基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接探討苓桂術(shù)甘湯治療新冠肺炎合并支氣管哮喘潛在作用機(jī)制研究

王昱丹，李正祎，楊凱麗，初夢(mèng)瑤，韓路生，陳長(zhǎng)寶，李 光，王恩鵬*（.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，長(zhǎng)春 307；.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林 吉林 303；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 307）

支氣管哮喘是一種以氣道慢性高反應(yīng)性炎癥為主要特征的呼吸系統(tǒng)疾病，以咳嗽、胸悶、氣促為主要臨床癥狀，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今沒(méi)有得到合理的解釋[1]。全球范圍內(nèi)支氣管哮喘發(fā)病率逐年上升，給社會(huì)以及家庭帶來(lái)嚴(yán)重醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，很難完全被治愈。西醫(yī)治療長(zhǎng)期服用激素以控制哮喘，其不良反應(yīng)明顯，癥狀反復(fù)。中醫(yī)基礎(chǔ)理論中，支氣管哮喘被稱(chēng)為“哮癥”[2]，認(rèn)為因痰氣交阻、閉塞氣道、肺的升降失職所致。2022 版全球哮喘管理和預(yù)防策略指出，哮喘患者對(duì)新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的感染風(fēng)險(xiǎn)并未增加[3]，但研究發(fā)現(xiàn)患有嚴(yán)重哮喘在新冠疫情期間住院風(fēng)險(xiǎn)增加[4]?；颊咝鹿谝咔榇罅餍衅陂g，支氣管哮喘患者高感知壓力患病率為10.6%，創(chuàng)傷后壓力風(fēng)險(xiǎn)11.3%，抑郁風(fēng)險(xiǎn)31.5%，失眠風(fēng)險(xiǎn)57.7%[5]，已嚴(yán)重造成患者心理壓力。

苓桂術(shù)甘湯是我國(guó)歷史悠久的經(jīng)典名方，出自漢代張仲景撰《金匱要略》[6]，為國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》[7]。此方可治療痰飲疾病，上溫心陽(yáng)、下利水濕、中健脾土。苓桂術(shù)甘湯作為中藥復(fù)方在治療疾病中具有多靶點(diǎn)、多途徑、多方向等特點(diǎn)，在臨床診療中取得顯著成效[8]。

但目前仍少有文獻(xiàn)報(bào)道苓桂術(shù)甘湯對(duì)于新冠肺炎合并支氣管哮喘防治的作用機(jī)制，故本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過(guò)構(gòu)建苓桂術(shù)甘湯有效活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-新冠肺炎合并支氣管哮喘疾病的多層次生物網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合GO 富集分析和代謝途徑分析數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）進(jìn)行通路富集分析[9]，并用分子對(duì)接更好地補(bǔ)充驗(yàn)證，為今后開(kāi)創(chuàng)和研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)

數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用平臺(tái)：TCMSP 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（https：∥old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）；UnipProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∥www.uniprot.org/）；OMIM 人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)https：∥www.omim.org/）；Genecards 人類(lèi)基因綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∥www.genecards.org/）；TTD 藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∥db.idrblab.net/ttd/）；DisGeNET（https：∥www.disgenet.org/）；String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∥cn.string-db.org/）；Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∥metascape.org/）；微生信（https：∥www.bioinformatics.com.cn/）；PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∥www.rcsb.org/）；Cytoscape軟件（3.7.1）；Autodock1.5.7。

1.2 苓桂術(shù)甘湯活性成分的收集

利用TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)收集苓桂術(shù)甘湯化合物，以茯苓、桂枝、白術(shù)、甘草為關(guān)鍵詞收集相關(guān)有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)，篩選條件為生物口服利用度OB≥30%同時(shí)滿(mǎn)足類(lèi)藥性DL 值≥0.18[10]。

1.3 苓桂術(shù)甘湯靶點(diǎn)收集

將收集的有效成分相關(guān)靶點(diǎn)應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配篩選標(biāo)準(zhǔn)化基因命名。

