基于腸道菌群探討氣陰兩虛證糖尿病腎臟疾病動物模型

陳鵬德,姚 藍*,郭 鳳,韓 雪,張文祥,韓 榮

1新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院;2新疆醫(yī)科大學教務科,烏魯木齊 830054

目前多數(shù)學者認為糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease,DKD)氣陰兩虛為DKD的基本病因病機,其病變是由消渴的陰虛燥熱為基礎演變而成,其中氣陰兩虛為最根本的條件,貫穿于DKD病程始終[1]。本論文以氣陰兩虛證作為DKD基本病機,應用高脂飼料喂養(yǎng)及小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)注射建立糖尿病腎臟疾病模型組大鼠模型基礎上,采用青皮、枳實、附子灌胃的方法(青皮、枳實有疏肝破氣之功,過用該藥可使正氣耗散;附子入腎經(jīng),大熱,過用可耗傷腎陰)探討DN氣陰兩虛證病證結合動物模型建立及考察指標[2]。

臨床研究表明,氣陰兩虛會導致DN患者機體免疫力衰退[3],免疫球蛋白G(human immunoglobulin G,IgG)、免疫球蛋白M(human immunoglobulin M,IgM)濃度的變化可以反映大鼠機體免疫力的情況。cAMP、cGMP與機體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能有關[4],有學者研究當患者出現(xiàn)陰陽失衡、陰液流失處于陰虛內(nèi)熱的虛熱狀態(tài)時,環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)、cAMP/cGMP比值會出現(xiàn)異常[5]。氣虛同樣和患者的能量代謝有關,鈉鉀泵酶(Sodium potassium pump enzyme,Na+/K+-ATP)、鈣鎂泵酶(calcium magnesium pump enzyme,Ca2+/Mg2+-ATP)是和能量代謝有關的酶,它可將三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)分解為二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)并釋放能量[6]。糖尿病腎病檢驗中尿蛋白是判斷患者身體健康狀況的重要檢驗指標,借助尿蛋白區(qū)分糖尿病腎病的差異性,為其診治提供科學參考依據(jù)[7]。

研究表明,腸道菌群紊亂與DKD的發(fā)生有關,腸道微生物可以調(diào)節(jié)DKD小鼠模型腎功能[8]。DKD患者腎小球濾過率下降,尿酸、草酸鹽等大量代謝廢物聚集于結腸,腸道環(huán)境變化,導致腸道菌群失調(diào),研究表明DKD患者腸道中有益菌減少,致病菌增加,導致炎性因子在機體循環(huán)中大量增加,加劇腎的炎性損傷[9]。目前對于DKD中醫(yī)藥研究多采用西醫(yī)DKD模型,缺乏與糖尿病腎臟疾病該領域的研究受到了一定程度的限制。因此,如何建立病證結合動物模型已經(jīng)成為中醫(yī)科研動物模型研究中的熱點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

實驗采用30只健康6周齡雄性SPF級Wistar大鼠,體重200～220 g,購自新疆醫(yī)科大學動物實驗中心(SCXK(新)2018-0002),飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學SPF級動物實驗中心(SYXK(新)2018-0003),室溫20～23 ℃,相對濕度50%～60%,所有實驗方案取得新疆醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準(IACUC-20210303-19),遵從3R原則。

1.1.2 飼料和藥材

高糖高脂飼料購自北京博愛港生物技術有限公司(飼料配比為基礎飼料52.6%,豬油10%,蔗糖13%,蛋黃粉15%,酪蛋白5%,膽固醇1.2%,膽酸鹽0.2%,維生素混合物0.5%,麥芽糊精1.5%,礦物混合物1%)、青皮(新疆和濟中藥飲片有限公司,產(chǎn)地湖北,批號:163301-01)、附子(黃岡金貴中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司,產(chǎn)地:四川,批號:D5120601)、枳實(新疆和濟中藥飲片有限公司,產(chǎn)地江西,批號:174301-02)。青皮、附子、枳實湯劑采用水煮傳統(tǒng)工藝,加入5倍量的水,煎煮1 h,過濾后,濃縮至0.5 g/mL,放置于4 ℃冰箱中以備用。

1.1.3 主要的試劑及儀器

鏈脲佐菌素(Meilunbio,貨號:MB-1227-1);糞便DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:Cat#D2700);毒蕈堿型膽堿受體M3(muscarinic type choline receptor M3,M3R)(北京博奧森生物有限公司,批號:bs-1289R);5-羥色胺受體3A(5-hydroxytryptamine receptor 3A,5-HT3A)(北京博奧森生物有限公司,批號:bs-12051R);腫瘤壞死因子-α(tunor necrosis factor-α,TNF-α)(Affinity Bioscience,批號:AF8410);白介素-6(Interleukin-6,IL-6)(Affinity Bioscience,批號:AF6087);熒光定量PCR儀(美國ABI applied biosystems 7500 fast System)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及造模

