4 種靜注人免疫球蛋白制品的自身IgG 抗體多樣性研究*

晏曉晨 馬莉 王宗奎 李長清 雷婷婷 杜晞 葉生亮

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院輸血研究所,四川 成都 610052)

靜注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG,pH4.0),主要成分為免疫球蛋白G(IgG),廣泛應(yīng)用于各種免疫缺陷性疾病、炎癥疾病和自身免疫疾病的治療[1-3]。IVIG含有的針對外源性病原以及自身抗原的廣譜IgG 抗體,是其治療多種疾病的關(guān)鍵因素之一[4]。不同血液制品廠家原料血漿的采集地域、人口遺傳因素、制備工藝、病毒滅活工藝等差異,會影響制品中IgG 的抗體種類、數(shù)量以及分子結(jié)構(gòu),從而影響制品的生物學(xué)功能和臨床治療的有效性[5-7]。研究表明不同廠家IVIG 制品中IgG 識別模式病原微生物蛋白質(zhì)的數(shù)量以及種類有明顯差異[8]。相對于針對病原的抗體,IgG自身抗體在IVIG 治療免疫炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮的作用更加重大[9]。但目前國內(nèi)外尚缺乏關(guān)于IVIG 自身抗體譜研究,以及抗體譜差異與疾病療效關(guān)系的臨床數(shù)據(jù)報道。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,利用新技術(shù)開展IVIG 中IgG 抗體多樣性研究,進(jìn)一步了解制品的獨特性、有效性差異至關(guān)重要[10]。

本研究以我國4 個廠家IVIG 為研究對象,首先,以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)總蛋白為抗原庫,采用雙向電泳結(jié)合免疫印跡雜交技術(shù),展示了4 個制品的自身IgG 抗體譜,其次,利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù),將IVIG 與包被了近20 000 個重組人蛋白的人類蛋白質(zhì)組芯片雜交,檢測了制品中IgG 識別的自身抗原種類和多樣性,報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HUVEC 購自上海中喬新舟公司,人IVIG 制品4 份,由國內(nèi)4 個血液制品企業(yè)A、B、C、D 生產(chǎn)并贈予,分別標(biāo)號IVIG-A、IVIG-B、IVIG-C 和IVIG-D,4 個制品均已通過生物制品批簽發(fā)且在產(chǎn)品有效期內(nèi)。HuProtTM人類蛋白質(zhì)組芯片,美國CDI Laboratories 公司生產(chǎn),覆蓋有23 136 種人類全長蛋白質(zhì)。

1.2 試劑與儀器 細(xì)胞培養(yǎng)用FBS(批號NT9670B)、青霉素-鏈霉素溶液(批號 R190726CE)、 RPMI-1640 (批號WH190730CE)、 PBS ( 批號 W190820CE)、 胰酶( 批號69090400)為北京EallBio 公司產(chǎn)品,pH4-7 線性等電聚焦預(yù)制膠條(17 cm,批號64085073) 、pH3-10 兩性電解質(zhì)(批號64024281)、 Chaps(批號64066971) 均購自美國Bio-Rad公司,0.45um PVDF 膜(美國GE 公司,批號A10122278),辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗人IgG Fc 單克隆抗體(美國Abcam 公司,批號GR169991-2),辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光底物(美國Thermo 公司,批號P7207587A),細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo 公司,HERAcell 2401),倒置顯微鏡(日本Olympus 公司,CKX31),離心機(美國Thermo 公司,Biofuge Stratos),等電聚焦儀(Protean IEF Cell)、蛋白電泳系統(tǒng)(Protean Ⅱxi Cell),半干轉(zhuǎn)印槽(美國Bio-Rad 公司,Trans-Blot SD),蛋白凝膠掃描儀(Power Look 2100XL,美國UMAX 公司),化學(xué)發(fā)光成像儀(美國GE 公司,ImageQuant LAS4000 mini),芯片掃描儀(美國Axon 公司,GenePix 4000B),分析軟件(美國Axon公司,GenePixTM Pro v6.0)。

1.3 HUVEC 的培養(yǎng)及總蛋白提取 用含有10% FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基,在37℃,5% CO2,95% 飽和濕度條件下培養(yǎng)細(xì)胞并傳代,當(dāng)細(xì)胞到達(dá)合適細(xì)胞量時收集細(xì)胞,加入蛋白提取液(8M 尿素,40mM Tris,1% NP40)裂解細(xì)胞,收集裂解液上清液即為HUVEC 總蛋白提取液。蛋白提取液經(jīng)BCA 法進(jìn)行蛋白定量后分裝,－70 ℃凍存待用。