1.4 疾病基因收集

以“bronchial asthma”和“COVID-19”為關(guān)鍵詞分別在OMIM 人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)、Genecards 人類(lèi)基因綜合數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)獲得新冠肺炎和支氣管哮喘相關(guān)靶點(diǎn)及基因。

1.5 苓桂術(shù)甘湯與支氣管哮喘疾病共同靶點(diǎn)收集

將苓桂術(shù)甘湯和新冠肺炎合并支氣管哮喘疾病相關(guān)基因利用韋恩圖篩選共同基因靶點(diǎn)。

1.6 苓桂術(shù)甘湯與支氣管哮喘相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

將化合物—疾病交集靶點(diǎn)提交到String 數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“人”（Homo sapiens），獲得靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)互作分析。

1.7 富集分析

將苓桂術(shù)甘湯-新冠肺炎合并支氣管哮喘靶點(diǎn)提交到Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行細(xì)胞組成（cellular component，CC）、生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）的GO 富集分析和KEGG 通路分析。利用微生信平臺(tái)下載分析包，選取排名前10的進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。

1.8 分子對(duì)接

利用分子對(duì)接技術(shù)，將網(wǎng)絡(luò)藥理篩選的活性成分和重要靶點(diǎn)的相互作用進(jìn)行預(yù)測(cè)與驗(yàn)證。從Pub-Chem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載有效活性成分的分子結(jié)構(gòu)型，從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載核心蛋白結(jié)構(gòu)域。運(yùn)用PyMOL 軟件對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行去水、加氫等操作。運(yùn)用AutoDockTools 1.5.7 軟件將苓桂術(shù)甘湯活性成分及核心蛋白基因文件pdb 格式轉(zhuǎn)換為pdbqt 格式，使用軟件內(nèi)盒子對(duì)接，將分子結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包裹進(jìn)行對(duì)接，選擇合適的最佳對(duì)接位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 苓桂術(shù)甘湯治療支氣管哮喘靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)收集苓桂術(shù)甘湯中同時(shí)滿(mǎn)足口服利用度OB≥30%和類(lèi)藥性DL 值≥0.18的藥物有效活性成分共121個(gè)，其中茯苓15 個(gè)、桂枝7 個(gè)、白術(shù)7 個(gè)、甘草92 個(gè)，結(jié)果見(jiàn)表1。通過(guò)Genecards、OMIM、TTD、DisgeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取支氣管哮喘靶點(diǎn)共2115 個(gè)，新冠肺炎靶點(diǎn)1972個(gè)。將上述靶點(diǎn)互相匹配，共獲得58 個(gè)苓桂術(shù)甘湯治療支氣管哮喘潛在交集靶點(diǎn)，具體為：AR、DPP4、ADIPOQ、GSTM1、IKBKB、NFKBIA、NOS2、IL1B、RXRB、RAF1、SERPINE1、BAX、XDH、TNF、CHUK、IRF1、TGFB1、F10、MMP1、MMP3、F3、IL1A、AHR、CD40LG、CRP、ALOX5、MAPK1、ICAM1、IL10、CXCL2、IL6、HMOX1、CYP3A4、AKT1、RELA、NFE2L2、CCL2、EGFR、PLAU、VEGFA、SIRT1、CAT、MPO、THBD、BCL2、NOS3、SPP1、CXCL10、PON1、IL4、STAT1、STAT3、HIF1A、IFNG、HMGCR、PLAT、IL2、CXCL8，結(jié)果用圖1表示。

表1 苓桂術(shù)甘湯有效活性成分成分Tab.1 Active ingredients of Linggui Zhugan Decoction

圖1 苓桂術(shù)甘湯與支氣管哮喘疾病交集靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of the intersection target of Linggui Zhuga Decoction and bronchial asthma disease

2.2 苓桂術(shù)甘湯成分靶點(diǎn)-支氣管哮喘疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

