HS-SPME-GC-TOF-MS結合ROAV分析花果香型紅茶特征香氣成分

王金源,張佳慧,莊莉萍,林宏政,2,封 嬌,田維素,陳章盛,郝志龍,2*

1福建農(nóng)林大學園藝學院;2茶學福建省高校重點實驗室;3福建仙山巖茶園有限公司,福州 350000

紅茶是全球第一大茶類,是世界上產(chǎn)銷量最多、消費區(qū)域最廣、貿(mào)易量最大的茶類[1]。紅茶屬全發(fā)酵茶,是以茶樹鮮葉為原料,經(jīng)萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等工序制作而成,加工過程中鮮葉內(nèi)含成分經(jīng)過氧化等系列化學作用形成紅茶獨有的色、香、味品質特征[2]。由于產(chǎn)地、地理環(huán)境、茶樹品種、加工工藝等差異,使紅茶呈現(xiàn)出不同的品質風格[3,4]。

香氣是評判茶葉品質高低的重要指標[5]。目前花果香紅茶常采用黃觀音、金牡丹、金觀音等烏龍茶高香品種經(jīng)萎凋、輕搖、揉捻、發(fā)酵、干燥等工藝制成具有獨特花果香特征的紅茶,其中金牡丹制成的花果香紅茶品質特征最為典型,深受消費者青睞[6]。Pan[7]采用傳統(tǒng)工藝和花果香型紅茶工藝分別對傳統(tǒng)品種菜茶、福云6號和高香品種金牡丹、金觀音等展開研究,結果表明α-法呢烯、吲哚、順-茉莉酮、橙花叔醇、α-畢橙茄醇等香氣成分在傳統(tǒng)工藝紅茶與搖青工藝紅茶中存在差異,其中,α-法呢烯、順-茉莉酮、橙花叔醇等含量表現(xiàn)為搖青工藝顯著高于傳統(tǒng)工藝紅茶。Yan等[8]采用電子鼻和氣相色譜-三重四極桿質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)結合化學計量學研究了金觀音和福云6號兩個品種加工成工夫紅茶的香氣特征,明確了高香紅茶與傳統(tǒng)工夫紅茶的特征香氣組分差異,為不同風味紅茶的分類提供參考。Wu等[9]基于GC-MS、氣相色譜-嗅辨聯(lián)用(gas chromatography-olfactometry,GC-O)技術結合香氣活性值(odour active values,OAV)分析了金牡丹品種加工成花果香型紅茶中果香化合物和關鍵呈香物質,結果表明芳樟醇、苯乙醛和δ-癸內(nèi)酯為金牡丹主要芳香化合物。

福建省福州市永泰縣野生菜茶資源豐富[10],其鮮葉加工的花果香紅茶呈現(xiàn)出不同的風味和花果香型,滋味醇厚,且與金牡丹等高香品種加工的花果香型紅茶風味迥異[11]。目前野生菜茶加工花果香型紅茶的研究較少,其香氣特征物質尚不明確。為拓寬適制花果香型紅茶品種,探究野生菜茶與高香烏龍茶品種加工成花果香紅茶的特征香氣與差異物質,采用感官審評結合頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(headspace solid phase microextraction gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry,HS-SPME-GC-TOF-MS)技術,通過熱圖聚類分析(heat map clustering analysis,HMCA)、正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)等化學計量學方法鑒定分析7種紅茶的特征揮發(fā)性成分,比較野生菜茶紅茶和金牡丹紅茶的香氣特征差異,進一步明確野生菜茶加工成花果香型紅茶的特征香氣物質,為特殊香型紅茶的種質資源挖掘利用和產(chǎn)品創(chuàng)新提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為金牡丹(JMD)品種和永泰縣5000畝生態(tài)林菜茶中鮮葉香氣馥郁的6棵不同野生茶樹嫩梢,編號分別為Y-122、Y-127、Y-128、Y-170、Y-192、Y-193。茶樣制作的工藝流程為:鮮葉→萎凋→搖青(1搖→萎凋→2搖→萎凋)→揉捻→發(fā)酵→烘干。鮮葉采摘:2021年4月晴天采摘新梢1芽2、3葉為原料。萎凋:室內(nèi)自然萎凋至葉色轉暗,梗折不斷,青氣減退,花果香顯為適度,約8～10 h。搖青:與萎凋交替進行,輕搖2次,轉速20 r/min,1搖1 min,2搖5 min,2次搖青間隔1～3 h,輕搖后繼續(xù)萎凋。揉捻:細胞破碎率70%以上,茶汁溢出,成條率80%以上,約10～15 min。發(fā)酵:室溫25～30 ℃,相對濕度85%～95%,發(fā)酵時間3～6 h,葉色轉銅紅色,青氣消退,出現(xiàn)清新花果香為適度。烘干:毛火110～120 ℃,時間10～20 min,而后攤涼30 min,足火80 ℃烘至足干。

