家蠅酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建和MD14-3-3互作蛋白篩選

陳明明, 焦振龍, 趙文靜, 國 果,3,*

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽 550025; 2. 貴州醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心, 貴陽 550025;3. 貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽 550025)

家蠅Muscadomestica是一種重要的醫(yī)學(xué)媒介害蟲。家蠅隸屬于昆蟲綱(Insecta)雙翅目(Diptera)蠅科(Muscidae),主要棲居在養(yǎng)殖場、廁所、垃圾場以腐爛食物和植物的有機(jī)質(zhì)為食,攜帶革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌、真菌及寄生蟲等多種病原體(Khamesipouretal., 2018; Nayduchetal., 2023)。因此,家蠅不僅可傳播霍亂、痢疾、沙門傷寒等多種傳染性疾病的病原體,還是許多食物病原體交叉感染的重要媒介(李靜等, 2022)。最重要的是,家蠅雖然可傳播許多病原,但本身不感染病原。因此,家蠅清除病原體的免疫應(yīng)答機(jī)制成為研究熱點(diǎn)(Gilletal., 2017; Tangetal., 2019; Zhuangetal., 2021; Jiaoetal., 2022)。

血細(xì)胞(haemocyte)是昆蟲清除病原體的主要組織。昆蟲因缺少獲得性免疫(accquired immunity)而依賴先天性免疫(innate immunity)來防御病原入侵,其先天性免疫由細(xì)胞免疫(cellular immunity)和體液免疫(humoral immunity)組成(Siderietal., 2008; Hillyer 2016; Eleftherianosetal., 2021)。其中,細(xì)胞免疫主要包括由血細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用(phagocytosis)、包囊反應(yīng)(encapsulation)以及血細(xì)胞結(jié)節(jié)(nodulation)等是昆蟲清除病原體的主要途徑(Siderietal., 2008)。然而,單個(gè)蛋白調(diào)控血細(xì)胞清除病原體的分子機(jī)制尚不完整(Liegeois and Ferrandon, 2020)。

14-3-3蛋白定位于昆蟲血細(xì)胞,主要參與血細(xì)胞吞噬等免疫功能(Jiaoetal., 2022)。14-3-3蛋白家族是一類在真核生物間高度保守,可與多種蛋白結(jié)合并相互作用,具有免疫調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能(Obsil and Obsilova 2011; Liuetal., 2016; Yangetal., 2019)。例如,果蠅Drosophila和蚊子14-3-3ε對(duì)其抗菌肽的分泌和血細(xì)胞吞噬中起重要作用(Shandalaetal., 2011; Trujillo-Ocampoetal., 2017);家蠶Bombyxmori14-3-3蛋白可增強(qiáng)對(duì)病毒的敏感性(Kongetal., 2007);蝦和斑馬魚的14-3-3基因在抵抗革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌感染過程中起重要作用(Wangetal., 2021);相似地,我們發(fā)現(xiàn)家蠅MD14-3-3蛋白可穿透細(xì)胞膜殺死大腸桿菌Escherichiacoli和金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(Jiaoetal., 2022)。然而,家蠅MD14-3-3的互作蛋白尚不清楚。

酵母雙雜交(yeast two-hybrid, Y2H)技術(shù)是探究蛋白互作最有效的方法。目前,該方法廣泛應(yīng)用于微生物、植物、線蟲、昆蟲和高等動(dòng)物等,在篩選互作蛋白中發(fā)揮著重要作用,其原理主要通過構(gòu)建初級(jí)文庫、次級(jí)文庫、酵母轉(zhuǎn)化等形成高質(zhì)量的cDNA文庫,然后從文庫中篩選誘餌蛋白的互作蛋白,通過回轉(zhuǎn)驗(yàn)證即可確證互作(王冰等, 2013; 范琳芳等, 2016; 孫莉等, 2019; 趙星月等, 2020; 張博等, 2023)。本研究首先構(gòu)建家蠅酵母雙雜交cDNA文庫,進(jìn)一步從中篩選MD14-3-3的互作蛋白,為解析家蠅MD14-3-3介導(dǎo)免疫應(yīng)答提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)昆蟲

感染病原體的家蠅由貴州醫(yī)科大學(xué)現(xiàn)代病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度(26±1) ℃,相對(duì)濕度60%～70%,光周期10L∶14D。

1.2 總RNA的提取與mRNA分離純化

取3齡家蠅幼蟲以及家蠅成蟲取血淋巴,離心收集血細(xì)胞,然后轉(zhuǎn)入1.5 mL無RNase的離心管中,加入1 mL的Trizol試劑(Invirtrogen,美國),振蕩混勻,室溫靜置10 min充分裂解,后續(xù)操作按照Trizol總RNA提取液試劑說明書。按照Oligotex mRNA Midi Kit (Invirtrogen, 美國)說明書分離純mRNA。用紫外分光光度計(jì)NanoDrop One測量RNA質(zhì)量與濃度, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA完整性。