首先將篩選的58 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中，物種限定為“Homo sapiens”，得到潛在作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)保存其TSV 格式文件。將信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件作圖。每個(gè)靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)相連線段數(shù)量越多degree 值越大則說(shuō)明該點(diǎn)越重要。通過(guò)degree 值比較篩選出10 個(gè)degree 值最高的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。分別是TNF、IL6、AKT1、VEGFA、IL1B、CXCL8、STAT3、CCL2、ICAM1、IL10。排名前10 的靶點(diǎn)Degree值見(jiàn)表2。PPI網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖2。

表2 苓桂術(shù)甘湯治療支氣管哮喘關(guān)鍵靶點(diǎn)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)表Tab.2 Topological parameters of the key targets of Linggui Zhugan Decoction in the treatment of bronchial asthma

圖2 苓桂術(shù)甘湯蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖（PPI圖）Fig.2 Protein network interaction diagram of Linggui Zhugan Decoction（PPI diagram）

2.3 GO富集分析

在Metascape 基因富集分析網(wǎng)站中整理藥物靶點(diǎn)，在智人數(shù)據(jù)庫(kù)中分別進(jìn)行GO 分子功能（GO MF）、GO生物過(guò)程（GO BP）、GO細(xì)胞組分（GO CC）以及KEGG 通路富集分析。通過(guò)微生信進(jìn)行富集分析得到圖3。

圖3 GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis

2.4 KEGG通路富集分析

KEGG 通路富集分析共收集152 條通路，篩選出10 條關(guān)鍵通路。分別是AMPK 通路、NF-kappa B 通路、PI3K-Akt 通路、JAK-STAT 通路、mTOR 通路、Th17 細(xì)胞分化、MAPK 通路、TGF-β 通路、PD-L1/PD-1通路、COVID-19通路。如圖4、圖5所示。

<1)，且各件產(chǎn)品是否為不合格品相互獨(dú)立．

圖4 KEGG通路-靶點(diǎn)圖Fig.4 KEGG pathway-target map

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

2.5 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路

基于以上結(jié)果，獲得藥物的活性成分、重要靶點(diǎn)和關(guān)鍵通路，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò)模型，進(jìn)行Network Ananlyze分析。見(jiàn)圖6。

圖6 藥物-有效成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路圖Fig.6 Drug-active ingredient-target-key pathway diagram

2.6 分子對(duì)接

從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載核心蛋白腫瘤因子（TNF）和白介素-6（IL-6）的3D信息結(jié)構(gòu)，輸出pdb格式，并利用Autodock 1.5.7 軟件輸出pdbqt 格式。將網(wǎng)絡(luò)中度值最大的活性成分槲皮素（Quercetin）、山奈酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）分別與PPI網(wǎng)絡(luò)中確定的關(guān)鍵靶蛋白TNF 和IL6 進(jìn)行分子對(duì)接分析，這些小分子化合物通過(guò)氫鍵結(jié)合到目標(biāo)蛋白上，這是一種靜電相互作用。在分子對(duì)接評(píng)分中，對(duì)接分?jǐn)?shù)越低、構(gòu)象越穩(wěn)定，則結(jié)合活性越好，分子對(duì)接結(jié)合能均小于-5 kcal/mol。結(jié)果見(jiàn)圖7和表3。

表3 苓桂術(shù)甘湯核心蛋白與核心有效成分結(jié)合能對(duì)接表Tab.3 Connection table of binding energy between core protein and core active ingredients of Linggui Zhugan decoction

圖7 槲皮素、山奈酚、β-甾醇與關(guān)鍵靶蛋白TNF、IL6相互作用示意圖Fig.7 Quercetin，kaempferol β-Schematic diagram of interaction between sterols and key target proteins TNF and IL6