選擇30只200 g左右的雄性Wistar大鼠,將這30只Wistar大鼠隨機分為正常組(normal,Nor)(10只)、模型組(20只)。正常組喂養(yǎng)普通飼料,模型組繼續(xù)喂養(yǎng)高糖高脂飼料,4周后,對模型組大鼠腹腔注射STZ(25 mg/kg),一周后進行血糖檢測,篩選血糖大于16.7 mmol/mL的大鼠,得到符合條件糖尿病模型大鼠。待糖尿病大鼠24 h尿蛋白值顯著高于非糖尿病的大鼠,提示具備腎功能損傷,具備DN的基本特征。在第5周后,把糖尿病大鼠按照24 h尿蛋白值>20 mg,分配到糖尿病腎病疾病模型組(DKD)(10只)、氣陰兩虛病證結合模型組(model,Mod)(10只),并且兩組在血糖、24 h尿蛋白值等指標無顯著性差異,隨后對氣陰兩虛病證結合模型組大鼠按6∶5∶6用青皮、附子、枳實湯劑再灌服8周時間[10],按照13 g/kg的體質(zhì)量給藥(正常組、糖尿病腎臟疾病模型組以等體積的生理鹽水灌胃)。實驗期間對兩組模型組大鼠均高糖高脂飼料喂養(yǎng),8周后,禁食不禁水12 h,2.5﹪的戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉處理動物。

1.2.2 對血清中IgG、IgM、cAMP、cGMP含量的測定及cAMP/cGMP的計算

實驗結束后,對大鼠采用腹主動脈取血,離心后得到血清,采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清中IgG、IgM、cAMP、cGMP,并計算cAMP/cGMP值。

1.2.3 對腎臟組織中Na+/K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶含量測定

實驗結束后,取腎臟組織加入玻璃勻漿器中勻漿,5 000 r/min離心15 min,取上清液,具體方法參考ELISA說明書。

1.2.4 對24 h尿蛋白(24 h-Pro)的測定

實驗結束前最后一天,選取每組大鼠,放入代謝籠收集24 h尿液,統(tǒng)計各組大鼠尿量,放入-80 ℃冰箱保存。ELISA試劑盒測定各組大鼠尿液的尿蛋白濃度,計算24 h-Pro的值。

1.2.5 腎臟組織、結腸組織病理觀察

實驗結束后,取左腎、結腸將其固定在4%的多聚甲醛溶液中,HE染色。

1.2.6 Western blot

實驗結束后,分別取凍存的腎臟組織、結腸組織50 mg在研磨儀進行研磨,隨后加入RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白。采用10%分離膠對各組蛋白進行電泳分離和轉膜,5%牛奶封閉2 h,4 ℃一抗孵育過夜,二抗室溫孵育2 h。采用化學發(fā)光法在Azure Biosystems多功能分子成像系統(tǒng)統(tǒng)下曝光成像,ImageJ軟件進行目標蛋白灰度值分析。

1.2.7 腸道菌的分析

在處理動物之前,采用無菌的5 mL凍存管收集糞便,保存于-80 ℃冰箱。用試劑盒所述的方法提取DNA,用普通PCR擴增回收,隨后在熒光定量PCR儀上進行擴增,擴增條件是:預變性95 ℃,10 min;循環(huán)(40次)95 ℃;解曲線60 ℃ →95 ℃。對腸道菌群進行qPCR檢測(見表1),進行標準曲線構建。PCR數(shù)據(jù)分析參考文獻[11]進行。

表1 檢測腸道菌的相關PCR序列Table 1 Related PCR sequences for detecting intestinal bacteria

1.2.8 統(tǒng)計分析

2 實驗結果

2.1 對血清中IgG、IgM、cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP的測定結果

結果顯示(見表2),與Nor比較,DKD和Mod的IgG、IgM含量顯著下降(P<0.05),cAMP的含量顯著升高(P<0.05),cAMP/cGMP的比值顯著升高。與DKD比較,Mod的IgM含量顯著下降(P<0.05),cAMP的含量,cAMP/cGMP的比值顯著升高(P<0.05)。