1.4 IVIG 針對HUVEC 總蛋白的IgG 抗體譜實驗 HUVEC總蛋白的雙向電泳(2-DE)和免疫印跡雜交(Western Blot)實驗參考本實驗室建立的IVIG 及血漿制品針對大腸桿菌的抗體譜展示方法[8,11],并做了部分實驗條件的調(diào)整,主要流程及條件為:HUVEC 總蛋白提取液1～1.5mg 上樣于pH4～7 非線性等電聚焦膠條(長度17 cm)上進(jìn)行聚焦(10 000V,60 000 VH),聚焦后的膠條固定于20cm 10% 聚丙烯酰胺凝膠上端,進(jìn)行第二向SDS-PAGE(200V,8h)。電泳結(jié)束后,立即用考馬斯亮藍(lán)染色并掃描圖像,判斷分離效果,或電泳結(jié)束后進(jìn)行Western Blot 步驟:將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白點轉(zhuǎn)到甲醇活化的PVDF 膜上,經(jīng)BSA 溶液封閉后,依次與IVIG 制品、稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗人IgG Fc抗體(1﹕2 000)孵育。最后將膜與辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光底物孵育后,用化學(xué)發(fā)光成像儀采集圖像結(jié)果,獲得抗體譜。

1.5 IVIG 與人自身蛋白質(zhì)芯片雜交實驗 將HuProt 芯片浸入封閉液(含5% BSA 的TBS-T 緩沖液pH ＝7.5)封閉,待測IVIG 制品用5% BSA 的TBS-T(pH＝7.5)稀釋2 000 倍,與芯片在雜交盒中孵育1 h 后,向雜交盒中加入稀釋的二抗(Anti-IgG-Cy3),室溫避光孵育1 h,利用GenePix 4000B 掃描儀于532 nm 處掃描芯片,獲得芯片圖像。利用GenePixTM Pro v6.0 軟件讀取芯片圖像原始數(shù)據(jù)。

1.6 IVIG 自身抗體譜圖像分析 利用2-DE 圖像分析軟件PDQuest 8.0(Bio-Rad)對IVIG 制品自身抗體譜進(jìn)行分析。

1.7 生物信息學(xué)分析 利用軟件Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVID)v6.8 對IVIG 制品中IgG 抗體識別的蛋白,以及不同IVIG 制品差異識別的自身抗原蛋白信息在蛋白功能注釋、細(xì)胞定位等多個層面進(jìn)行生物信息注釋和分析。

2 結(jié)果

2.1 HUVEC 總蛋白2-DE 分析 HUVEC 經(jīng)傳代培養(yǎng)后裂解獲取總蛋白,作為與IVIG 進(jìn)行免疫印跡雜交實驗的自身抗原庫。HUVEC 總蛋白經(jīng)pH 4～7 非線性等電聚焦和20cm 10% SDS-PAGE 后染色,掃描圖譜見圖1。圖譜顯示,HUVEC總蛋白質(zhì)得到了較好的分離展示,蛋白點重疊情況較少,利用雙向電泳圖像軟件分析,能夠清楚識別的蛋白質(zhì)點超過650 個。電泳結(jié)果能夠用于進(jìn)一步的抗體圖譜實驗。

圖1 考馬斯亮藍(lán)染色的HUVEC 蛋白質(zhì)組二維電泳圖譜

2.2 4 種IVIG 針對HUVEC 總蛋白的抗體譜展示 根據(jù)建立的實驗方案,對4 個廠家的IVIG 制品的IgG 抗體譜展示如圖2 所示。圖譜顯示,雜交斑點位置清晰,交連情況少,易于分析。4 組IVIG 制品均能夠識別大量HUVEC 蛋白質(zhì),識別的抗原分布于pH4～7,20～150 KD 之間,不同廠家制品針對HUVEC 蛋白質(zhì)的抗體譜各具特點,且有明顯差異,具體表現(xiàn)在識別抗原的數(shù)量和種類方面。IVIG-B、C 識別數(shù)量相對較多,免疫雜交信號更清晰,D 雜交圖譜在pH6～7,50～100 KD區(qū)域識別蛋白相對較少,A 在pH5～6,30～50 KD 區(qū)域識別蛋白相對較少。

