基于UHPLC-QTRAP-MS/MS結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討不同廠家龜甲膠中氨基酸含量差異及其抗骨質(zhì)疏松的潛在機(jī)制

陳巧巧,唐 皓,王 芬,湯延富,何清湖,余 娜*

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,長(zhǎng)沙 410208;2湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,長(zhǎng)沙 410006;3湖南醫(yī)藥學(xué)院,懷化 418000

龜甲膠(Testudinis Carapacis et Plastri Colla,TCPC)是我國(guó)傳統(tǒng)滋補(bǔ)中藥,由龜科動(dòng)物Chinemysreevesii(Gray)的龜甲經(jīng)水煎煮、濃縮制成的固體膠[1,2],始載于《本草匯言》,其性涼,味咸、甘,歸肝、腎、心經(jīng),臨床上常用于骨質(zhì)疏松癥的治療,以龜甲膠為主藥的經(jīng)典方劑如龜鹿二仙系列方、左歸丸、虎潛丸等在益精填髓、強(qiáng)筋壯骨方面具有顯著功效。龜甲膠富含膠原蛋白、角蛋白及游離氨基酸,蛋白水解后的氨基酸是龜甲膠中最終被人體吸收利用的主要活性成分。在中醫(yī)診療中,骨質(zhì)疏松癥多歸屬于“骨痹”“骨枯”“骨瘺”范疇[3],《備急千金要方》[4]曰:“骨極者……手足疼,不能久立,屈伸不利身痹腦髓痿”。腎藏精主骨生髓,不足則髓減骨萎,骨髓失養(yǎng)致使骨脆性增加而引發(fā)骨質(zhì)疏松?，F(xiàn)代研究表明龜甲膠及其經(jīng)典方劑在健骨、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤等方面具有較好的活性[5],龜甲膠中的甘氨酸、脯氨酸可作為診斷絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的潛在標(biāo)志物[6],氨基酸本身為信號(hào)分子,還可協(xié)同鈣離子激活鈣敏感受體,提高骨密度并促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,增強(qiáng)骨鈣化[7,8]。為探討不同廠家龜甲膠的氨基酸含量差異,本研究選取4個(gè)不同廠家共15批龜甲膠樣品,采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)龜甲膠酸水解后17種氨基酸進(jìn)行測(cè)定,通過多元統(tǒng)計(jì)比較不同廠家龜甲膠中水解氨基酸成分的組成差異,為龜甲膠的質(zhì)量控制提供參考。并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)龜甲膠中各氨基酸成分進(jìn)行分析,為進(jìn)一步預(yù)測(cè)龜甲膠抗骨質(zhì)疏松的主要活性成分與靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

QTRAP 6500+型液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)AB SCIEX公司);MF MS105DU型NewClassic電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);Wonbio-96E型冷凍研磨儀(上海萬柏生物);SBL-10DT型超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物);DW-86L390型超低溫保存箱(澳柯瑪股份有限公司);Centrifuge 5430R型冷凍離心機(jī)、手動(dòng)單道移液器(德國(guó)Eppendorf公司)。

