紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在天然橡膠塞和PVC管載體中的釋放規(guī)律及田間驗(yàn)證

丁浩毅, 黃 俊, 張 娟, 李曉維, 張大羽, 呂要斌1,,*

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院, 杭州 311300; 2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所,農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和浙江省植保生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310021;3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園林植物與花卉研究所, 杭州 311122)

紅火蟻Solenopsisinvicta是隸屬膜翅目(Hymenoptera)蟻科(Formicidae)火蟻屬Solenopsis的一種典型的農(nóng)林業(yè)害蟲,原產(chǎn)于南美洲(Lofgrenetal., 1975)。自2004年在中國廣東省吳川市發(fā)現(xiàn)紅火蟻入侵以來,目前已在我國12個(gè)省區(qū)市的534個(gè)縣(市、區(qū))都有發(fā)生,較2001年疫情發(fā)生縣級(jí)行政區(qū)增加128個(gè)。紅火蟻不僅取食作物造成減產(chǎn),還叮咬甚至殺死家畜(Leietal., 2021),也會(huì)在電路設(shè)施中筑巢并破壞電力設(shè)施(Vander Meeretal., 2008);紅火蟻還會(huì)通過蜇咬引起人的過敏反應(yīng)甚至休克、死亡(Vargo and Hulsey, 2000),破壞入侵地生態(tài)系統(tǒng),減少其他生物種群數(shù)量(Valles and Porter, 2013; 陸永躍等, 2019)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1紅火蟻告警信息素:紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪由作者所在實(shí)驗(yàn)室根據(jù)Wolff-Kishner-黃鳴龍還原法合成(王麗坤等, 2021),純度≥97%。

1.1.2緩釋載體:選擇兩種目前在實(shí)際生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的誘芯載體。一種是綠色NRP(北京中捷四方生物科技股份有限公司生產(chǎn)),長度為1.5 cm,直徑為1.0 cm;另一種為PVCP(楊凌翔林農(nóng)業(yè)生物科技有限公司生產(chǎn)),為一端開口另一端封口設(shè)計(jì),主要材質(zhì)為聚氯乙烯,長度為8.0 cm,外徑為1.2 mm,壁厚度為0.25 mm。誘芯載體在使用前,采用正己烷浸泡24 h,于75 ℃烘箱中烘干2 h,待其中的正己烷揮發(fā)完全后,將誘芯載體分裝到玻璃瓶中密封備用。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

利用乙腈將2-乙基-3,6-二甲基吡嗪稀釋為10, 50和100 ng/μL 3種濃度的溶液,分別取3種濃度的溶液各1 μL注射到氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS, Agilent 7890B-5977B)中,測定總離子流圖中2-乙基-3,6-二甲基吡嗪的峰面積,并制定其劑量與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

GC-MS工作條件:色譜柱HP-5MS,長30 m×內(nèi)徑250 μm×膜厚0.25 μm;無分流進(jìn)樣;程序升溫:初始溫度40 ℃,以10 ℃/min升到80 ℃后保留1 min,以10 ℃/min升到120 ℃后保留1 min,以10 ℃/min升到150 ℃后保留1 min,以10 ℃/min升到200 ℃后保留2 min,以10 ℃/min升到250 ℃后保留2 min;進(jìn)樣口溫度為200 ℃;載氣為He(>99.999%);離子源EI,離子源溫度230 ℃;四級(jí)桿溫度150 ℃;電子能量70 eV;掃描質(zhì)量范圍50～450 amu。

1.3 紅火蟻告警信息素在不同載體中的釋放量測定

應(yīng)用頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatogram-mass spectrometry, GC-MS)技術(shù)測定2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在兩種緩釋載體NRP和PVCP中的釋放規(guī)律。用乙腈將2-乙基-3,6-二甲基吡嗪分別稀釋成10 000, 1 000和100 ng/μL的溶液,取10 μL分別單獨(dú)加入兩種緩釋載體中,在溫度(25±1) ℃、相對濕度60%±5%的室內(nèi)環(huán)境中分別萃取15, 30和60 min,之后測定SPME萃取頭(100 μm,Polydimethylsiloxane Coating,Supelco公司)萃取2-乙基-3,6-二甲基吡嗪的釋放量。萃取前先將SPME探針插入到氣相色譜儀的進(jìn)樣口中(孫潔雯等, 2015),在200 ℃條件下老化1 h,以去除萃取頭上殘留的雜質(zhì)。萃取時(shí),首先將加樣后的載體放入40 mL的棕色樣品瓶中,蓋上蓋子并旋緊密封,隨后將SPME探針針管刺穿樣品瓶蓋上的膠墊進(jìn)入到棕色樣品瓶中以吸附載體釋放的紅火蟻告警信息素。每個(gè)濃度和每個(gè)萃取時(shí)間的2種載體均設(shè)3次重復(fù)。之后,將SPME探針針管插入氣象色譜儀的進(jìn)樣口,推動(dòng)手柄桿,伸出探針萃取頭,熱脫附分析物5 min,使其進(jìn)入色譜柱。通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對載體釋放后SPME萃取頭上吸附的紅火蟻告警信息素的量進(jìn)行測定。基于GC-MS得到的峰面積圖進(jìn)行自動(dòng)積分,得到對應(yīng)的色譜峰面積數(shù)值。根據(jù)1.2節(jié)中繪制的紅火蟻告警信息素劑量與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線,由峰面積計(jì)算出2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在不同劑量、不同萃取時(shí)間下在NRP和PVCP兩種載體中的實(shí)際釋放量。