圖2 國內(nèi)4 個廠家IVIG 制品針對人自身抗原(HUVEC 蛋白質(zhì)組)的IgG 抗體譜

利用二維電泳分析軟件分析圖譜,并對雜交點數(shù)量進(jìn)行計數(shù),4 個制品識別的HUVEC 蛋白質(zhì)數(shù)量分別為241、364、386 和309 個(表1)。

表1 國內(nèi)4 個廠家IVIG 制品針對人自身抗原的IgG 抗體譜免疫雜交斑點數(shù)量

2.3 芯片雜交 將待測的IVIG 樣品稀釋后,與重組人蛋白質(zhì)的芯片雜交,雜交芯片使用GenePix 4000B 掃描儀進(jìn)行掃描,獲得芯片圖像,如圖3 所示(局部舉例)。蛋白質(zhì)芯片實驗結(jié)果4 個IVIG 制品分別與重組人蛋白質(zhì)芯片雜交,雜交圖像經(jīng)軟件收集信號,信號數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)據(jù)歸一化、標(biāo)準(zhǔn)化處理,設(shè)置檢出蛋白閾值,篩選出兩重復(fù)均滿足閾值的蛋白作為檢出蛋白。最終確定4 個制品分別識別的自身抗原數(shù)量為292～435 個(表2)。

表2 國內(nèi)4 個廠家IVIG 制品識別人蛋白質(zhì)芯片上蛋白質(zhì)點的數(shù)量

圖3 IVIG 與人類蛋白質(zhì)組芯片雜交信號掃描圖(局部)

總體來講,本實驗選擇的4 個廠家IVIG 中均含有針對人自身蛋白的廣譜抗體,但4 個制品識別的蛋白數(shù)量各不相同。與抗體譜實驗中得到的IVIG 針對人HUVEC 總蛋白的IgG 抗體譜免疫雜交斑點數(shù)量(表1)相比,不同IVIG 識別蛋白點的數(shù)量趨勢相對一致,識別蛋白最多的是IVIG-C,其次是B,D 和A。除IVIG-D 外,其他3 個制品在芯片實驗中識別的抗原點的數(shù)量均多于在抗體譜展示實驗中識別HUVEC蛋白質(zhì)點的數(shù)量。

為進(jìn)一步分析我國不同廠家IVIG 制品自身抗體種類與含量異同,我們對4 個制品識別的人自身抗原進(jìn)行了兩兩比較分析,計算各制品與芯片上對應(yīng)蛋白質(zhì)點反應(yīng)的歸一化信號值比值,組間差異識別的蛋白信號值必須滿足比值≥1.2或≤0.833(即1/1.2)。結(jié)果采用Venn 圖展示如圖4 所示。4 個IVIG 制品共識別芯片上623 個人重組蛋白,但不同制品能夠識別人自身抗原的種類和結(jié)合自身抗原的抗體含量有很大差異,僅有172 個人自身蛋白被4 個制品均識別,且結(jié)合各制品IgG 抗體含量無差異。

圖4 Venn 圖展示4 個IVIG 制品中IgG 結(jié)合人蛋白組芯片上的抗原種類及含量的異同

2.4 IVIG 識別的自身抗原的生物信息學(xué)分析 本實驗4 個制品檢出蛋白功能注釋分析如圖5 所示,4 個制品識別的蛋白功能主要集中在轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA 加工和修飾、細(xì)胞骨架、翻譯后修飾等方面。相互比較發(fā)現(xiàn),在各功能分類下,各制品識別抗原數(shù)量各不相同,反映出不同IVIG 制品識別的蛋白質(zhì)的功能不同。制品A、B 和C 識別的人自身抗原的COG 功能分布圖相對一致。對各制品檢出蛋白的生物學(xué)過程分析統(tǒng)計結(jié)果表明,制品A、B 和C 識別的人自身抗原主要參與mRNA 代謝、加工,RNA 剪接、穩(wěn)定性調(diào)控,細(xì)胞酰胺代謝過程等過程,而制品D 識別的蛋白主要參與生物之間的種間相互作用,質(zhì)膜內(nèi)陷,酰胺合成、代謝,細(xì)胞吞噬及mRNA 代謝和RNA 剪接等過程,與其他3 個制品有較大差別。對各制品檢出蛋白的細(xì)胞成分分析統(tǒng)計結(jié)果表明,目標(biāo)蛋白多集中于細(xì)胞核(核腔、核質(zhì)、核仁)、非膜界細(xì)胞器、核糖核蛋白顆粒、細(xì)胞骨架和細(xì)胞質(zhì)應(yīng)激顆粒等。蛋白的分子功能富集分析結(jié)果表明,目標(biāo)蛋白主要為與RNA、特異性蛋白域、細(xì)胞骨架蛋白、肌動蛋白以及免疫球蛋白受體等結(jié)合的結(jié)合蛋白。