17種氨基酸對(duì)照品:甘氨酸(glycine,Gly,批號(hào):S29A10I96410)、丙氨酸(alanine,Ala,批號(hào):S20A6G17672)、脯氨酸(proline,Pro,批號(hào):S30J6G1)、天冬氨酸(aspartate,Asp,批號(hào):S24A8I34463)、谷氨酸(glutamate,Glu,批號(hào):S12A10I85582)、組氨酸(histidine,His,批號(hào):Z19A9H59384)、精氨酸(arginine,Arg,批號(hào):MKBD3032V)、纈氨酸(valine,Val,批號(hào):S10M11I09402)、異亮氨酸(isoleucine,Ile,批號(hào):SLBF7068V)、亮氨酸(leucine,Leu,批號(hào):BCBN3570V)、苯丙氨酸(phenylalanine,Phe,批號(hào):H20N8H48638)、賴氨酸(lysine,Lys,批號(hào):S10D9I76996)、蛋氨酸(methionine,Met,批號(hào):SLBK1770V)、酪氨酸(tyrosine,Tyr,批號(hào):BCBK5272V)、絲氨酸(serine,Ser,批號(hào):S20M11I09959)、蘇氨酸(threonine,Thr,批號(hào):S01F4G1)、L-羥脯氨酸(L-hydroxyproline,L-Hyp,批號(hào):Z03J10H92127),純度均大于98%,購(gòu)自上海源葉公司;龜甲膠(A廠家生產(chǎn),編號(hào)A-1～A-6,批號(hào)依次為20210110、20210106、20210101、20210201、20210102、20210104;B廠家生產(chǎn),編號(hào)B-1～B-3,批號(hào)依次為20090405、20111105、19110105;C廠家生產(chǎn),編號(hào)C-1～C-3,批號(hào)依次為2020121202、2020061601、2020061603;D廠家生產(chǎn),編號(hào)D-1～D-3,批號(hào)依次為180302、201103、211204);色譜純級(jí)鹽酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán);色譜純HPLC級(jí)乙腈(批號(hào):A998-4)、HPLC級(jí)甲醇(批號(hào):A452-4)、LC-MS級(jí)純凈水(批號(hào):W6-4)均購(gòu)自美國(guó)Fisher公司。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所需數(shù)據(jù)庫(kù)有TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、Swiss Target Prediction(http://swisstargetprediction.ch/)、UniProt(https://sparql.uniprot.org/)、OMIM(https://omim.org/)、Genecards(https://www.genecards.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)、PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)、STRING(https://string-db.org/)、Hiplot(https://hiplot.com.cn/)、ZINC(https://zinc.docking.org/substances/home/)、Plip(https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index)、PDB(https://www1.rcsb.org/),以及Ledock、PyMol和Cytoscape 3.7.2軟件。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品及龜甲膠供試品溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備:精確稱取17種氨基酸對(duì)照品各10 mg,加0.1 mol/L HCl 溶解并定容至1 mL,渦旋混勻,即得對(duì)照品儲(chǔ)備液(10 mg/mL)。取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液各10 μL,加90%乙腈分別稀釋得2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000 ng/mL混合對(duì)照品工作液,裝入1.5 mLEP管中。供試品溶液的制備:取龜甲膠粗粉約0.25 g,精密稱量,置25 mL量瓶中,加0.1 mol/L鹽酸溶液20 ml,超聲處理(300W,40 kHz)30 min,放冷,加0.1 mol/L鹽酸溶液至刻度,搖勻;精密量取2 mL,置5 mL安瓿中,加6 mol/L鹽酸2 ml,150 ℃水解1.5 h,放冷,移至蒸發(fā)皿中,用純水10 mL分次洗滌,洗液并入蒸發(fā)皿中,蒸干,殘?jiān)?.1 mol/L鹽酸溶液溶解,轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中,加0.1 mol/L鹽酸溶液至刻度,搖勻后取4 mL裝入EP管;取20 μL樣本,加入380 μL 50%乙腈水溶液,分別渦旋、離心5 min(13 000 r/min、4 ℃),取上清。為保證系統(tǒng)重復(fù)性、穩(wěn)定性,每5針進(jìn)行1次QC分析。

1.2.2 龜甲膠化學(xué)成分分析

色譜條件采用Waters BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),柱溫35 ℃,進(jìn)樣量2 μL;流動(dòng)相A(0.4%甲酸-20 mmol/L甲酸銨-95%乙腈溶液),流動(dòng)相B(0.4%甲酸-20 mmol/L甲酸銨-5%乙腈水溶液),梯度洗脫(0～1 min,0%→10% B;1.0～2.6 min,10%→15% B;2.5～3.5 min,15%→30% B;3.6～4.0 min,30%→30% B;4.1～6.0 min,0%→0% B)。質(zhì)譜采用正模式檢測(cè),氣簾氣35 psi,噴撞氣Medium,離子噴霧電壓5.5 kV,溫度350 ℃,噴霧氣70 psi,輔助加熱氣70 psi。ExionLC AD system為操作系統(tǒng)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

