Bmttv在家蠶翅發(fā)育過程中的功能分析

梁 燕, 李靜雯, 陳胤霖, 賈文怡, 夏慶友, 化曉婷

(西南大學前沿交叉學科研究院生物學研究中心, 重慶 400715)

翅不僅僅是昆蟲飛行的重要武器,更是昆蟲適應環(huán)境、繁殖生存的一大利器。昆蟲可以通過翅警示和躲避天敵。在進化生物學、生態(tài)學和生理學等多個領域,昆蟲翅的研究都有著重要意義(Zera and Denno, 1997; McCullochetal., 2010)。家蠶Bombyxmori作為一種重要的經(jīng)濟昆蟲,同時也是一種模式昆蟲,完善的基因組信息和成熟的基因編輯平臺為家蠶基因功能研究提供了良好的基礎和平臺(Xiaetal., 2004)。研究人員針對家蠶雛翅突變體進行了深入研究,發(fā)現(xiàn)其翅的短小是BombyxmoriApproximated(Bmapp)的啟動子突變所導致(Wangetal., 2013);2022年,有研究團隊鑒定并報道了Bombyxmorimacropterous(Bmmp)在家蠶翅發(fā)育過程中的功能(Zouetal., 2022)。

近年來,CRISPR/Cas9基因編輯技術(Maetal., 2014)的迅猛發(fā)展,使得通過敲除相關基因確定其表型再進一步探究其功能得以實現(xiàn)?；诖思夹g,在2020年,研究人員鑒定并獲得了BmBlos2油蠶突變體,為解析油蠶的產(chǎn)生機制提供了模型(Yuetal., 2020)。1998年,ttv首次在果蠅Drosophila中被鑒定并發(fā)現(xiàn)其缺失會導致果蠅翅的缺陷(Bellaicheetal., 1998)。ttv作為糖基轉移酶編碼基因,屬于EXT基因家族,是人類EXT1的同源基因,參與合成體內硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS),進而合成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans, HSPGs) (Takeietal., 2004)。HSPG是一種蛋白聚糖,由一個核心蛋白和與核心蛋白相連的HS粘多糖鏈組成(Linetal., 2004),可作為信號傳播的共同受體促進信號傳播,從而發(fā)揮調節(jié)細胞增殖、遷移和粘附的功能或者可以阻斷配體與其受體結合,防止其接觸同源受體以減少信號傳播(Linetal., 2004; Xie and Li, 2019)。通過NCBI序列比對,在家蠶中也找到與之對應的3個基因ttv(GenBank登錄號: BMSK0002707),botv(GenBank登錄號: BMSK0008707)和sotv(GenBank登錄號: BMSK0013095)。那么,在家蠶中,ttv是否具有與果蠅類似的功能參與家蠶翅發(fā)育目前仍是未知的。

本研究鑒定了家蠶Bmttv的CDS完整序列,進一步分析了蛋白結構域、同源序列比對、系統(tǒng)進化分析以及時空組織表達譜和亞細胞定位,研究結果不僅可為Bmttv的深入研究奠定基礎,也為在家蠶中解析其翅發(fā)育功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試家蠶品種為D9L,所采用的家蠶胚胎細胞系BmE,用到的1180-Basic質粒均來自并保存于西南大學前沿交叉學科研究院生物學研究中心。使用新鮮的適齡葉飼養(yǎng)家蠶,保證蠶室的干凈衛(wèi)生,通風流暢,溫度27 ℃。BmE 細胞所需培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的Grace培養(yǎng)基,培養(yǎng)在27 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,每48 h更換一次培養(yǎng)基,每5 d進行一次傳代培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒購于美基生物,RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒均購于OMEGA,反轉試劑盒、定量試劑均購于TaKaRa,質粒提取試劑盒購于Qiagen,Trans-T1和JM110感受態(tài)、限制性核酸內切酶購于NEB,引物由華大基因有限公司合成,抗體購于碧云天。