1.2 儀器與設備

7890B氣相色譜儀(美國安捷倫科技公司);Pegasus HT飛行時間質譜儀(美國LECO公司);MC京制00000246精密天平(德國Sartorius公司);5430R臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);G560E渦旋振蕩器(美國Industrial Industries公司);LCJ-25C冷凍干燥機(北京四環(huán)科學儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 感官審評

審評小組由5名具有高級評茶員資格證的專家組成,參照GB/T 23776-2018《茶葉感官審評方法》中紅茶柱形杯審評法,僅對香氣進行測評。參考GB/T 14487-2017《茶葉感官審評術語》,結合紅茶樣品的香氣特征,整理出5種香氣類型:花香、果香、杏仁香、甜香、青草香。采用0～5的數(shù)字評價特征香氣的強度,0表示該香型不存在,1可識別,2弱,3中等,4強,5濃郁,數(shù)據(jù)的均值在雷達圖上表示。

1.3.2 紅茶香氣成分測定

所取樣品采用頂空固相微萃取法(HS-SPME)萃取香氣,GC-TOF-MS進行檢測分析,所有試驗重復3次。

萃取條件:萃取針PDMS/DVB(1 cm×65 μm,美國Supelco公司);萃取孵化溫度80 ℃;孵化時間31 min;萃取時間60 min;解吸時間3.5 min;光纖預烘烤溫度250 ℃;光纖預烘烤時間30 min。

氣相色譜條件:色譜柱Restek Rxi-5Sil MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);模式:前進式模式,不分流;進樣口溫度250 ℃,傳輸線溫度275 ℃;載氣為He,載氣流速1 mL/min;柱溫程序升溫:50 ℃保持5 min,以3 ℃/min的速率升至210 ℃,保持3 min,再以15 ℃/min的速率升至230 ℃。

質譜條件:溶劑延遲時間5 min;電子電離源,電離能量70 eV,離子源溫度250 ℃;質量掃描范圍30～500m/z;質譜檢測器電壓1 530 V,采集速率10 spectra/s,質譜數(shù)據(jù)采集時間200 s。

1.3.3 定性分析

揮發(fā)性化合物通過由正烷烴C5-C30確定的保留指數(shù)(retention index,RI),與美國國家標準與技術研究所圖書館(NIST 14)中的質譜進行比較鑒定。揮發(fā)性成分的化學結構、名稱和氣味根據(jù)PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)和風味成分庫(https://www.femaflavor.org)確定。各色譜峰面積與總峰面積比值的面積歸一[12]計算求得紅茶各香氣組分的相對含量。

1.3.4 ROAV計算方法

在各種揮發(fā)性成分相對定量的基礎上,根據(jù)參考文獻中各揮發(fā)性物質在水中的香氣閾值,按公式(1)計算各成分的ROAV。

(1)

式中:Ci為各揮發(fā)性成分的相對含量,%;Ti為各揮發(fā)性成分的感覺閾值,μg/kg;Cmax為對茶葉香氣貢獻值最大的揮發(fā)性成分所對應的相對含量;Tmax為對茶葉香氣貢獻值最大的揮發(fā)性成分所對應的感覺閾值。

所有揮發(fā)性物質的ROAV值不大于100.00,ROAV≥1.00的揮發(fā)性成分被認為是關鍵呈香物質,ROAV值越大,則該成分對香氣的貢獻度越大,0.10≤ROAV<1.00的揮發(fā)性成分對茶葉香氣具有修飾作用[13]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件整理分析數(shù)據(jù),Origin 2022軟件繪制雷達圖;GraphPad Prism 9軟件繪制百分比堆積圖;TBtools軟件對揮發(fā)性物質進行可視化聚類分析;SIMCA 14.1軟件進行OPLS-DA分析,并計算預測變量重要性投影(variable importance in projection,VIP);采用SPSS 26.0軟件進行單因素分析,以VIP>1,P<0.05為條件篩選特征差異香氣成分。