在 AB Sciex 定量軟件OS中采用氨基酸默認(rèn)參數(shù)對(duì)各離子碎片進(jìn)行識(shí)別和積分,采用面積歸一化法確定各成分相對(duì)百分含量,根據(jù)取樣量計(jì)算樣品中水解氨基酸的實(shí)際含量。采用SIMCA 14.1軟件以15個(gè)批次中17種水解氨基酸為變量進(jìn)行主成分分析,得主成分得分圖及載荷圖。采用SPSS 20.0軟件對(duì)15批龜甲膠藥材進(jìn)行因子分析。采用SIMCA 14.1軟件以17種水解氨基酸為變量進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。

1.2.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.2.4.1 龜甲膠中17種水解氨基酸的潛在靶點(diǎn)篩選

以龜甲膠的17種水解氨基酸作為潛在活性成分,采用TCMSP、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)活性成分進(jìn)行潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè);采用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)矯正靶點(diǎn)的基因名。

1.2.4.2 骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點(diǎn)與“核心靶點(diǎn)-活性成分-藥物”的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以“Osteoporosis”為關(guān)鍵詞,檢索得到OMIM、Genecards、Drugbank、PharmGKB 4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的骨質(zhì)疏松癥靶點(diǎn),取并集,然后與水解氨基酸的潛在靶點(diǎn)作交集,即得骨質(zhì)疏松癥核心靶點(diǎn)。利用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建“核心靶點(diǎn)-活性成分-藥物”網(wǎng)絡(luò)圖,借助“NetworkAnalyzer”對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治龅贸鳊敿啄z治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵成分。

1.2.4.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與Hub基因篩選

通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析骨質(zhì)疏松癥核心靶點(diǎn)間相互關(guān)系,生成PPI網(wǎng)絡(luò),利用Cytoscape繪制“骨質(zhì)疏松癥核心靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)圖”,并通過“NetworkAnalyzer”進(jìn)行拓?fù)浞治龅玫紿ub靶點(diǎn)。

1.2.4.4 GO與KEGG通路富集分析

將骨質(zhì)疏松癥核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Hiplot[9]中“GO/KEGG富集分析”模塊,閾值P<0.05,進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析,探究靶點(diǎn)在生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細(xì)胞組分(cellular component,CC)方面涉及的功能及通路。

1.2.5 分子對(duì)接

將Hub靶點(diǎn)和關(guān)鍵成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。利用ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)獲取關(guān)鍵成分的3D結(jié)構(gòu),下載為mol 2格式。PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載Hub靶點(diǎn),借助“Getbox”尋找對(duì)接口袋并用Ledock[10]進(jìn)行分子對(duì)接,PyMol輸出配體和受體為復(fù)合物,借助Plip平臺(tái)[11]明確配體與受體間相互作用力。統(tǒng)計(jì)各組合得分,最后用PyMol對(duì)活性前四的結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 龜甲膠中17種水解氨基酸的定性分析

通過液質(zhì)聯(lián)用獲得17種對(duì)照品氨基酸具體質(zhì)譜檢測(cè)條件(見表1)及龜甲膠樣品和混合對(duì)照品的總離子流色譜圖(total ion chromatogram,TIC,見圖1),圖中標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間可與龜甲膠中的水解氨基酸相對(duì)應(yīng)。質(zhì)量控制樣本(quality control sample,QC)可以較好重疊,說明儀器穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。

圖1 混合對(duì)照品(A)與樣品(B)的TIC圖Fig.1 TIC diagram of mixed controls (A) and samples (B)

表1 對(duì)照品離子對(duì)參數(shù)信息Table 1 Parameter information for the control ion pair

2.2 4所不同廠家龜甲膠中17種水解氨基酸含量比較

《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)中規(guī)定龜甲膠按干燥品計(jì)算,含L-Hyp不得少于5.4%,Gly不得少于12.4%,Ala不得少于5.2%,Pro不少于6.2%。結(jié)果顯示(見表2),A廠家6個(gè)批次中2個(gè)(A-2、A-5)、B廠家3個(gè)批次中2個(gè)(B-2、B-3)、C廠家3個(gè)批次中1個(gè)(C-1)的L-Hyp、Gly、Ala的含量均高于藥典標(biāo)準(zhǔn),D廠家樣品三個(gè)氨基酸均低于藥典標(biāo)準(zhǔn)。但各廠家Pro檢測(cè)含量均略低于藥典標(biāo)準(zhǔn)。

