DCN通過VEGF因子抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖的實驗研究

鞠文博，鞠欣達，劉巖峰 （北華大學基礎醫(yī)學院，吉林 吉林 132013）

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，對女性的健康構(gòu)成極大的威脅。因此乳腺癌新治療手段的研究一直是醫(yī)學研究領(lǐng)域的熱點。當前早期乳腺癌的臨床治療方法是以手術(shù)治療為主，然后輔以放化療，預后差、復發(fā)率高。最理想的治療方法就是靶點的基因治療[1]。

核心蛋白聚糖（decorin，DCN）是小分子蛋白多糖，含有豐富的亮氨酸，含有1 個44 kD 左右的核心蛋白和1 條硫酸皮膚素側(cè)鏈[2]，是國際生物醫(yī)學科研的一個熱點。而研究最廣泛的是DCN 對癌癥細胞的抑制性作用。利用DCN 作為有效的抑癌元素，通過病毒介導的方式開發(fā)有效的、有臨床應用潛力的基因治療手段[3]。DCN 是細胞外基質(zhì)的重要成分，其主要作用有：促進細胞增殖與分化、維持細胞外基質(zhì)蛋白的生物活性、防止組織器官纖維化等重要作用[4]。DCN 在生物體微環(huán)境中分布廣泛，也廣泛分布于正常組織和腫瘤組織內(nèi)，因此有其抗腫瘤作用。其主要通過調(diào)控受體功能來影響腫瘤細胞的生物活性，這些受體與細胞生長、細胞存活有一定相關(guān)性[5]。

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）與血管的生成有關(guān)[6]。腫瘤的轉(zhuǎn)移以及在轉(zhuǎn)移部位的生長主要依賴于腫瘤血管的形成；腫瘤內(nèi)新生血管是腫瘤細胞早期侵襲的目標，也是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑。VEGF 能夠促進腫瘤內(nèi)血管生成，使微血管的通透性增加，加強誘導血管及淋巴管內(nèi)皮細胞的有絲分裂，誘導形成新的血管和淋巴管，為腫瘤向淋巴管轉(zhuǎn)移提供結(jié)構(gòu)基礎[7]。

本實驗通過DCN 轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7 細胞，觀察DCN 高表達對VEGF 的調(diào)控作用，以期發(fā)現(xiàn)DCN 通過對VEGF 調(diào)控作用，影響乳腺癌MCF-7 細胞的增殖作用，為乳腺癌基因靶點治療探明機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

MCF-7 細胞株（Bio Vector）；Annexin V FITC APOPTOSIS DTEC KITⅠ（BD，美國），Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）；兔抗人DCN 抗體（美國）；MMLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，Japan）；pcDNA TM 5/FRT 載體（Invitrogen，USA）；鼠抗人GAPDH（Bioworld，美國）；pcDNA3.1-DCN（銳博，廣州）；人DCN質(zhì)粒（柯雷生物）；定量反應體系SYBRPremix Ex Taq（Takara，Japan）。

1.2 細胞培養(yǎng)

復蘇后的MCF-7細胞RPMI1640培養(yǎng)基中，添加10%胎牛血清，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 換液，觀察細胞密度達到90%時，采用胰酶消化法傳代，取第3~5 代細胞進行相關(guān)實驗。取MCF-7 細胞平均分為2 組，正常培養(yǎng)MCF-7 細胞為對照組，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒高表達DCN的MCF-7細胞為DCN組[8]。

1.3 Lipo2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒誘導細胞高表達DCN

以陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 為載體，轉(zhuǎn)染到內(nèi)含DCN 的cDNA 節(jié)段，以及FRT 位點的pcDNA?35/FRT質(zhì)粒載體至MCF-7細胞中。細胞培養(yǎng)后，檢測穩(wěn)定高表達DCN 的MCF-7 細胞各項指標。