1.3 Bmttv CDS序列的克隆與鑒定

通過NCBI數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載Bmttv序列,使用Primer 5設計BmttvCDS序列的引物Bmttv-CDS-F/Bmttv-CDS-R(表1),提取家蠶幼蟲頭部和中腸的基因組DNA,進行PCR擴增,PCR反應體系: DNA模板2 μL, PrimeSTAR Max Premix(2×) 25 μL, Bmttv-CDS-F/R引物各2 μL, RNase Free H2O 19 μL。反應程序: 98 ℃預變性30 s; 98 ℃變性10 s, 58 ℃退火20 s, 72 ℃延伸 30 s, 30個循環(huán); 72 ℃延伸 5 min, 12 ℃保存?；厥漳康钠尾⑦M行T克隆,選取陽性克隆送華大基因進行測序。同時,使用RACE試劑盒(TaKaRa公司)進一步檢測驗證Bmttv基因序列,詳細步驟參考試劑說明書。

表1 引物信息

1.4 生物信息學分析

BmTTV蛋白序列來自silk DB3.0數(shù)據(jù)庫,蛋白結構域預測網(wǎng)址是http:∥smart.embl-heidelberg.de/;黑腹果蠅D.melanogaster和智人Homosapiens的TTV同源基因CDS序列和蛋白序列均下載自NCBI數(shù)據(jù)庫,同源序列比對網(wǎng)址是https:∥espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi;為了進一步了解BmTTV的系統(tǒng)進化關系,分別從NCBI數(shù)據(jù)庫下載鱗翅目、雙翅目、膜翅目以及哺乳動物TTV氨基酸序列進行系統(tǒng)進化關系分析。

1.5 基因表達量的qRT-PCR檢測

為探究Bmttv在家蠶中的生物學功能,利用qRT-PCR分別檢測Bmttv在家蠶不同發(fā)育階段(5齡第1-7天幼蟲、游走期幼蟲、預蛹、1-9日齡蛹和1日齡成蟲)、家蠶5齡第3天幼蟲各組織(表皮、翅原基、精巢、氣管、馬氏管、絲腺、頭、血淋巴、脂肪體和中腸)中以及在不同發(fā)育階段翅原基中的表達量。上述樣品按時期取材,液氮速凍后,凍存于-80 ℃冰箱,利用RNA提取試劑盒進行RNA的提取,使用反轉錄試劑盒以及實時熒光定量試劑盒(TaKaRa)的說明書進行qRT-PCR實驗。每個實驗樣品均設置3個生物學重復,每個重復來自3頭家蠶幼蟲/3個細胞孔。以BmRPL3為內參基因。

1.6 細胞轉染

待家蠶BmE細胞狀態(tài)良好、密度達80%后進行鋪板,選取12孔細胞培養(yǎng)板,提前鋪入細胞爬片,取等量的細胞懸液加入細胞板中,輕微搖晃使細胞分布均勻,對照組使用的是1180-Basic質粒,實驗組是Bmttv的過表達載體質粒(Bmttv-1180-Flag),每組設置3個重復孔。根據(jù)羅氏轉染試劑說明書進行操作,待鋪板12 h后進行轉染,將質粒與轉染試劑按1∶3(v/v)比例混合,再加入無抗無血清的Grace培養(yǎng)基;靜置孵育15 min后,加入細胞中;轉染6～8 h后更換為有抗生素(青霉素和鏈霉素)有血清的完全Grace培養(yǎng)基,轉染48 h后進行免疫熒光實驗。

1.7 免疫熒光亞細胞定位

將轉染后的BmE細胞板里的培養(yǎng)基棄去,加入適量的4%多聚甲醛室溫固定15 min,加入1×PBS置于搖床上漂洗3次,每次5 min;0.3% Triton X-100處理30 min,1×PBS漂洗3次,每次5 min;3% BSA室溫封閉1 h,1×PBS漂洗3次,每次5 min;Flag抗體按1∶200(v/v)稀釋,室溫孵育2 h或4 ℃過夜孵育,1×PBS漂洗3次,每次10 min;Alexa Fluor 594標記的山羊抗兔IgG(Goat Anti-Rabbit IgG,Jackson ImmunoResearch)按1∶2 000(v/v)稀釋,室溫孵育1 h;使用DAPI染色(1∶10 000稀釋),室溫孵育30 min,最后將爬片取出倒扣于有適量抗熒光猝滅劑的載玻片上,使用指甲油封片,通過熒光顯微鏡進行觀察拍照。為了進一步探究Bmttv的過表達是否會影響翅發(fā)育關鍵基因,通過NCBI數(shù)據(jù)庫下載Bmttv,Bmwg,BmHippo,BmDpp,BmHh和Bmsotv序列,使用Primer 3(https:∥primer3.ut.ee/)在線網(wǎng)址設計其定量引物,通過實驗檢測后選擇溶解曲線單一的引物進行qRT-PCR實驗(表1),提取BmE細胞RNA,反轉錄合成cDNA,qRT-PCR檢測上述基因的表達量,方法同1.5節(jié)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