表2 4所廠家龜甲膠17種水解氨基酸含量的測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of the determination of 17 amino acids in TCPC from 4 companies

2.3 多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

2.3.1 4所廠家龜甲膠的差異成分篩選

主成分分析4個(gè)廠家不同批次龜甲膠中水解氨基酸成分的差異性。結(jié)果顯示,A-1、A-3、A-4、A-6、D-2、D-3、B-3樣品相似度近;A-2、B-2、C-1號(hào)樣品相似度近。載荷圖顯示,Pro、Ile、Ala、Arg、Thr、Phe、His、L-Hyp、Lys距離原點(diǎn)橫坐標(biāo)>0.25,對(duì)整體樣品質(zhì)量差異的貢獻(xiàn)度較高(見圖2)。

圖2 4所廠家龜甲膠主成分得分及17種氨基酸成分載荷圖Fig.2 PCA scores of TCPC from four companies and load diagram of 17 amino acids

2.3.2 4所廠家龜甲膠樣品的主因子提取

選擇初始特征值大于1的公因子作為主因子,結(jié)果顯示,前2個(gè)公因子累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為88.28%(見表3)。為明確所提取的各主因子的實(shí)際意義,經(jīng)方差最大正交旋轉(zhuǎn)后,得到2個(gè)主因子的因子載荷系數(shù)矩陣(見表4)。因子載荷量>0.6則納入主因子,主因子1特征值為13.66,方差貢獻(xiàn)率占總因子的80.35%,主要受Glu、Asp、Ser、L-Hyp、Lys、Arg、Thr、Ala、His、Gly含量的影響,說明這10種氨基酸對(duì)龜甲膠質(zhì)量影響較大。主因子2特征值為1.35,方差貢獻(xiàn)率為7.93%,主要受到Ile、Phe、Pro、Leu、Val、Met含量的影響,說明其對(duì)龜甲膠起次要作用。

表3 公因子的特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalues and variance contribution of the common factors

表4 旋轉(zhuǎn)后的因子載荷系數(shù)Table 4 Factor loading coefficients after rotation

根據(jù)主因子得分系數(shù)矩陣(見表5)得到原變量Xi與主因子Fi間的數(shù)量關(guān)系并計(jì)算Fi得分,由因子得分系數(shù)矩陣可得各主因子的得分函數(shù)式,見公式(1)。計(jì)算各批次龜甲膠主成分得分(PCz),以各主因子貢獻(xiàn)率為權(quán)重,主因子的得分與相應(yīng)權(quán)重累積疊加建立綜合評(píng)分函數(shù)式,見公式(2)。將綜合得分由低到高分為3組:綜合得分<-1.0 為組1,-1.0<綜合得分<1.0 為組2,綜合得分>1.0為組3。結(jié)果顯示(見表6),組3的樣品A-2、A-5、B-2、C-1總氨基酸含量最高;其次為組2的樣品A-1、A-3、A-4、A-6、B-3、C-3、D-3;再次為組1的樣品B-1、C-2、D-1、D-2。

表5 成分得分系數(shù)矩陣Table 5 Component score coefficient matrix

表6 不同廠家龜甲膠的主因子得分及綜合質(zhì)量評(píng)分Table 6 Main factor scores and combined quality scores of TCPC in different companies

(1)

式中,aij為因子得分系數(shù)矩陣第j列第i行的系數(shù),Xj為原變量標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)值。

PCz=(80.35F1+7.93F2)/88.83

(2)

2.3.3 4所廠家龜甲膠中水解氨基酸含量的聚類分析

按各批次水解氨基酸含量由低到高聚類,將15批樣品聚為3大類(見圖3),依次為I類:B-1、C-2、D-1、D-2號(hào)樣品;II類:A-2、A-5、C-1號(hào)樣品;III類:A-1、A-3、A-4、A-6、B-2、B-3、C-3、D-3號(hào)樣品。

圖3 不同廠家龜甲膠聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis diagram of TCPC from different companies

