HPLC 法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地新疆鼠李枝中3種黃酮類成分的含量

葉斯木·塔拉甫別克 葉力夏提·達(dá)那別克 郭君婷 趙婷婷 劉桂花

摘要［目的］建立同時(shí)測(cè)定新疆鼠李枝中槲皮素、山奈酚、芹菜素的HPLC法，同時(shí)優(yōu)化新疆鼠李枝提取工藝并測(cè)定其含量。［方法］采用Agilent XDB-C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.4%磷酸（B）為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫（0～15 min，65%～55%B；15～35 min，55%～55%B；35～60 min，55%～40%B；60～70 min，40%～20%B；70～80 min，20%～65%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，流速1 mL/min；柱溫30 ℃。［結(jié)果］槲皮素、山奈酚、芹菜素分別在6.89～110.20、6.81～108.90、5.40～108.10 μg/mL線性關(guān)系良好（r≥0.999 6）。新疆鼠李枝中上述3種成分的平均回收率分別為100.00%、99.01%和100.43%，RSD分別為1.26%、1.76%、0.97%。［結(jié)論］該方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，為新疆鼠李樹(shù)枝提取物的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制標(biāo)準(zhǔn)提供了重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞新疆鼠李；高效液相色譜法；槲皮素；山奈酚；芹菜素；含量測(cè)定

中圖分類號(hào)R 284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2023）24-0183-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.24.041

Simultaneous Determination of Three Flavonoids in the Branches of Rhamnus songorica from Different Regions of Xinjiang by HPLC

Yesem·Talpbek，Yelxat·Danabek， GUO Junting et al

（Xinjiang Medicine Research Institute， Urumqi，Xinjiang 830004）

Abstract［Objective］ To establish an HPLC method for the simultaneous determination of quercetin， kaempferol and apigenin in Rhamnus songorica branches， and to optimize the extraction process of Rhamnus songorica branches and determine their content.［Method］The HPLC analysis was carried out on Agilent XDBC18 column （ 4.6 mm×250 mm，5 μm） with methanol（A） -0.4% phosphoric acid （B） gradient elution （0-15 min，65%-55%B;15-35 min，55%-55%B;35-60 min，55%-40%B;60-70 min，40%-20%B;70-80 min，20%-65%B）;ataflow rate of 1 mL/min.The detection wavelength was 360 nm and the column temperature was 30 ℃.［Result］Good linear relationship were found in the the range of 6.89-110.20 μg/mL for quercetin，6.81-108.90 μg/mL for kaempferol，and 5.40-108.10 μg/mL for apigeni （r≥0.999 6）.The average recovery rates of the above three components in the branches of Rhamnus songorica were 100.00%， 99.01% and 100.43%， respectively， with RSDs of 1.26%， 1.76% and 0.97%.［Conclusion］This method is accurate， reliable， and has good repeatability， providing an important basis for the quality evaluation and control standards of Rhamnus songorica branch extract.

Key wordsRhamnus songorica;HPLC;Quercetin;Kaempferol;Apigeni;Content determination

新疆鼠李（Rhamnus songorica Gontsch.）為鼠李科鼠李屬灌木，分布于俄羅斯、西伯利亞西南部、中亞地區(qū)，在我國(guó)只有新疆北部地區(qū)有分布，為哈薩克醫(yī)長(zhǎng)期應(yīng)用的民間藥材［1-10］，以枝、葉和果實(shí)入藥，其果實(shí)由秋季果實(shí)成熟后經(jīng)過(guò)采收、洗凈、去除雜質(zhì)陰干而成。本品性味苦澀、性涼，具有清熱解毒、疏肝保肝、活血化瘀等功效，在民間新疆鼠李也被稱為土茶葉，在新疆北疆地區(qū)牧民至今仍有將其葉或樹(shù)枝切片陰干保存且用于在肉食后代替茶飲用的習(xí)慣。

新疆鼠李在哈薩克民間被稱為包爾胡特（意指肝包蟲(chóng)），常用于治療脂肪肝、肝包蟲(chóng)、高血脂、高血壓等疾病。研究表明，鼠李屬植物成分主要有黃酮、萘酚和苷類化合物［11-14］，具有抗菌消炎、抗氧化、抗過(guò)敏、抗腫瘤、抗血栓、抗高血壓、保肝護(hù)肝等藥理活性［15-20］，目前對(duì)新疆鼠李的研究?jī)H停留在藥理作用方面，化學(xué)成分研究較少，高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定新疆鼠李枝中槲皮素、山奈酚、芹菜素的含量鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。為有效控制新疆鼠李的質(zhì)量，該研究采用單因素試驗(yàn)方法，優(yōu)化了新疆鼠李枝提取工藝，并建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定新疆鼠李枝中槲皮素、山奈酚、芹菜素3種成分的含量，以期為新疆鼠李枝的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供重要依據(jù)。