圖5 IVIG 制品識別蛋白COG 功能分類分布圖

3 討論

IVIG 是以數(shù)千個供體的混合血漿為原料提取的血液制品,包含了針對外來病原以及自身抗原的廣譜IgG 抗體,與治療性單克隆抗體相比,它們包含了廣泛的反應(yīng)性[12-13]。其含有大量在人體生理過程中有重要的作用的自身抗體,在自身免疫性疾病和炎癥性疾病的治療中發(fā)揮著重要的作用,如:清除衰老細(xì)胞,抗腫瘤,抗炎以及介導(dǎo)免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[14-15]。有臨床研究表明,不同品牌、不同地區(qū)廠家生產(chǎn)的IVIG 在治療同種疾病時的療效是存在差異的,不同IVIG 臨床治療時的副反應(yīng)也各不相同,可能與IVIG 制品的成分、IgG 種類差異有關(guān)[16-18]。由于不同血液制品廠家獻(xiàn)漿人員的遺傳背景,生活的地理區(qū)域和環(huán)境差異,會影響原料血漿中抗體多樣性[8,11],IVIG 制造工藝的差異,也會影響制品的生物學(xué)功能,不同IVIG 制品中IgG 抗體識別抗原的差異[7,19]。我們的前期實驗研究了我國多個血液制品企業(yè)IVIG 針對特定病原抗原庫的IgG 抗體譜情況,發(fā)現(xiàn)不同IVIG 制品IgG 抗體差異顯著[8]。

本研究建立了IVIG 針對人自身細(xì)胞抗原庫的IgG 抗體譜(自身抗體譜)的展示方法,并對4 個廠家IVIG 自身抗體譜進(jìn)行了展示、分析。通過抗體譜展示技術(shù),能夠通過直觀觀察及利用分析軟件分析差異抗原的數(shù)量、在圖譜中的位置,也可用于進(jìn)一步結(jié)合質(zhì)譜實驗分析識別抗原的種類,實驗中4 個IVIG 制品的中IgG 識別HUVEC 蛋白的數(shù)量和種類都明顯差異。利用人自身蛋白質(zhì)芯片雜交實驗,進(jìn)一步確定4 個制品針對重組人蛋白庫的抗體種類數(shù)量差異,結(jié)果與抗體譜實驗一致。利用生物信息學(xué)方法對蛋白芯片上IVIG識別的重組人蛋白質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),IVIG 與細(xì)胞質(zhì)和核蛋白結(jié)合最強烈,這與Washburn,Bussone 及Wymann 等團隊發(fā)表的數(shù)據(jù)一致[20-22]。

近年來,國家食品藥品管理局要求國內(nèi)的血液制品廠家在新的IVIG 注冊申報時,提供制品中抗體多樣性分析,但沒有規(guī)定明確的方法。本實驗建立的抗體譜展示分析方法,可以進(jìn)一步完善IVIG 評價技術(shù)體系,應(yīng)用于國內(nèi)各企業(yè),為血液制品生產(chǎn)企業(yè)關(guān)于產(chǎn)品質(zhì)量內(nèi)部質(zhì)控及工藝開發(fā)提供技術(shù)支撐,也有助于國家食品藥品管理局對新的IVIG 的評估,實驗結(jié)果展示了不同IVIG 中含有的與臨床治療密切相關(guān)的IgG 抗體情況和不同廠家IVIG 自身抗體譜的獨特性,將為指導(dǎo)臨床更好地選擇用藥奠定基礎(chǔ),通過高通量鑒定分析IVIG中抗體的種類,并對IVIG 中抗體信息的深度挖掘,將為揭示IVIG 治療各種疾病的作用機理及開發(fā)新適應(yīng)癥提供了新的策略和切入點。本研究還存在一定局限性,研究是初步的,對于治療的影響、療效機制的研究,還需要在這些數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)之上,采取更多與臨床的結(jié)合以及更多樣化的研究來確定和驗證。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。