1.3 初級(jí)文庫的構(gòu)建

參照CloneMiner試劑盒(Invirtrogen,美國)說明書,將分離純化得到的mRNA 反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。用T4 DNA聚合酶使雙鏈cDNA平末端化。cDNA與三框attB1重組接頭連接(3種接頭分別各連接1份)。將連接產(chǎn)物全部上樣于cDNA Size Fractionation Columns,按照說明書對(duì)cDNA片段進(jìn)行分級(jí)分離并收集。將收集的雙鏈cDNA通過構(gòu)建BP重組反應(yīng)連接至pDNOR222載體(Invirtrogen,美國)(200 ng/μL)電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞。在冰上,將10 μL重組產(chǎn)物和50 μL電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞混勻,電擊后迅速向電轉(zhuǎn)杯中加入SOC培養(yǎng)基4 mL,將電轉(zhuǎn)物取入到新的1.5 mL離心管,置于37 ℃,225～250 r/min搖床培養(yǎng)1 h,培養(yǎng)結(jié)束后,獲取初級(jí)文庫菌液。取初級(jí)文庫菌液10 μL,100倍以及1 000倍稀釋,取50 μL在LB培養(yǎng)基上涂板(含相應(yīng)抗性Kan+),24 h后計(jì)數(shù)進(jìn)行庫容量鑒定。

1.4 次級(jí)文庫的構(gòu)建

從鑒定后的初級(jí)文庫中抽提質(zhì)粒與pGADT7-DEST(Invirtrogen, 美國)進(jìn)行LR重組反應(yīng)(attL入門克隆和attR目的載體間的重組反應(yīng))獲得次級(jí)文庫。構(gòu)建LR反應(yīng)將cDNA文庫(文庫類型為Uncut型)質(zhì)粒與pGDT7-DEST(文庫載體)進(jìn)行重組連接(25 ℃,16～20 h), 轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞中,獲得次級(jí)文庫菌液,取轉(zhuǎn)化菌液10 μL,將其稀釋100倍后取50 μL涂含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板,進(jìn)行文庫質(zhì)量鑒定。剩余培養(yǎng)物按照1∶1比例(v/v)加入20%甘油, 即為次級(jí)文庫菌液。從菌液中提取質(zhì)粒得到次級(jí)文庫質(zhì)粒, 用于后續(xù)酵母雙雜交共轉(zhuǎn)化。其中,文庫滴度(CFU/mL)=平板上的克隆數(shù)/50 μL×1 000×1×103μL,文庫總?cè)萘?CFU)=文庫滴度(CFU/mL)×文庫菌液總體積(mL)。

1.5 庫容量及重組率和插入片段長度的鑒定

獲取的次級(jí)文庫取100 μL,分別稀釋10, 100和1 000倍進(jìn)行酵母三框cDNA文庫庫容檢測,從中取出50 μL涂布LR平板(含相應(yīng)抗性氨芐青霉素),第2天計(jì)數(shù)。按照文庫滴度(CFU/mL)=平板上的克隆數(shù)/50 μL×1 000×1×103μL,文庫總?cè)萘?CFU)=文庫滴度(CFU/mL)×文庫菌液總體積(mL)。隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定,菌落PCR引物見表1,初級(jí)文庫鑒定使用引物M13,次級(jí)文庫鑒定使用引物pGADT7。PCR體系: 正反向引物各0.5 μL, cDNA 1 μL, Buffer 2.5 μL, dNTP Mix 0.5 μL, ddH2O 19.5 μL, Taq DNA Polymerase 0.5 μL。反應(yīng)程序: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 2 min, 25個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min, 4 ℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,對(duì)其插入片段長度和重組率進(jìn)行鑒定。重組率(%)=(重組成功克隆數(shù)量/克隆總數(shù))×100。

表1 引物信息

1.6 誘餌載體自激活檢測及功能驗(yàn)證

以家蠅cDNA第1鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增MD14-3-3,引物序列見表1,然后將pGBKT7連接至MD14-3-3構(gòu)建pGBKT7-MD14-3-3,測序驗(yàn)證。隨后參照Coolaber試劑盒(Coolaber,北京)說明書進(jìn)行自激活檢測及功能驗(yàn)證,將5 μL的pBT3-STE-Toc159、3 μL質(zhì)粒pPR3-N和10 μL熱變性的Carrier DNA加入酵母感受態(tài)細(xì)胞中混勻, 再加入PEG/LiAc 500 μL混勻, 30 ℃, 水浴30 min后, 42 ℃熱擊15 min, 4 000×g離心40 s, 棄上清, 用100 μL ddH2O重懸菌體。取50 μL菌液涂到SD/-Trp/-Leu(SD-TL), SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu(SD-TLHA)和LacZ(LacZ藍(lán)白斑篩選)培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)72 h,觀察結(jié)果菌落是否產(chǎn)生藍(lán)斑。相似地,以pGBKT7-53和pGADT7-T為陽性性對(duì)照,以pGBKT7-Lam和pGADT7-T為陰性對(duì)照,進(jìn)行自激活檢測。