2 結果與分析

2.1 香氣感官品質分析

為區(qū)分花果香型紅茶香氣的類型,對7個紅茶的花香、果香、杏仁香、甜香、青草香等香氣特征評價指標繪制雷達圖(見圖1)。結果表明,7個紅茶的香氣差異特征明顯,杏仁香是Y-122的主要香氣輪廓;Y-127、Y-128、Y-170、Y-192和Y-193皆屬于花果香型,Y-127、Y-128呈馥郁花香特征并帶有果香,Y-170以甜香為主,花香、果香較為突出,Y-192呈現(xiàn)清花香帶果香特征,Y-193呈現(xiàn)熟果香特征并帶有甜香;JMD的香氣主要以果香為主,并以花香、甜香為輔。這與Yang[14]、Yang[15]、Luo[16]等研究認為茶樹品種是影響紅茶香氣品質的重要因子一致。

圖1 花果香型紅茶香氣特征雷達圖Fig.1 Radar map of aroma characteristic profile of black tea with flowery-fruity flavour

2.2 不同花果香型紅茶揮發(fā)性物質分析

2.2.1 不同花果香型紅茶總揮發(fā)性成分分析

7個紅茶通過GC-TOF-MS共檢測出82種揮發(fā)性化合物(見表1),總體香氣組分種類相似,其中,從JMD、Y-122、Y-127、Y-128、Y-170、Y-192和Y-193中分別鑒定出70、63、62、60、66、63和63種揮發(fā)性成分,包括醇類19種、酯類16種、醛類12種、酮類9種、酸類6種、烯類5種、內(nèi)酯類5種和其他類10種。由圖2可知,醇類、酮類、酯類物質相對含量較高,占總量的82.00%～92.73%,與Luo[16]、Lian[17]等研究相似,這3類物質是紅茶的主要揮發(fā)性物質種類。醇類化合物通常帶有特殊的花香和果香,其種類和相對含量在各種茶中均較高,酯類物質通常呈現(xiàn)果香,酮類化合物一般帶有甜香和花果香,這三類相對含量較高的物質共同賦予了花果香紅茶的花果香、甜香特征,與感官審評結果相一致。Y-122樣品有8種酯類物質,且酯類相對含量顯著高于其他樣品,可能是該樣品香氣的主要貢獻物質,其中水楊酸甲酯在酯類中含量最高,可能是其呈杏仁香的主要物質。Y-128樣品包含16種醇類物質,且醇類物質相對含量顯著高于其他樣品,可能是該樣品香氣的主要貢獻物質,芳樟醇氧化物Ⅱ在醇類中含量最高,可能是其呈馥郁花香帶果香的主要物質,這些結果與香氣感官品質結果相一致。

表1 7種花果香型紅茶揮發(fā)性成分相對含量Table 1 Relative content of volatiles in seven kinds of black tea with flowery-fruity flavour

圖2 7種花果香型紅茶揮發(fā)性物質的種類占比Fig.2 The proportion of volatile compounds in seven kinds of black tea with flowery-fruity flavour

正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)是一種有監(jiān)督的多元判別分析統(tǒng)計方法,能夠較為直觀地反映樣本成分構成的近似度關系,距離越近,其香氣組成和相對含量就越相似,可有效篩選關鍵標志性差異物質[18,19]。采用OPLS-DA分析7個紅茶樣品的揮發(fā)性成分,如圖3A所示,7個茶樣能被明顯地分為3個大組,Y-122、JMD和第三大組(Y-127、Y-128、Y-170、Y-192、Y-193),第三大組又分為2小組(Y-127、Y-128和Y-170、Y-192、Y-193),表明不同花果香型紅茶揮發(fā)性物質的組成有明顯差異,此結果與感官審評結果一致。進一步對模型進行檢驗,如圖3B所示,本次分析中的自變量擬合指數(shù)(R2X)為0.949,因變量擬合指數(shù)(R2Y)為0.982,模型預測指數(shù)(Q2)為0.952,R2和Q2超過0.5表示模型擬合結果可接受[20]。經(jīng)過200次置換檢驗(Permutation test),Q2回歸線與縱軸的相交點小于零,說明模型不存在過擬合,模型驗證有效,認為該結果可進一步用于茶葉香氣的差異鑒別分析。

圖3 不同花果香型紅茶總揮發(fā)性物質相對含量正交偏最小二乘判別分析Fig.3 OPLS-DA of relative content of total volatiles in different black tea with flowery-fruity flavour注:A.OPLS-DA得分散點圖;B.模型交叉驗證結果。Note:A.Scatter plot of OPLS-DA ;B.Model cross-validation results.