qRT-PCR的數(shù)據(jù)分析均采用2-ΔCt方法計算各個基因的相對表達量(Livak and Schmittgen, 2001),并使用雙尾t檢驗進行統(tǒng)計分析,使用GraphPad Prism8.0軟件繪圖。

2 結果

2.1 Bmttv CDS的克隆與序列

silk DB3.0數(shù)據(jù)庫中顯示Bmttv位于家蠶5號染色體,包含8個外顯子,7個內含子,編碼741個氨基酸。通過PCR實驗成功克隆到大小約為2 000 bp的序列,經(jīng)測序驗證,克隆的序列與silk DB3.0數(shù)據(jù)庫中提供的序列完全一致,并通過RACE實驗進一步確定了Bmttv的CDS全長序列,長2 228 bp。

蛋白結構域預測表明BmTTV包含兩個結構域:一個EXT蛋白家族特有的結構域exostosin位于第19-362位氨基酸,符合與智人EXT1是同源基因這一特征;一個具有糖基轉移酶活性的蛋白家族結構域-Glyco-transf-64位于第472-722位氨基酸,是硫酸肝素生物合成所必需的。同源序列比對分析結果顯示(圖1),家蠶、黑腹果蠅和智人TTV均包含以上兩個結構域,且家蠶與黑腹果蠅和智人TTV的氨基酸序列一致性均達45%,具有較高的保守性,暗示著它們可能具有相似的功能。

圖1 TTV氨基酸序列比對

2.2 Bmttv的系統(tǒng)進化

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖2)總體而言昆蟲與哺乳動物的TTV各聚為一枝。在昆蟲中家蠶BmTTV主要與亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis、菜粉蝶Pierisrapae等鱗翅目昆蟲TTV聚為一枝,以黑腹果蠅和岡比亞按蚊Anophelesgambiae為代表的雙翅目以及蜜蜂代表的膜翅目昆蟲TTV各自聚為一枝,暗示TTV在昆蟲中廣泛存在,保守性較高,且BmTTV與岡比亞按蚊和黑腹果蠅TTV的親緣關系較近。

圖2 基于氨基酸序列的家蠶BmTTV 和其他物種TTVs的系統(tǒng)進化樹

2.3 Bmttv的時空表達特征

qRT-PCR檢測結果顯示,Bmttv在家蠶5齡幼蟲期表達量較低,但從游走期直至成蟲期表達量整體呈現(xiàn)上升趨勢,且保持一個較高的表達水平,尤其在3日齡蛹出現(xiàn)一個峰值,隨后在羽化前期再次出現(xiàn)一個高表達峰值,這暗示著Bmttv可能主要在家蠶蛹期發(fā)揮著重要的作用(圖3: A)。為了進一步探究Bmttv在翅發(fā)育中的作用,進一步鑒定了其在家蠶翅原基發(fā)育過程中各個時期的表達情況(圖3: B),發(fā)現(xiàn)Bmttv在翅原基中的表達趨勢與在不同發(fā)育階段表達譜較為一致,在5齡幼蟲期表達量相對穩(wěn)定,從游走期表達量開始上調,而游走期是家蠶翅發(fā)育的關鍵時期,因此,推測Bmttv在游走期高量表達可能與家蠶翅的發(fā)育相關。Bmttv在5幼蟲中腸和精巢中表達量最高,在翅原基、馬氏管和頭中表達量次之,在絲腺表達量最低(圖3: C),暗示Bmttv可能在家蠶大部分組織中都發(fā)揮比較重要的生物學功能。