綜上所述,多元統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,4個(gè)廠家中B、C二家樣品水解氨基酸含量離散程度較高,A、D二家樣品聚類良好。其中A廠家綜合得分最高,推測(cè)A廠家6個(gè)批次的龜甲膠中水解氨基酸含量高且離散度小,質(zhì)量穩(wěn)定。

2.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.4.1 龜甲膠中17種水解氨基酸的潛在靶點(diǎn)篩選

17種水解氨基酸通過SwissTargetPrediction、TCMSP、Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)篩重后共得到175靶點(diǎn)。靶點(diǎn)較多的成分有Gly(137)、Ala(68)、Ser(52)、Asp(47)等(見表7)。

表7 龜甲膠中潛在成分及對(duì)應(yīng)潛在靶點(diǎn)數(shù)Table 7 Potential components in TCPC and the corresponding number of potential targets

2.4.2 骨質(zhì)疏松癥核心靶點(diǎn)篩選與“核心靶點(diǎn)-活性成分-藥物”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建結(jié)果

通過OMIM、Genecards、Drugbank、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)篩重后共得到4 894個(gè)骨質(zhì)疏松癥靶點(diǎn),與水解氨基酸的潛在靶點(diǎn)作交集后獲得68個(gè)骨質(zhì)疏松癥核心靶點(diǎn)(見表8)。由68個(gè)骨質(zhì)疏松癥核心靶點(diǎn)反推藥物活性成分,并構(gòu)建“核心靶點(diǎn)-活性成分-藥物”網(wǎng)絡(luò)(見圖4A),通過拓?fù)浞治龅玫椒隙戎?倍中位數(shù)(≥24),且平均中心度(≥0.069 3)、緊密度(≥0.408 1)的關(guān)鍵成分2個(gè)(見表9)。

圖4 核心靶點(diǎn)-活性成分-藥物關(guān)聯(lián)圖(A)及骨質(zhì)疏松癥核心靶點(diǎn)相互作用圖(B)Fig.4 Core target-active ingredient-drug association map (A) and osteoporosis core target interaction map(B)

表8 骨質(zhì)疏松癥核心靶點(diǎn)Table 8 Core targets in osteoporosis

表9 關(guān)鍵成分拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)Table 9 Topological properties of key components

2.4.3 骨質(zhì)疏松核心靶點(diǎn)交互作用與Hub靶點(diǎn)結(jié)果

將68個(gè)骨質(zhì)疏松核心靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),而后輸出到Cytoscape,去除游離3個(gè)節(jié)點(diǎn),網(wǎng)絡(luò)圖中包含65個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)、208對(duì)相互作用(見圖4B)。通過對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?得到符合度值2倍中位數(shù)(≥10)且平均中心度(≥0.026 3)、緊密度(≥0.388 4)的Hub靶點(diǎn)有11個(gè)(見表10)。

表10 Hub靶點(diǎn)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)Table 10 Topological properties of Hub target sites

2.4.4 GO功能及KEGG通路富集分析

GO富集分析結(jié)果共得到2 375個(gè)條目,其中BP相關(guān)條目1 992條, MF 283條,CC 200條。取P值前10條結(jié)果進(jìn)行可視化分析(見圖5A)。BP主要涉及α-氨基酸代謝過程、細(xì)胞氨基酸代謝過程、小分子分解代謝過程等。MF主要涉及維生素結(jié)合、吡哆醛磷酸結(jié)合、維生素B6結(jié)合、有機(jī)酸結(jié)合等。CC主要與膜筏、膜微域、線粒體基質(zhì)等密切相關(guān)。

圖5 GO功能(A)及KEGG通路(B)富集分析圖Fig.5 GO function (A) and KEGG pathway (B) enrichment analysis diagram

KEGG通路富集分析共得到212個(gè)信號(hào)通路(見圖5B),龜甲膠治療骨質(zhì)疏松癥主要涉及氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)、精氨酸和脯氨酸代謝(arginine and proline metabolism)、碳代謝(carbon metabolism)、精氨酸生物合成(arginine biosynthesis)等通路,其中氨基酸的生物合成涉及NAGS-GPT2-SLC25A13-PFAS-OTC等9個(gè)靶點(diǎn);精氨酸和脯氨酸代謝涉及OAT-NOS3-NOS1-GOT2-GATM等8個(gè);碳代謝涉及GPT2-SDHA-PC-ME1-GPT等8個(gè);精氨酸生物合成涉及NAGS-GPT2-OTC-NOS3-NOS1等7個(gè)。

