和CAT的活性(P<0.01)；50 μg·mL-1殼寡糖有提高GSH-PX活性的作用趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，200 μg·mL-1殼寡糖極顯著提高GSH-PX活性(P<0.01)；2組殼寡糖處理均顯著降低了中華絨螯蟹血清中MDA含量(P<0.05)；50 μg·mL-1殼寡糖有提高LZM活性的作用趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，200 μg·mL-1殼寡糖顯著提高LZM活性(P<0.05)；2組殼寡糖均有提高AKP和ACP活性的作用趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；2組殼寡糖均顯著增加了中華絨螯蟹血清中一氧化氮的含量(P<0.05)(表2)。

表2 殼寡糖對中華絨鰲蟹抗氧化能力和非特異性免疫的影響Tab.2 Effects of chitosan oligosaccharides on antioxidant capacity and non-specific immunity of E.sinensis

2.2 殼寡糖對Toll樣受體表達的影響

中華絨螯蟹中存在著類似果蠅的Toll樣受體基因，并被命名為EsToll1和EsToll2[11]。與對照組相比，2組殼寡糖處理均極顯著提高了中華絨螯蟹血淋巴細胞中EsToll1和EsToll2的表達水平(P<0.01)(圖1)。

2.3 殼寡糖對Toll信號通路的影響

類似果蠅的Toll信號通路的關(guān)鍵基因在中華絨螯蟹中已被鑒定，如EsMyD88[12]、EsTube[13]、EsPelle[14]和EsDorsal[10]。與對照組相比，200 μg·mL-1殼寡糖處理極顯著提高了中華絨螯蟹血淋巴細胞EsMyD88的表達水平(P<0.01)(圖2A)；2組殼寡糖處理均顯著提高了血淋巴細胞中EsTube和EsPelle的表達水平(P<0.05)(圖2B、圖2C)；50 μg·mL-1殼寡糖處理顯著提高了血淋巴細胞EsDorsal的表達水平(P<0.05)，200 μg·mL-1殼寡糖處理極顯著提高了EsDorsal的表達水平(P<0.01)(圖2D)。

2.4 殼寡糖對免疫效應(yīng)分子表達的影響

抗氧化酶和抗脂多糖因子作為重要的免疫效應(yīng)分子，其基因在中華絨螯蟹中分別被命名為EsSOD[15]、EsCAT[16]、EsALF[17]和EsALF3[18]。與對照組相比，50 μg·mL-1殼寡糖處理顯著提高了中華絨螯蟹血淋巴細胞EsSOD和EsCAT的表達水平(P<0.05)，200 μg·mL-1殼寡糖處理極顯著提高了EsSOD和EsCAT的表達水平(P<0.01)(圖3A、圖3B)；50 μg·mL-1殼寡糖處理顯著提高了中華絨螯蟹血淋巴細胞EsALF的表達水平(P<0.05)，200 μg·mL-1殼寡糖處理極顯著提高了EsALF的表達水平(P<0.01)(圖3C)；2組殼寡糖處理均極顯著提高了中華絨螯蟹血淋巴細胞EsALF3的表達水平(P<0.01)(圖3D)。