1儀器與材料

安捷倫1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司KQ-500VDV）；CPA225D型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司，精度0.01）；WP-UPT-10型實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)（四川沃特爾設(shè)備有限公司）；Wi80127型中藥粉碎機(jī)（北京東西儀科技有限公司）；DZTW型點(diǎn)熱套（山東省鄄城永興儀器廠）；SY-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

槲皮素（ 中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100081-201408，純度99.1%）；山奈酚（ 中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)P1622，純度93.2% ） ；芹菜素（ 中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111514-201605，純度99.5% ）；新疆鼠李枝采摘于新疆伊犁地區(qū)（批號(hào)20160805、20180805、20180810）。色譜純甲醇（美國(guó)Fisher公司）；純化水（自制）；其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.13種黃酮類化學(xué)成分的含量測(cè)定

2.1.1色譜條件。色譜柱為Agilent XDB-C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脫：0～15 min，65%～55%B；15～35 min，55%～55%B；35～60 min，55%～40%B；60～70 min，40%～20%B；70～80 min，20%～65%B；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

按以上色譜條件進(jìn)樣分析的HPLC色譜圖，如圖1所示。結(jié)果表明，在該色譜條件下，槲皮素、山奈酚、芹菜素分離度均良好，無(wú)其他成分干擾。

2.1.2供試品溶液的制備。稱取新疆鼠李枝粉末（過(guò)80目篩），約0.5 g，加50 mL 70%的乙醇，稱定重量，加熱回流60 min，冷卻至室溫，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3混合對(duì)照品溶液的制備。精密稱取槲皮素、山奈酚和芹菜素對(duì)照品適量于容量瓶中，甲醇溶解定容，制成各含槲皮素551.0 μg/mL、山奈酚544.3 μg/mL和芹菜素540.3 μg/mL 的貯備液，備用。分別精密移取上述貯備液1 mL 置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成含槲皮素55.10 μg/mL、山奈酚54.43 μg/mL、芹菜素54.03 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.1.4線性關(guān)系考察。精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下的槲皮素和山奈酚貯備液 5 mL置10 mL容量瓶?jī)?nèi)，加甲醇至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為 275.5和272.2 μg/mL的稀釋液。再精密吸取稀釋液 0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL分別置 10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度（x，μg/mL）對(duì)其峰面積（ y）進(jìn)行線性回歸，得出回歸方程。分別精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下的芹菜素貯備液0.1、0.4、0.8、1.6、2.0? mL，分別置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列對(duì)照品溶液。精密吸取各對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，同前法得回歸方程。3種化學(xué)成分的回歸方程及線性范圍見(jiàn)表1。

2.1.5精密度試驗(yàn)。取“2.1.3”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.1.1”色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，并計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山奈酚、芹菜素峰面積的RSD分別為0.50%、0.33%、0.65%，表明精密度良好。

2.1.6重復(fù)性試驗(yàn)。取新疆鼠李枝（批號(hào)20160805），按 “2.1.2”方法平行制備6份供試品溶液。按 “2.1.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山奈酚、芹菜素在新疆鼠李枝中的含量平均值分別為1.636 0、0.105 6、0.118 9 mg/g；RSD分別為1.74%、1.32%、0.83%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取新疆鼠李枝（批號(hào)20160805） 供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件分別在 4、8、12、16 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山奈酚、芹菜素峰面積的RSD分別為0.82%、0.48%、0.51%，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8加樣回收率試驗(yàn)。稱取已知含量的新疆鼠李枝（批號(hào)20160805）6份（每份約0.25 g），精密稱定，加入槲皮素、山奈酚、芹菜素分別為0.308 5、0.194 0、0.248 0 mg的混合對(duì)照品溶液，于10 mL容量瓶中定容。各樣品均經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，按“2.1.1”色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率及RSD。結(jié)果表明（表2），槲皮素、山奈酚、芹菜素的平均回收率分別為100.00% 、99.01%、100.43%，RSD分別為1.26%、1.76%、0.97%。

2.2新疆鼠李枝提取工藝優(yōu)選

2.2.1提取溶劑的考察。稱取新疆鼠李枝（批號(hào)20160805）約0.5 g，分別用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、甲醇進(jìn)行提取，溶劑量為50 mL，加熱回流30 min，冷卻至室溫，再稱定重量，用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，注入高效液相色譜儀測(cè)定，計(jì)算槲皮素、山奈酚和芹菜素的含量。結(jié)果表明（圖2），槲皮素、山奈酚、芹菜素在70%乙醇作為提取溶劑時(shí)峰面積最大。故選擇70%乙醇作為提取溶劑并進(jìn)一步考察不同溶劑倍數(shù)的提取率。