2.5 分子對(duì)接

將關(guān)鍵成分及Hub靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。本文對(duì)接結(jié)合能在-4.30 kcal/mol到-2.75 kcal/mol之間,平均結(jié)合能-3.49 kcal/mol,小于-1.20 kcal/mol,表明Hub靶點(diǎn)與關(guān)鍵成分之間結(jié)合良好(見表11);由分子模式圖(見圖6)可知,關(guān)鍵成分通過氫鍵、鹽橋等相互作用與Hub靶點(diǎn)形成較強(qiáng)的結(jié)合力。

圖6 分子對(duì)接模式圖Fig.6 Molecular docking pattern diagram

表11 分子對(duì)接結(jié)合能Table 11 Molecular docking binding energy

3 討論與結(jié)論

本文各廠家各批次的龜甲膠水解氨基酸含量整體較藥典水平偏低,分析原因除與樣品本身質(zhì)量相關(guān)外,亦有可能與檢測(cè)方法相關(guān)。我們采用液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)水解氨基酸的特征子母離子對(duì)信號(hào),具有高靈敏度和高特異性;而藥典采用的HPLC法檢測(cè)的是化合物特征官能團(tuán)的吸光度信號(hào),難以區(qū)分相似結(jié)構(gòu)的化合物。兩者比較液質(zhì)聯(lián)用法更為精確,可排除非特異性成分的干擾,故水解氨基酸含量可能較藥典偏低。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示,龜甲膠治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵成分有Ala、Gly。其中Ala能夠幫助糖類和有機(jī)酸的代謝,改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松相關(guān)[12-14]。Gly與男性的骨折風(fēng)險(xiǎn)直接相關(guān),在膠原蛋白中發(fā)生突變會(huì)引起成骨不全癥[15,16]。龜甲膠治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)有CAT、NOS1、NOS3、F2等。過氧化氫酶(catalase,CAT)可通過抑制氧化應(yīng)激,提高小鼠體內(nèi)骨密度和骨礦含量[17-19];神經(jīng)型一氧化氮合酶(nitric-oxide synthase,brain,NOS1)與骨愈合相關(guān),主要表達(dá)于纖維軟骨區(qū)內(nèi)纖維組織和骨痂間的區(qū)域;內(nèi)皮型一氧化氮合酶(nitric-oxide synthase,endothelial,NOS3)也與骨愈合相關(guān),主要表達(dá)于主要分布于軟骨區(qū)和血管周圍細(xì)胞[20];凝血酶原(prothrombin)是成骨細(xì)胞中的特異性激動(dòng)劑,能夠刺激器官培養(yǎng)中的骨吸收[21]。KEGG和GO富集分析結(jié)果提示龜甲膠可能涉及骨細(xì)胞中維生素結(jié)合、吡哆醛磷酸結(jié)合、有機(jī)酸結(jié)合、氨基酸合成代謝等一系列生物功能;通過影響胰島素信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶G(cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G,cGMP-PKG)信號(hào)、碳代謝、氨基酸合成等信號(hào)通路起作用。胰島素信號(hào)通路可刺激骨骼肌攝取全身80%的葡萄糖[22];cGMP-PKG信號(hào)通路能夠調(diào)控骨形成,還可促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化成熟,對(duì)成骨調(diào)控具有雙向性和復(fù)雜性[23,24]。

綜上,本文采用UHPLC-QTRAP-MS/MS結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)4個(gè)廠家中A廠家龜甲膠質(zhì)量穩(wěn)定,水解氨基酸含量高;龜甲膠可能通過丙氨酸、甘氨酸等成分調(diào)控CAT、NOS1、NOS3等68個(gè)骨質(zhì)疏松核心靶點(diǎn)進(jìn)而影響氨基酸合成、精氨酸和脯氨酸代謝、碳代謝等212條信號(hào)通路發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松的作用。