2.2.2 不同花果香型紅茶揮發(fā)性成分差異分析

為了進一步分析不同揮發(fā)性物質對花果香紅茶香氣的貢獻,根據(jù)VIP>1且P<0.05篩選出21種差異揮發(fā)性物質,如圖4所示,7個紅茶揮發(fā)性成分及含量存在明顯差異。圖中區(qū)域A的物質為JMD紅茶中相對含量顯著高于其他樣品的揮發(fā)性成分,分別是己酸葉醇酯、苯乙醇、苯甲醇、橙花叔醇和苯乙腈,為JMD紅茶的特征差異揮發(fā)性物質。區(qū)域B的物質為Y-122中相對含量顯著高于其他茶樣的揮發(fā)性物質,分別是水楊酸甲酯、壬酸,為Y-122紅茶的特征差異揮發(fā)性成分。區(qū)域C的物質為Y-170、Y-192、Y-193共有含量較高的揮發(fā)性物質,其中Y-170紅茶的香葉基丙酮含量顯著高于其他樣品;Y-192紅茶中α-法呢烯、γ-壬內(nèi)酯、庚酸含量顯著高于其他樣品;Y-193中的2-乙基己醇含量顯著高于其他樣品。茶葉香氣是多種芳香物質以不同濃度組合的綜合表現(xiàn)[21],可見Y-170、Y-192、Y-193樣品因揮發(fā)性成分含量的差異而呈現(xiàn)出不同類型花果香。區(qū)域D的物質為Y-127、Y-128共有含量較高的揮發(fā)性物質,其中(E)-3-己烯-1-醇和吲哚的相對含量顯著高于其他茶樣,可能是Y-127、Y-128呈現(xiàn)馥郁花香帶果香的特征差異揮發(fā)性物質。Y-127紅茶的己酸、芳樟醇、吲哚和(E)-3-己烯-1-醇含量顯著高于其他樣品,這可能是127紅茶花果香特征比Y-128更濃郁的原因。

圖4 不同花果香紅茶差異揮發(fā)性成分聚類熱圖及VIP值Fig.4 Heatmap and VIP value of differential volatiles in different black tea with flowery-fruity flavour

2.2.3 不同花果香型紅茶關鍵呈香物質分析

茶葉香氣的呈現(xiàn)是由各揮發(fā)性成分的氣味閾值與濃度共同決定的[22]。為進一步分析不同揮發(fā)性物質對香氣的貢獻度(ROAV),在篩選的特征揮發(fā)物(見圖4)基礎上,分析出ROAV>1.00的13種揮發(fā)性物質(見表2),其中己酸葉醇酯、苯乙醇、苯甲醇、橙花叔醇(VIP>1,ROAV>1)是JMD的重要香氣物質,且具有花香的橙花叔醇(ROAV=50.85)、苯乙醇(ROAV=11.88)和具有果香的己酸葉醇酯(ROAV=1.47)對JMD的香氣貢獻高于其他茶樣(見圖5),可能是構成JMD紅茶果香帶有花香的特征香氣物質。香葉醇和水楊酸甲酯(VIP>1,ROAV>1)為Y-122重要香氣物質,具有杏仁香、果香、薄荷冬青香的水楊酸甲酯(ROAV=16.31)對Y-122的香氣貢獻高于其他茶樣(見圖5),可能是Y-122呈現(xiàn)杏仁香的特征香氣物質。茉莉酮(VIP>1,ROAV>1)為Y-127、Y-128共有的重要香氣物質,芳樟醇為Y-127的重要香氣物質。其中具有玫瑰花香、甜香、柑橘味的芳樟醇(ROAV=100)對Y-127的香氣貢獻高于其他茶樣(見圖5),可能是Y-127呈現(xiàn)馥郁花香帶果香的特征香氣物質。橙花叔醇、苯乙醛、芳樟醇氧化物Ⅱ、香葉基丙酮(VIP>1,ROAV>1)為Y-170、Y-192、Y-193呈清香、花香、果香和甜香的物質基礎,γ-壬內(nèi)酯為Y-170、Y-192共有的重要香氣物質,α-法呢烯為Y-192的重要香氣物質。其中具有椰子味的γ-壬內(nèi)酯(ROAV=1.66)和具有清香、花香、木香的α-法呢烯(ROAV=1.3)對Y-192的香氣貢獻高于其他茶樣(見圖5),可能是Y-192呈現(xiàn)清花香帶果香的特征香氣物質。

表2 不同花果香紅茶差異香氣成分ROAV值Table 2 ROAV values of differential aroma compounds in different black tea with flowery-fruity flavour

圖5 不同花果香紅茶特征香氣物質Fig.5 The characteristic aroma compounds in different black tea with flowery-fruity flavour注:圖中數(shù)據(jù)為該物質ROAV值。Note:The data in the figure is the ROAV value of the compound.