表2 血清中的IgG、IgM、cAMP、cGMP的含量Table 2 Content of IgG,IgM,cAMP and cGMP in

2.2 對腎臟組織中Na+/K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶含量測定結果

結果顯示(見表3),與Nor相比,DKD和Mod的Na+/K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶含量顯著降低(P<0.05),與DKD比較,Mod的Na+/K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶含量也顯著降低(P<0.05)。

表3 腎臟組織中的Na+/K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的含量Table 3 Content of Na+/K+ -ATPase and Ca+-Mg2+-ATPase in kidney

2.3 對24 h尿蛋白(24 h-Pro)的測定

結果顯示(見表4),與Nor相比,DKD和Mod的尿蛋白含量、尿量、24 h-Pro量顯著升高(P<0.01),DKD和Mod沒有顯著性差異。24 h-Pro量顯著增加,提示腎功能可能出現(xiàn)了損傷。

表4 尿蛋白含量、體積、24 h尿蛋白測定結果Table 4 Urine protein content,volume and 24 h-Pro were

2.4 腎臟組織、結腸組織病理觀察

通過對大鼠腎臟HE結果觀察,與nor相比,DKD和Mod的大鼠腎小球系膜基質(zhì)增生,少量腎小管擴張,上皮細胞水腫,出現(xiàn)大量的炎性浸潤,Mod的腎小球系膜基質(zhì)增生,炎性浸潤更加顯著(見圖1)。

圖1 大鼠腎臟組織的HE結果Fig.1 HE results of rat kidneys tissue 注:與Nor比較,*P<0.05,**P<0.01;與DKD比較,#P<0.05,下同。Note:Compared with Nor, *P <0.05,**P <0.01;Compared with DKD, #P <0.05,the same below.

通過對大鼠結腸HE結果觀察,與Nor相比,DKD和Mod的大鼠杯狀細胞數(shù)量、黏液厚度、腸壁厚度明顯減少,絨毛高度也明顯降低,且有炎性細胞侵入,Mod的大鼠杯狀細胞數(shù)量、腸壁厚度明顯、絨毛高度減少更加顯著(見圖2)。

2.5 大鼠腎臟IL-6、TNF-α的表達

結果顯示,大鼠腎臟,與Nor相比,DKD和Mod的IL-6,TNF-α的表達量都升高(P<0.05),Mod的IL-6蛋白表達比DKD增加顯著(P<0.05)(見圖3)。

圖3 鼠腎臟IL-6、TNF-α蛋白的表達Fig.3 Expression of IL-6 and TNF-α proteins in rat

2.6 大鼠結腸腸道屏障蛋白及IL-6、TNF-α的表達

WB檢測結腸組織的蛋白顯示(見圖4),與Nor相比,DKD和Mod的M3R、5-HT3A、Occludin、ZO-1蛋白的表達量都顯著降低(P<0.05),IL-6、TNF-α的表達量都顯著增加(P<0.05);與DKD相比,Mod的5-HT3A、Occludin、ZO-1的表達量降低顯著(P<0.05),TNF-α表達量顯著增加(P<0.05)。

圖4 大鼠結腸腸道屏障蛋白及IL-6、TNF-α蛋白的表達Fig.4 Expression of intestinal barrier protein,IL-6,TNF-α protein in rat

2.7 腸道菌的分析結果

主成分分析(PCA)結果顯示,以可視化三組之間糞便微生物群的差異(見圖5;PC1和PC2分別為63.3%和16.3%)。在不同組中腸道菌的相對變化的也有不同的變化,Mod的含量變化明顯高于其他兩組的含量變化,與Nor相比,DKD和Mod的乳酸桿菌屬、擬桿菌門、梭菌屬、雙歧桿菌屬有益菌的含量都顯著減少(P<0.05),而厚壁菌門的量顯著增加,其中擬桿菌/厚壁菌門的比例也顯著降低(P<0.05)(見圖6A),梭桿菌屬、毛螺菌科、腸桿菌,糞腸球菌致病菌的含量都顯著升高(P<0.05)(見圖6B),其中與DKD相比,Mod的乳酸桿菌屬,梭菌屬,雙歧桿菌屬的含量明顯下降(P<0.05),梭桿菌屬、毛螺菌科、糞腸球菌的含量明顯上升(P<0.05)

圖5 腸道菌群PCA圖Fig.5 PCA of intestinal flora

圖6 腸道菌實時熒光定量PCR分析結果Fig.6 Real-time fluorescence quantitative PCR analysis results of intestinal