1.4 紅火蟻告警信息素在不同載體中的釋放速率

根據(jù)1.3節(jié)中計(jì)算得出的紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在不同劑量、不同萃取時(shí)間下NRP和PVCP兩種載體中的實(shí)際釋放量(ng),計(jì)算得到2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP和PVCP兩種載體中的釋放速率(ng/h)。

1.5 田間驗(yàn)證

根據(jù)1.4節(jié)中測定的2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP和PVCP中的釋放速率,選取相應(yīng)濃度的2-乙基-3,6-二甲基吡嗪各10 μL分別溶于兩種載體,將載體粘于紅火蟻誘集器底部,配合紅火蟻監(jiān)測誘餌使用。

進(jìn)行田間試驗(yàn)時(shí),選取特定蟻巢,將組合好的紅火蟻誘集器等間距放置于距離紅火蟻蟻巢中心1 m處,每個(gè)蟻巢放8套紅火蟻誘集器,分別放置于蟻巢的8個(gè)方位,以避免風(fēng)向?qū)φT集效果的影響。誘集器放置時(shí),帶藥的誘集器和空白對照間隔放置。同一蟻巢的試驗(yàn)進(jìn)行15 min,15 min后將誘集器收回,統(tǒng)計(jì)誘集器上的誘集到的紅火蟻數(shù)量。同一蟻巢的不同濃度的試驗(yàn)間隔2 h,以排除頻繁驚擾對紅火蟻警覺性和活性的影響。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用DPS 9.01軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用Origin 2022b軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖繪制。紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP和PVCP這兩種載體中的釋放速率對比采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)中的二因素有重復(fù)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析,Tukey氏多重比較進(jìn)行差異顯著性分析。2-乙基-3,6-二甲基吡嗪田間誘集效果對比采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在不同載體中的釋放量

隨著萃取時(shí)間的延長,NRP載體中相同劑量紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪的釋放量也隨之升高。在中劑量(10 000 ng)下萃取15和30 min、萃取15和60 min間的釋放量,在高劑量(100 000 ng)下萃取15和60 min、萃取30和60 min間的釋放量表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)(表1)。

表1 紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在天然橡膠塞(NRP)載體中的釋放量

隨著萃取時(shí)間的延長,PVCP載體中相同劑量2-乙基-3,6-二甲基吡嗪的釋放量也隨之升高。無論是在低劑量(1 000 ng)、中劑量(10 000 ng)還是高劑量(100 000 ng),不同萃取時(shí)間下的釋放量之間均表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)(表2)。

表2 紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在PVC管(PVCP)載體中的釋放量

2.2 紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP載體中的釋放動(dòng)態(tài)和規(guī)律

萃取時(shí)間(F=87.075,df=4,P=0.0001)和劑量(F=490.098,df=4,P=0.0001)均對紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪的釋放速率有極顯著影響(圖1)。相同萃取時(shí)間下, 隨著劑量的升高, 2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP載體中的釋放速率也隨之升高。而在相同劑量下,隨著萃取時(shí)間的上升,2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP載體中的釋放速率逐漸下降。釋放速率在15 min時(shí)達(dá)到最大值。

圖1 紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在天然橡膠塞(NRP)載體中的釋放速率

2.3 紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在PVCP載體中的釋放動(dòng)態(tài)和規(guī)律