3 討論與結論

風味是消費者評價茶葉品質最重要的標準之一,而關鍵香氣化合物的表征對于茶葉的品質至關重要[28]。本研究采用HS-SPME-GC-TOF-MS技術比較分析了6個永泰菜茶和金牡丹加工的花果香紅茶揮發(fā)性物質,發(fā)現(xiàn)不同茶樹品種紅茶雖然存在相同的揮發(fā)性成分,但也有各自獨特的成分,導致紅茶呈現(xiàn)出不同的花果香型。7個紅茶的感官香氣特征呈現(xiàn)出花香、果香、杏仁香、甜香、清香的香型。

7個紅茶樣品中共鑒定出82種揮發(fā)性化合物,包括醇類、酯類、醛類、酮類、酸類、烯類等,其中醇類、酮類、酯類物質在花果香紅茶揮發(fā)性成分中相對含量較高,大多具有令人愉悅的花香、果香和甜香?；诨ü慵t茶揮發(fā)性成分進行OPLS-DA建模,7種花果香紅茶被有效劃分為三組,對不同花果香型紅茶識別度較高。進一步篩選出VIP>1的21種揮發(fā)性成分(P<0.05),是不同紅茶的特征差異揮發(fā)性物質。結合相對氣味活度值(ROAV)分析,篩選出13種特征香氣物質(VIP>1,ROAV>1.00),其中己酸葉醇酯、橙花叔醇、苯乙醇、水楊酸甲酯、芳樟醇、γ-壬內(nèi)酯和α-法呢烯共7種物質為永泰菜茶和金牡丹品種加工花果香紅茶的特征香氣物質。具有果香的己酸葉醇酯和具有花香的橙花叔醇、苯乙醇在JMD紅茶呈現(xiàn)果香帶花香的風味中占據(jù)了主導地位,協(xié)調(diào)己酸葉醇酯、苯乙醇、苯甲醇、橙花叔醇等重要香氣物質共同構成了JMD紅茶果香帶花香的復合香氣,這與Pan等[7]研究認為金牡丹花果香型紅茶具有花果香且橙花叔醇等香氣含量較高的結論相一致。

水楊酸甲酯、芳樟醇、γ-壬內(nèi)酯和α-法呢烯4種物質為永泰菜茶加工花果香紅茶的特征香氣物質。其中香葉醇和水楊酸甲酯為Y-122重要香氣物質,具有杏仁香、果香、薄荷冬青香的水楊酸甲酯是Y-122呈現(xiàn)杏仁香的特征香氣物質。Wang等[29]對廣東野生茶樹群落紅茶香氣研究發(fā)現(xiàn),香葉醇、水楊酸甲酯、苯甲醛等香氣共同形成了野生紅茶獨特的杏仁香風味,與本研究中Y-122紅茶呈現(xiàn)杏仁香有相似的香氣成分。芳樟醇(玫瑰花香、甜香、柑橘味)是Y-127呈現(xiàn)馥郁花香帶果香的特征香氣物質。橙花叔醇、苯乙醛、芳樟醇氧化物Ⅱ、香葉基丙酮為Y-170、Y-192、Y-193的物質基礎,這些物質共同賦予了Y-170、Y-192、Y-193樣品花香、果香、甜香的復合風味。具有椰子味的γ-壬內(nèi)酯和具有清香、花香、木香的α-法呢烯是Y-192呈現(xiàn)清花香帶果香的特征香氣物質。研究明確了有花果香特征的水楊酸甲酯、芳樟醇、γ-壬內(nèi)酯和α-法呢烯是永泰菜茶加工花果香紅茶的關鍵呈香物質,這為特殊風味紅茶的種質資源挖掘和特殊風味紅茶品質調(diào)控提供參考,而關于這些關鍵香氣成分的合成調(diào)控機制有待深入研究。