圖3 Bmttv在家蠶不同發(fā)育階段整蟲(A)和翅原基中(B)以及5齡幼蟲不同組織中(C)的相對表達量

2.4 BmTTV的亞細胞定位

通過瞬時轉染實驗在細胞水平過表達Bmttv,免疫熒光結果顯示BmTTV主要定位在BmE細胞質中(圖4)。

圖4 BmE細胞中BmTTV的亞細胞定位

2.5 BmE細胞中Bmttv過表達對翅發(fā)育關鍵基因表達量的影響

qRT-PCR檢測結果顯示,與過表達1180-Basic質粒對照組相比,過表達Bmttv后BmE細胞中Bmttv的表達量顯著上調(P<0.001)(圖5: A);Bmsotv(P<0.01)(圖5: B)和BmHippo(P<0.05)(圖5: C)的表達量顯著下調,而Bmwg(圖5: D),BmDpp(圖5: E)和BmHh(圖5: F)表達量無顯著變化(P>0.05),暗示在家蠶中Bmttv和Bmsotv也存在著一定的相互聯(lián)系,且Bmttv可能通過Hippo信號通路進而影響家蠶翅的發(fā)育。

圖5 BmE細胞中Bmttv過表達后家蠶翅發(fā)育關鍵基因的表達量

3 討論

果蠅ttv基因作為HSPG生物合成中關鍵的糖基轉移酶之一,在大多數(shù)物種中普遍存在。HSPG可作為多種細胞信號因子的共受體參與Hh, Wnt和Dpp信號通路的調控(Theetal., 1999; Busse-Wicheretal., 2014)。根據(jù)已有文獻的研究表明,果蠅中ttv的敲除會導致其成蟲期翅緣出現(xiàn)輕微損傷,部分翅脈出現(xiàn)雜亂無序的現(xiàn)象(Hanetal., 2004)。而在斑馬魚中ttv的缺失也會導致魚鰭受損(Leeetal., 2004)。然而,Bmttv在家蠶中是否具有相似的功能仍然未知。本研究時空組織表達譜顯示Bmttv在家蠶各個組織中普遍存在,在翅原基中表達量較高,且5齡幼蟲期穩(wěn)定低量表達,但發(fā)育至游走期表達量開始上升(圖3),這與家蠶翅原基在游走期發(fā)育加快一致,暗示Bmttv與家蠶翅原基的發(fā)育相關。此外Bmttv在中腸、頭部和精巢也高量表達(圖3),可能還存在一些隱藏著的生理功能,有待進一步的探索。

本研究通過對BmTTV蛋白序列進行分析,其蛋白結構域包含EXT蛋白家族和一個糖基轉移酶結構域,BmTTV與果蠅TTV氨基酸序列一致性達45%,說明該蛋白結構域序列具有一定的保守性。這暗示在家蠶中BmTTV極有可能存在著與果蠅TTV相似的功能,即作為關鍵的糖基轉移酶參與合成HS,進而影響HSPG的合成,介導細胞信號因子的傳遞,最終影響個體的生理功能,比如翅發(fā)育,目前該部分實驗仍在探索中。進化分析也表明ttv在鱗翅目昆蟲中廣泛存在,由此可推測若將ttv基因敲除,可能會影響這些害蟲的飛行能力,從而減少農產(chǎn)品的蟲害。

免疫熒光定位確定了BmTTV主要在細胞質中表達(圖4),這也跟果蠅中ttv編碼糖基轉移酶,在內質網(wǎng)中產(chǎn)生,存在于細胞質內的報道相一致。此外,我們在細胞水平過表達Bmttv,通過qRT-PCR檢測轉錄水平發(fā)現(xiàn),Bmttv的表達量顯著上調,而其同源基因Bmsotv表達量下調(圖5),表明二者存在一定的聯(lián)系,還有待進一步的探究。

本研究對部分已經(jīng)有報道影響翅發(fā)育的關鍵基因BmHippo,BmDpp,Bmwg和BmHh進行檢測,發(fā)現(xiàn)在Bmttv過表達的BmE細胞中,只有BmHippo是顯著下調的,其余基因均無明顯差異(圖5)。而在家蠶中,已有研究表明Hippo的表達異常會導致家蠶翅的嚴重皺縮(Yinetal., 2020)。因此,我們推測Bmttv可能通過影響Hippo信號通路參與家蠶翅的發(fā)育。以上研究結果是解析Bmttv在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中的功能的初步探究,為深入研究Bmttv在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中的功能解析奠定了基礎,不僅有助于了解昆蟲翅的發(fā)育過程,也將為害蟲的防治提供一定的理論基礎與指導意義。