PVCP中紅火蟻告警信息素劑量2-乙基-3,6-二甲基吡嗪對其釋放速率有極顯著影響(F=17.383,df=4,P=0.0001),而萃取時(shí)間對其釋放速率沒有顯著影響(F=0.359,df=4,P=0.7016)(圖2)。相同萃取時(shí)間下,隨著劑量的升高,紅火蟻告警信息素在PVCP的釋放速率也隨之升高,表現(xiàn)出與在NRP載體中相同的釋放規(guī)律。相同劑量下,在低劑量(1 000 ng)下,隨著萃取時(shí)間的上升,紅火蟻告警信息素在PVCP載體中的釋放速率逐漸下降。而相同劑量,在中劑量(10 000 ng)和高劑量(100 000 ng)下,隨著萃取時(shí)間的上升,2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在PVCP中的釋放速率也逐漸上升,在萃取時(shí)間為60 min時(shí),釋放速率達(dá)到最大值。

圖2 紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在PVC管(PVCP)載體中的釋放速率

2.4 紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪田間誘集效果

在NRP載體中,與同一劑量空白對照組相比,1 000 ng告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪誘集的紅火蟻數(shù)量極顯著增多(P<0.01),而隨著劑量的升高,2-乙基-3,6-二甲基吡嗪誘集的紅火蟻數(shù)量極顯著減少(P<0.01),表現(xiàn)出極顯著的驅(qū)避作用,濃度越高,驅(qū)避作用越顯著。各劑量空白對照組間誘集的紅火蟻數(shù)量無顯著差異(P>0.05),但隨著劑量的升高,處理組誘集到的紅火蟻數(shù)量總體呈極顯著下降的趨勢(P<0.01)(圖3)。

圖3 紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在田間天然橡膠塞(NRP)載體中誘集到的紅火蟻數(shù)量

在PVCP載體中,與同劑量空白對照組相比,1 000 ng 2-乙基-3,6-二甲基吡嗪誘集到的紅火蟻數(shù)量差異不顯著(P>0.05);在10 000 ng劑量下,2-乙基-3,6-二甲基吡嗪誘集到的紅火蟻數(shù)量顯著增多(P<0.05);隨著劑量進(jìn)一步升高,100 000 ng 2-乙基-3,6-二甲基吡嗪誘集到的紅火蟻數(shù)量顯著減少(P<0.05),表現(xiàn)出顯著的驅(qū)避作用,而1 000 000 ng 2-乙基-3,6-二甲基吡嗪誘集到的紅火蟻數(shù)量極顯著減少(P<0.01),表現(xiàn)出極顯著的驅(qū)避作用;各劑量空白對照組間誘集的紅火蟻數(shù)無顯著差異(P>0.05),隨著劑量的升高,處理組誘集到的紅火蟻數(shù)量從10 000 ng劑量開始呈極顯著下降(P<0.01)(圖4)。

圖4 紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在田間PVC管(PVCP)載體中誘集到的紅火蟻數(shù)量

結(jié)合圖3和圖4的結(jié)果,2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP載體中1 000 ng劑量下和在PVCP載體中10 000 ng劑量下對紅火蟻有顯著的誘集效果,這兩個(gè)劑量與2.3和2.4節(jié)中2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在兩種載體中15 min時(shí)的釋放速率對應(yīng)后可知,兩者的釋放速率相近,均為25 ng/h左右,進(jìn)一步印證了上述結(jié)果,即釋放速率為25 ng/h的2-乙基-3,6-二甲基吡嗪對紅火蟻的野外誘集有顯著的增強(qiáng)作用。

3 討論

本研究結(jié)果表明,在室內(nèi)溫濕度條件下,紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP載體中和在PVCP載體中釋放規(guī)律總體呈現(xiàn)出相反的趨勢。2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP載體中的釋放速率隨時(shí)間增長逐漸變慢(圖1),在PVCP載體中的釋放速率隨時(shí)間增長逐漸變快(圖2)。從整體上看,在所測定的3個(gè)劑量和3個(gè)萃取時(shí)間下,2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP載體中的釋放速率明顯快于在PVCP載體中的釋放速率。我們分析這可能有兩方面的原因:一是化合物本身的分子量和結(jié)構(gòu)會(huì)影響其在不同載體中的釋放,二是NRP和PVCP這兩種載體本身的結(jié)構(gòu)差異(朱誠棋等, 2017),導(dǎo)致載體與紅火蟻告警信息素之間互作產(chǎn)生的效果不同,進(jìn)而產(chǎn)生了釋放速率的差異。我們認(rèn)為后者是主要原因。

紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP載體中,1 000 ng劑量下3個(gè)萃取時(shí)間的萃取量之間均無顯著差異, 10 000 ng劑量下萃取30和60 min的釋放量之間無顯著差異(表1)。我們認(rèn)為是NRP載體與空氣接觸面積較大,導(dǎo)致告警信息素在萃取初期便快速釋放,在快速釋放后,由于此時(shí)載體內(nèi)告警信息素的劑量顯著下降,后期釋放量也就顯著降低。在數(shù)據(jù)上體現(xiàn)為1 000 ng 2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP載體中萃取15 min時(shí)即達(dá)到釋放極限,10 000 ng 2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP載體中萃取30 min時(shí)即達(dá)到釋放極限。達(dá)到釋放極限后,告警信息素在NRP載體中的釋放量便不再有顯著增加。

在類似的研究中,有將西花薊馬聚集信息素溶于NRP和PVCP兩種載體中(李曉維等, 2017; 孫冉冉等, 2020),證實(shí)西花薊馬聚集信息素在NRP載體中的釋放速率明顯快于在PVCP載體中的釋放速率,這與本研究的結(jié)果一致。不同的是,西花薊馬聚集信息素在這兩種載體中的釋放速率整體均是隨時(shí)間增長逐漸變慢,而在本研究中,紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪在NRP載體中的釋放速率隨時(shí)間增長逐漸變慢(圖1),在PVCP載體中的釋放速率隨時(shí)間增長逐漸變快(圖2)。另有研究選取共軛二烯性信息素為材料(劉奎偉等, 2012),探究該種信息素在復(fù)合橡膠和聚乙烯管中的釋放規(guī)律,證實(shí)共軛二烯性信息素在復(fù)合橡膠中的釋放速率隨時(shí)間增長逐漸變慢,在聚乙烯管中的釋放速率隨時(shí)間增長逐漸變快,這與本研究中紅火蟻告警信息素在兩種載體中的釋放規(guī)律相吻合。

關(guān)于田間應(yīng)用紅火蟻告警信息素進(jìn)行紅火蟻監(jiān)測和防治,在此之前尚無相關(guān)研究。我們在室內(nèi)進(jìn)行的相關(guān)研究證實(shí),一定量的紅火蟻告警信息素2-乙基-3,6-二甲基吡嗪對紅火蟻有顯著的引誘作用。本研究證實(shí)了1 000 ng 2-乙基-3,6-二甲基吡嗪配合NRP載體使用或10 000 ng 2-乙基-3,6-二甲基吡嗪配合PVCP載體使用均可很好地滿足田間快速監(jiān)測紅火蟻的需要。在紅火蟻告警信息素的實(shí)際應(yīng)用過程中,僅僅依靠紅火蟻告警信息素和緩釋載體這兩者還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。為此,我們需要結(jié)合現(xiàn)有成果將紅火蟻告警信息素和緩釋載體配合紅火蟻專用誘集器(張莉麗等, 2020)和專用監(jiān)測誘餌(陳利民等, 2019)一起使用,這樣才能對紅火蟻的監(jiān)測工作起到一定的增效作用。而紅火蟻專用監(jiān)測誘餌在使用的過程中,誘餌的氣味(劉曉彤等, 2022)隨水分蒸發(fā)逐漸下降。因此在配合紅火蟻告警信息素和紅火蟻專用監(jiān)測誘餌使用的基礎(chǔ)上,結(jié)合NRP和PVCP兩種載體的特性,我們認(rèn)為NRP載體適合進(jìn)行紅火蟻的快速監(jiān)測(Ujiyama and Tsuji, 2018),而PVCP載體適合進(jìn)行紅火蟻的長期監(jiān)測(Chenetal., 2019; Byeonetal., 2020)。因?yàn)樵趯⒈O(jiān)測誘餌和紅火蟻信息素投放使用的前期,配合NRP載體使用時(shí),監(jiān)測誘餌的氣味和紅火蟻告警信息素的釋放速率都較高,能夠?qū)t火蟻產(chǎn)生極強(qiáng)的吸引作用。而隨著時(shí)間的推移,監(jiān)測誘餌的氣味釋放速率下降,此時(shí)如用PVCP作為緩釋載體,可以達(dá)到前期利用誘餌氣味和少量紅火蟻告警信息素吸引紅火蟻,后期利用紅火蟻告警信息素吸引更多紅火蟻的效果。在后續(xù)的實(shí)際應(yīng)用過程中,我們可以期望將紅火蟻告警信息素加載在PVCP載體中,并配合紅火蟻專用監(jiān)測器和專用監(jiān)測誘餌使用,同時(shí)發(fā)揮粘蟲板的優(yōu)勢,達(dá)到精準(zhǔn)監(jiān)測紅火蟻的效果,這也是對紅火蟻進(jìn)行精準(zhǔn)和有效防治的基礎(chǔ)。