1.4 流式細胞儀檢測細胞數(shù)量

接種MCF-7 細胞到6 孔板，MCF-7 細胞應處于轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長期，細胞繼續(xù)生長，密度達到30%~50%時，篩選DCN 轉(zhuǎn)染的MCF-7 細胞。轉(zhuǎn)染細胞72 h 后，500 μL 的結(jié)合緩沖液加入5×105個細胞懸浮，后再加入Triton FITC 熒光標記單克隆抗體（fluorescein-isothiocyanate）5 μL 搖勻，然后加PE（phycoerythrin）5 μL 混勻，無光線條件下反應5~15 min。用流式細胞儀（Becton IDickinson Co.）檢測細胞數(shù)目。

1.5 MTT法檢測MCF-7細胞增殖

換液當天開始計時，7 d 后檢測。檢測時，吸去所有孔中的培養(yǎng)基，于每孔加入培養(yǎng)液200 μL，后加入20 μL MTT，混合均勻，孵育3~4 h于恒溫細胞培養(yǎng)箱中。吸去每孔培養(yǎng)基后，每孔加入DMSO 100 μL，繼續(xù)恒溫孵育5~10 min。吸溶液到另一個準備好的干凈的96 孔板中，連續(xù)光譜微孔板在光波波長490 nm下測每孔溶液的OD值，記錄結(jié)果[9]。

1.6 VEGF基因表達檢測

轉(zhuǎn)染24 h 后24 孔板細胞使用TRlzl 提取各組細胞總RNA 進行RT-PCR 檢測?；騐EGF 引物：上游5' -AATCGAGACCCTGGTGGACA-3'，下游5' -TTAACTCAAGCTGCCTCGCC-3'。 取RNA 體積為50 μL，然后按照RT-PCR 試劑盒方案：45 ℃條件，45 min 進行反轉(zhuǎn)錄反應。PCR 反應條件：94 ℃2 min，反轉(zhuǎn)錄酶滅活和RNA/cDNA 引物預變性；94 ℃30 s，52.5 ℃1 min，68 ℃2 min，共重復40次；最后1 次68 ℃持續(xù)7 min。在2%瓊脂糖凝膠上進行RT-PCR 產(chǎn)物電泳，紫外攝像系統(tǒng)中照相，天能分析軟件光密度掃描各條帶，檢測各組VEGF mRNA RTPCR 產(chǎn)物，及對應的內(nèi)參GAPDH mRNA RT-PCR 產(chǎn)物A值，分析AVEGF/AGAPDH 的比值[10-13]。

1.7 Western blot 法檢測細胞轉(zhuǎn)染后MCF-7 細胞VEGF蛋白表達

DCN轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞用含血清及胰島素的培養(yǎng)基制成單細胞懸液后，1×106個細胞/皿，接種于中培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h 后，更換為無血清含胰島素的培養(yǎng)基48 h，用40 ℃PBS 沖洗細胞3 次，預先將蛋白酶抑制劑cocktail 按1∶100 加入細胞裂解液RIPA 中混勻。加入適量RIPA 冰上裂解30 min，將裂解產(chǎn)物刮下收集于EP 管，12 000 r/min，40 ℃離心15 min。吸取上清液，BCA 法蛋白定量后，50 μg 蛋白經(jīng)12%SDSPAGE 膠分離后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，含5%牛奶的TBST 溶液封閉1 h。分別孵育對應一抗4 ℃過夜。TBST 洗膜5 min，共3 次，室溫孵育二抗1.5 h。TBST洗膜每次10 min，共3 次。ECL 發(fā)光底物曝光顯影。ImageJ 1.39 U 分析目的條帶的光密度值。以GAPDH作為內(nèi)參，實驗重復4次。

1.8 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量結(jié)果采用的方式進行描述，不同組數(shù)值比較均采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)結(jié)果

圖1為MCF-7細胞培養(yǎng)圖片，轉(zhuǎn)染DCN后MCF-7細胞增殖能力較對照組減弱，相同培養(yǎng)周期DCN組細胞數(shù)目較對照組減少。

圖1 DCN轉(zhuǎn)染MCF-7 24、48、72 h細胞生長情況Fig.1 MCF-7cells transfected with DCN for 24、48、72 h