3 討論與結論

糖尿病在不斷發(fā)展進程中,會出現(xiàn)各種不同的并發(fā)癥,其中最為常見的就是發(fā)展成為DKD。實驗結果顯示,DKD大鼠尿蛋白水平顯著高于Nor,并且DKD的腎臟和結腸的病理損傷明顯區(qū)別于Nor大鼠,因此基本成功建立了DKD模型[12]。

腸道菌群與DKD氣陰兩虛的關系成為近年關注熱點之一,認為腸道與腎臟在免疫及炎性反應、腸道黏膜屏障等方面起著至關重要的作用[13]。如果腸道菌群組成、功能改變,會導致腸黏膜損傷,體內(nèi)毒素轉移至血液,誘發(fā)或加重免疫炎癥反應,加快了DKD的進程[14]。對160例氣陰兩虛型糖尿病腎病患者進行研究,臨床試驗表明DKD患者中擬桿菌門、雙歧桿菌、乳酸菌等明顯低于對照組,而腸桿菌、腸球菌、酵母菌、梭桿菌等高于對照組[15]。實驗結果顯示DKD和Mod中擬桿菌門、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、梭菌屬等有益菌含量降低,梭桿菌屬、毛螺菌科、腸桿菌、糞腸球菌等致病菌含量增加,結果與以前的研究基本一致[16]。同時發(fā)現(xiàn)區(qū)別于DKD,在Mod中厚壁菌門、梭桿菌、毛螺菌、糞腸球菌的量明顯升高,乳酸桿菌屬、梭菌屬、雙歧桿菌屬的量明顯下降,提示這些菌屬可能與氣陰兩虛病證密切相關。

腸道菌紊亂會導致腸道的內(nèi)毒素合成增加、炎癥反應加劇,腸道屏障破壞,有害物質(zhì)發(fā)生轉移,進而導致腎臟炎癥的不斷加劇,加快DKD的進程[17]。實驗結果顯示,腎臟和結腸的Mod的IL-6、TNF-α蛋白表達明顯升高,也證明了這一結論。Occludin、ZO-1蛋白與腸道組織緊密連接狀態(tài)相關[18]。M3R也可以通過誘導腸道細胞因子起到保護腸道黏膜穩(wěn)態(tài)的作用[19],5-HT3A可以通過免疫系統(tǒng)細胞的表達,保護腸道免疫系統(tǒng)[20]。結腸組織中相比Nor,Mod的M3R、5-HT3A、Occludin、ZO-1蛋白表達顯著降低,說明腸道屏障的穩(wěn)態(tài)可能發(fā)生了紊亂,這可能是有益菌和致病菌的含量變化所引起,最終導致DKD氣陰兩虛病證的產(chǎn)生。

氣虛的產(chǎn)生是機體元氣不足引起,氣有的推動、固攝、運化、溫煦等功能,氣不足則可能導致臟腑機能減退,臨床研究表明,糖尿病腎病患者的尿微量白蛋白、免疫球蛋白G的含量均顯著低于健康患者組[21],實驗結果中Mod的IgG、IgM蛋白濃度顯著降低,說明Mod大鼠機體免疫力下降;對172例DN患者的研究中,發(fā)現(xiàn)cAMP水平與糖尿病腎病患者腎損傷程度呈正相關性[22]。實驗中得到相比Nor,Mod的cAMP的含量顯著升高,cAMP/cGMP的比值顯著升高,cAMP/cGMP比值出現(xiàn)異常偏高或偏低,cAMP 含量升高時,大量酪氨酸羥化酶會被激活,產(chǎn)生大量多巴胺作用于神經(jīng)系統(tǒng),對人的情緒產(chǎn)生影響,導致人的興奮程度增強,所以虛熱證多會亢奮[23];研究還發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病患者的Na+/K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯的損害,這就導致細胞結構和功能受損、微循環(huán)阻滯、加重腎缺氧缺血,使血管通透性增加,尿蛋白漏出增多引起腎病的進一步發(fā)展[24],實驗結果也同樣表明,Mod的腎臟Na+/K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯低于Nor和DKD,慢性的腎臟疾病,由于病程日久導致元氣耗傷,陰液損傷形成了氣陰兩虛證,故氣陰兩虛證糖尿病腎臟疾病會導致機體能量代謝發(fā)生紊亂。

綜上所述,通過高糖高脂喂養(yǎng)4周聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素、附子,青皮,枳實灌胃誘導大鼠8周,可部分形成氣陰兩虛證糖尿病腎臟疾病基本證候特征,大鼠中標志性腸道菌群以及測定指標的差異性,可一定程度反映病證結合模型的基本特征,用于評價氣陰兩虛證糖尿病腎臟疾病模型的特征。