3 討論

苓桂術(shù)甘湯由四種不同的草藥制成，即茯苓的干菌核、桂枝（肉桂的干枝）、白術(shù)（白術(shù)的干根莖）和甘草（甘草的干根和根莖）。此方以茯苓為君藥，茯苓性甘淡，祛邪又扶正，實(shí)為利水之要藥；桂枝甘溫，溫脾以助水，溫腎又祛邪；白術(shù)為補(bǔ)氣健脾之要藥，性苦溫燥濕，甘溫補(bǔ)脾，祛邪兼扶正；甘草性甘補(bǔ)脾；茯苓、桂枝相配利水以平?jīng)_，白術(shù)伍甘草健脾以降逆，桂枝、甘草相配加強(qiáng)通陽(yáng)之效[11]。苓桂術(shù)甘湯具有治療多種疾病的作用，如非酒精性肝炎、心力衰竭、心梗后心室重構(gòu)、糖尿病、阿爾茲海默癥[12-13]等。

為了進(jìn)一步研究與探討苓桂術(shù)甘湯治療新冠合并支氣管哮喘的藥效基礎(chǔ)和潛在的生物學(xué)機(jī)制，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)篩選出有效成分及藥效靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用基因靶點(diǎn)富集分析及通路預(yù)測(cè)等手段，得到槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等核心活性成分。苓桂術(shù)甘湯治療新冠肺炎合并支氣管哮喘的靶基因作用網(wǎng)絡(luò)以TNF 與IL6為核心，TNF 與IL6 作為炎癥因子對(duì)氣道損傷危害較大，持續(xù)性刺激呼吸道黏膜呈現(xiàn)高敏反應(yīng)，使患者出現(xiàn)呼吸困難。槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇具有抗炎、提高免疫力、抗腫瘤的作用。槲皮素通過(guò)下調(diào)IL-4、IL-5、miR-155 的水平來(lái)改善卵清蛋白致使小鼠哮喘模型，對(duì)氣道炎癥水平有抑制作用，促使氣道重塑[14]。槲皮素與山奈酚具有抗氧化、細(xì)胞保護(hù)、抗炎等作用，山奈酚在一定條件下抗氧化能力是槲皮素的100倍，抗炎特性明顯增強(qiáng)[18]。在COVID-19 期間，SARS-CoV-2 感染可刺激PI3K-Akt 通路、JAK-STAT通路、mTOR 通路、MAPK 通路等多條信號(hào)通路，山奈酚被作為植物中提取的植物化學(xué)物質(zhì)可能是對(duì)抗新冠肺炎的潛在候選藥物[15]。在KEGG 富集分析中存在PI3K-Akt 通路、JAK-STAT 通路、mTOR 通路、MAPK 通路以及COVID-19 通路，因此苓桂術(shù)甘湯可為改善新冠肺炎合并支氣管哮喘的潛在中藥復(fù)方。

分子對(duì)接通過(guò)小分子配體和大分子受體，通過(guò)一系列對(duì)接選擇合適的藥物對(duì)接位點(diǎn)，并預(yù)測(cè)其親和力，尋找受體小分子化合物與靶標(biāo)大分子作用的最佳構(gòu)象。在本文的所有配體化合物中，與TNF 和IL6 受體蛋白結(jié)合最穩(wěn)定的為槲皮素，結(jié)合能為-7 kcal/mol。文獻(xiàn)報(bào)道其IL6 可通過(guò)一定的信號(hào)通路對(duì)CVA大鼠具有較好的抗炎作用[16]。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)對(duì)苓桂術(shù)甘湯治療新冠肺炎合并支氣管哮喘的潛在藥效成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)及作用機(jī)制進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)苓桂術(shù)甘湯治療支氣管哮喘具有調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路的協(xié)同效應(yīng)。所以，苓桂術(shù)甘湯可能通過(guò)影響機(jī)體細(xì)胞增殖分化、腫瘤因子及炎癥、癌癥的產(chǎn)生等多維度協(xié)同發(fā)揮平喘作用，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證苓桂術(shù)甘湯改善支氣管哮喘的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。