2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞數(shù)量

結(jié)果顯示MCF-7 細胞轉(zhuǎn)染DCN 后分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，與對照組相比較，DCN 組MCF-7細胞數(shù)量較對照組明顯減少，P＜0.05，見表1。

表1 流式細胞儀檢測MCF-7細胞數(shù)量Tab.1 The flow cytometry measures the number of MCF-7 cells

2.3 MTT法觀察各組細胞存活率MTT

結(jié)果顯示，與對照組相比較，DCN 組細胞存活率明顯下降，增殖能力受到顯著抑制，P＜0.05，見圖2。

圖2 MTT法檢測MCF-7Fig.2 Prpliferation of MCF-7 cells was detected by MTT

2.4 RT-PCR檢測MCF-7細胞VEGF表達

轉(zhuǎn)染24 h后提取總RNA，電泳見圖3。結(jié)果顯示DCN 組細胞培養(yǎng)24 h 后VEGF mRNA 表達水平相較對照組有降低趨勢。

圖3 VEGF mRNA電泳圖Fig.3 VEGF mRNA electropherogram

2.5 Western blot法檢測VEGF蛋白表達

細胞轉(zhuǎn)染DCN 后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，Western blot 法檢測MCF-7 細胞中VEGF 蛋白表達水平。結(jié)果顯示，與正常對照組比較，DCN 組MCF-7 細胞中VEGF蛋白表達水平降低，見圖4。

圖4 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)VEGF蛋白表達Fig.4 Western blot detection of VEGF protein expression in transfected cells

3 討論

本研究采取基因克隆重組技術(shù)等分子生物學實驗方法，以人乳腺癌MCF-7細胞為宿主細胞，構(gòu)建了一個能夠表達核心蛋白聚糖基因的穩(wěn)定高效篩選系統(tǒng)，將已有的正常核心蛋白聚糖cDNA 中表達相應氨基酸的基因進行點突變。通過亞克隆技術(shù)，將含有突變基因的cDNA 以及正常核心蛋白聚糖cDNA 克隆到含有FRT 位點的pcDNA?5/FRT 載體中，從而得到多個能高效表達變異核心蛋白聚糖的細胞株。

QT-RTPCR 技術(shù)檢測正常及變異核心蛋白聚糖在Flip-In 定點整合和表達系統(tǒng)中mRNA 水平的表達；Western Blot 方法檢測正常及變異的核心蛋白聚糖在Flip-In 定點整合和表達系統(tǒng)中蛋白水平的表達。MTT技術(shù)檢測正常和變異基因?qū)CF-7細胞的增殖活性的影響；結(jié)果顯示，DCN 轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細胞，DCN 在乳腺癌細胞內(nèi)高表達后，細胞生長受到抑制。

有研究認為，VEGF 因子是與腫瘤淋巴管生成和淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的。Karkkainen 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，剔除VEGF 基因的小鼠持續(xù)出現(xiàn)組織和淋巴水腫而不緩解。VEGF 因子可能與腫瘤細胞的異型增生和分化有關(guān)系[15]，VEGF 因子可以引起癌細胞與宿主細胞間相互作用[16]，通過細胞自身分泌的方式，VEGF因子調(diào)節(jié)、保護和刺激內(nèi)皮細胞增殖、刺激胚胎干細胞和造血干細胞分化。分子作用機理，研究者[17]認為，VEGF 因子通過與受體VEGFR-2/VEGFR-3 結(jié)合，使受其發(fā)生自身磷酸化（認為是酪氨酸激酶信號系統(tǒng)），信號經(jīng)過細胞內(nèi)傳導，誘導DNA 有絲分裂增強，增強細胞增殖以及淋巴管出芽生長；細胞內(nèi)具體的信號傳導途徑，有待進一步研究。VEGF 因子導致淋巴管生成以及腫瘤組織由淋巴轉(zhuǎn)移的作用是多方面的[18-20]，深入研究VEGF 因子的作用機理以及傳導途徑，對更加深入地認識腫瘤以及淋巴道轉(zhuǎn)移機理，指導腫瘤的基因治療都具有重要意義。