3 討論

3.1 殼寡糖對中華絨鰲蟹抗氧化能力的影響

甲殼動物不具有類似脊椎動物的特異性免疫，在復(fù)雜的生活環(huán)境中，其主要依賴固有免疫系統(tǒng)阻止病原微生物的入侵。甲殼動物免疫系統(tǒng)主要由細胞免疫和體液免疫組成，其中體液免疫主要包括抗氧化酶釋放、體液免疫因子、抗菌肽以及凝集素分子等[19]。SOD、CAT和GSH-PX都屬于抗氧化體系中重要的生物酶，在機體受到氧化應(yīng)激時起重要防御作用，反映了甲殼動物的抗應(yīng)激能力。Niu J等[20]發(fā)現(xiàn)殼寡糖可以提高斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)SOD和GSH-PX的活力，進而提升其總抗氧化能力，減少機體中MDA的含量；在中華絨螯蟹中，張干等[9]同樣發(fā)現(xiàn)殼寡糖提高了蟹肌肉和可食內(nèi)臟中SOD和CAT的活性；在本研究中，殼寡糖顯著提高了中華絨螯蟹血清中SOD、CAT和GSH-PX的活力，降低了MDA的含量，與Niu J等、張干等的研究結(jié)果基本一致。溶菌酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶都屬于體液免疫因子，在甲殼動物體液免疫過程中起非常重要的作用，反映了機體的免疫防御能力。李振達等[7]在三疣梭子蟹中證明殼寡糖可以顯著提高血清中LZM 和ACP的活力，但對AKP 活力促進效果不顯著；袁春營等[8]在中華絨螯蟹中同樣發(fā)現(xiàn)殼寡糖可以提高血清中LZM的活力；而在本研究中，殼寡糖顯著提高了中華絨螯蟹血清中LZM活力，對AKP和ACP活力有提高的作用趨勢，但差異不顯著，這與李振達等、袁春營等的研究結(jié)果有所不同，可能與殼寡糖作用的時間有一定的關(guān)系。一氧化氮作為細胞內(nèi)重要的信號分子，在脊椎動物和無脊椎動物免疫反應(yīng)中均發(fā)揮著重要作用。Jiang Q F等[21]對櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)的研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮參與了櫛孔扇貝免疫，對其血淋巴的免疫應(yīng)答、血細胞凋亡與吞噬、抗菌活性和氧化還原平衡起著重要的調(diào)節(jié)作用。Raman T等[22]在羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)中同樣發(fā)現(xiàn)，一氧化氮參與了凝集素介導(dǎo)的蝦血細胞吞噬反應(yīng)，若使用一氧化氮抑制劑，則可有效抑制上述吞噬反應(yīng)。在本研究中，殼寡糖顯著提高了中華絨螯蟹血清中一氧化氮的水平，提示其可能參與了中華絨螯蟹的免疫反應(yīng)過程。

3.2 殼寡糖的免疫調(diào)節(jié)機制

Toll信號通路能夠激活多種免疫相關(guān)基因(如小分子蛋白、抗菌肽以及吞噬作用和黑化作用相關(guān)基因等)來響應(yīng)細菌和病毒的入侵。在甲殼類動物中，Toll通路主要包括Toll樣受體、MyD88、Tube、Pelle和Dorsal等關(guān)鍵分子[23]。Yu A Q等[11]在中華絨螯蟹中成功克隆表達了EsToll1和EsToll2分子，并且證明兩者均參與了中華絨螯蟹對脂多糖、酵母聚糖和肽聚糖的免疫響應(yīng)。本研究也發(fā)現(xiàn)殼寡糖可以有效誘導(dǎo)中華絨螯蟹血淋巴細胞Toll樣受體的表達。此外，研究學(xué)者在中華絨螯蟹中已經(jīng)成功地證明存在著Toll信號通路，并鑒定了EsMyD88[12]、EsTube[13]、EsPelle[14]和EsDorsal[10]等關(guān)鍵分子，這些分子在不同的免疫刺激物作用下呈現(xiàn)出不同的免疫響應(yīng)過程。本研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖可以有效地上調(diào)EsMyD88、EsTube、EsPelle和EsDorsal的表達，提示殼寡糖可能通過開啟Toll信號通路發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用?？寡趸阁w系是甲殼動物重要的免疫防御手段，殼寡糖上調(diào)了中華絨螯蟹血淋巴細胞EsSOD和EsCAT的表達，這與中華絨螯蟹血清抗氧化酶活力變化趨勢基本一致?？咕氖求w液免疫的重要效應(yīng)分子，能有效殺滅細菌等，是機體免疫的有效屏障，同時抗菌肽的表達受到Toll信號通路的調(diào)控。在中華絨螯蟹中，研究學(xué)者先后鑒定出抗脂多糖因子EsALF和EsALF3等多種抗菌肽，這些抗菌肽在甲殼動物的免疫防御過程中發(fā)揮著不可或缺的作用[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖可以顯著提高EsALF和EsALF3的表達水平，提示殼寡糖的免疫調(diào)節(jié)機制可能是通過Toll信號通路介導(dǎo)的抗菌肽來發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

殼寡糖可以改善中華絨螯蟹的抗氧化能力和非特異性免疫功能，增強Toll信號通路中EsToll1、EsToll2、EsMyD88、EsTube、EsPelle和EsDorsal的表達，上調(diào)抗脂多糖因子EsALF和EsALF3的表達。