2.2.2溶劑體積的考察。稱取新疆鼠李枝（批號(hào)20160805）約0.5 g，用70%乙醇作為溶劑，提取體積分別為30、40、50、60、70 mL，加熱回流30 min冷卻至室溫，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，注入高效液相色譜儀測(cè)定，計(jì)算槲皮素、山奈酚和芹菜素的含量。結(jié)果表明（圖3），槲皮素、山奈酚、芹菜素在50 mL 70%乙醇中提取率最高。故選50 mL 70%乙醇作為提取溶劑，進(jìn)一步考察提取時(shí)間對(duì)提取率的影響。

2.2.3提取時(shí)間的考察。稱取新疆鼠李枝（批號(hào)20160805）約0.5 g，用50 mL 70%乙醇分別加熱回流30、60、90 min，冷卻至室溫，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，注入高效液相色譜儀測(cè)定，計(jì)算槲皮素、山奈酚和芹菜素的含量。結(jié)果表明（圖4），槲皮素、山奈酚、芹菜素在提取時(shí)間60 min時(shí)最高。故選擇60 min為提取時(shí)間。最終確定新疆鼠李枝提取工藝為稱取鼠李枝約0.5 g，加70%乙醇50 mL加熱回流60 min。

2.3樣品測(cè)定取3個(gè)批次新疆鼠李枝，按“2.1.2”方法制備供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，分別計(jì)算新疆鼠李枝中槲皮素、山奈酚、芹菜素的含量，結(jié)果如表3所示。

3討論

該試驗(yàn)首次建立HPLC法同時(shí)檢測(cè)新疆鼠李枝中槲皮素、山奈酚、芹菜素的含量，通過(guò)新疆鼠李枝提取工藝單因素考察得知，最佳提取工藝條件為50 mL 70％乙醇加熱回流60 min。筆者在試驗(yàn)中分別采用水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、95%乙醇和甲醇6種溶劑，提取容積量分別30、40、50、60、70 mL對(duì)樣品進(jìn)行回流提取30、60、90 min并進(jìn)行考察，結(jié)果表明，采用70％乙醇為提取溶劑，溶劑倍量50 mL，加熱回流60 min時(shí)，提取率最高，色譜峰面積最大，因此該試驗(yàn)最終選擇以50 mL 70%乙醇為提取溶劑，加熱回流60 min。

查閱文獻(xiàn)得知，槲皮素的流動(dòng)相為甲醇-4 mL/L磷酸溶液（35∶65），檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，流速 1 mL/min，柱溫30 ℃［9］；但這個(gè)色譜條件對(duì)新疆鼠李枝同時(shí)測(cè)定3種黃酮類成分時(shí)效果不理想，最后摸索的最佳色譜條件為甲醇（A） -0.4%磷酸（B）進(jìn)行梯度洗脫： 0～15 min，65%～55%B；15～35 min，55%～55%B；35～60 min，55%～40%B；60～70 min，40%～20%B；70～80 min，20%～65%B；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，流速1 mL/min；柱溫30 ℃；結(jié)果表明，以甲醇-0.4％磷酸為流動(dòng)相時(shí)基線平穩(wěn)，色譜峰峰形好、分離度大，保留時(shí)間合適，故最終確定流動(dòng)相為甲醇-0.4％磷酸， 并以該方法對(duì)產(chǎn)于新疆伊犁地區(qū)伊寧縣、新源縣采集的野生新疆鼠李枝中以上3種成分的含量進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明不同地區(qū)及不同采集時(shí)間以上3種成分差異不大。

新疆鼠李在民間至今仍有入藥及當(dāng)茶飲用的習(xí)慣，實(shí)地考察時(shí)注意到雖有農(nóng)牧民在庭院少量移栽試種，但多數(shù)仍依靠野生資源，近年來(lái)厲彥翔等［5-10］對(duì)該植物藥理作用方面的研究結(jié)果表明，對(duì)大鼠酒精性脂肪肝及高脂血癥模型用藥時(shí)有顯著的療效，符合民間藥用情況及功能主治。

綜上所述，該方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可用于鼠李屬枝化學(xué)成分含量的測(cè)定。目前對(duì)于新疆鼠李化學(xué)成分、藥理活性等方面的研究仍然不夠深入，該植物藥用歷史悠久、藥效確切，是理想的藥用及新藥開(kāi)發(fā)資源，有必要對(duì)其進(jìn)行深入研究并合理開(kāi)發(fā)利用。

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