1.7 MD14-3-3互作蛋白篩選

將前期成功構(gòu)建的pGBKT7-MD14-3-3載體進(jìn)行酵母搖菌、質(zhì)粒抽提、轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌感受態(tài)細(xì)胞,進(jìn)行平板篩選。首先,將Y2HGold酵母菌接種在YPDA平板上,取直徑2～3 mm的單克隆于3 mL YPDA培養(yǎng)液中(30 ℃,250 r/min,16～24 h)至OD600= 0.4～0.5,離心收集菌體。用3 mL 1.1×TE/LiAc溶液重懸酵母,同時(shí)將Carrier DNA預(yù)變性兩次,加NaCl(0.9%)懸浮菌體,將其10, 100和1 000倍稀釋,涂布SD-TL平板計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。同時(shí),取150 μL菌液涂布于SD/-His/-Trp/-Leu(SD-TLH)平板上,共50塊。30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d,長出大小1～2 mm的單克隆,挑取若干培養(yǎng)后進(jìn)行SD-TL培養(yǎng)基(150 μL/塊,64塊)、SD-TLHA/AbA培養(yǎng)基(150 μL/塊, 2塊)、SD/TLHA/X-α-Gal/ AbA培養(yǎng)基(150 μL/塊, 2塊) 平板篩選。

1.8 回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

將1.7節(jié)確認(rèn)的陽性克隆菌株加入到5 mL的SD-Trp/Leu液體培養(yǎng)基中,過夜培養(yǎng)后采用酵母小量抽提試劑盒(天根公司)抽提酵母質(zhì)粒。然后,取10 μL與Y2HGold酵母菌株轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans T1(全世金公司)新鮮感受態(tài)。涂布二缺平板,培養(yǎng)3 d后觀察,將其中的陽性克隆與三缺培養(yǎng)3 d,觀測到的陽性克隆在四缺培養(yǎng)基點(diǎn)板。最后,挑取四缺單克隆培養(yǎng),使用pGADT7通用引物(表1)對(duì)其進(jìn)行菌液PCR, PCR體系: 正反向引物各0.5 μL, 菌液cDNA 1 μL, Buffer 2.5 μL, dNTP Mix 0.5 μL, ddH2O 19.5 μL, Taq DNA Polymerase 0.5 μL。反應(yīng)程序: 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 36個(gè)循環(huán); 72 ℃ 5 min,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,將誘餌載體pGBKT7-Lam+pGADT7-T1和pGBKT7-Lam+pGADT7-T2送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序,驗(yàn)證互作蛋白,并對(duì)測序結(jié)果blast進(jìn)行基因的同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 mRNA分離純化

利用Trizol 法提取總RNA,經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測,純度為2.08,表明提取到完整的RNA。分離純化未發(fā)現(xiàn)18S rRNA和28S rRNA拖尾條帶,且分布彌散,其主要分布在1 000 bp以上,也無雜帶(圖1: A),表明mRNA無污染或降解,滿足建庫要求。同時(shí),合成的雙鏈cDNA 電泳結(jié)果也呈彌散狀,大小分布從100～5 000 bp(圖1: B),表明其中包含了不同大小和豐度的基因,可進(jìn)一步構(gòu)建cDNA文庫。

圖1 家蠅mRNA(A)以及雙鏈 cDNA (B)電泳檢測

2.2 文庫構(gòu)建與鑒定

在初級(jí)文庫中,檢測獲得1 100個(gè)陽性克隆,文庫滴度為2.2×106CFU/mL,總克隆數(shù)是8.8×106CFU。隨機(jī)挑取24個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定,瓊脂糖凝膠電泳顯示插入文庫的片段長度在500～2 000 bp之間,平均長度>1 000 bp,重組率為100%,表明多樣性好,成功構(gòu)建初級(jí)文庫(圖2: A, C)。

圖2 家蠅酵母雙雜交cDNA初級(jí)文庫插入片段(A, C)、次級(jí)級(jí)文庫插入片段(B, D)和文庫容量(E)檢測

在次級(jí)文庫中, 獲得的總克隆數(shù)為2 000 CFU, 文庫滴度為4.0×106CFU/mL, 文庫容量為1.6×107CFU。 PCR檢測結(jié)果表明, 瓊脂糖凝膠電泳顯示插入片段長度在500～2 000 bp之間,平均長度>1 000 bp,重組率為100%(圖2: B, D), 表明多樣性好,成功構(gòu)建次級(jí)文庫,可用于進(jìn)一步篩選互作蛋白。文庫容量為1.6×107CFU(圖2: E), 表明獲得的酵母雙雜交cDNA 文庫符合互作篩選大于1×106CFU的要求。

2.3 文庫自激活性

為保障結(jié)果的正確性,進(jìn)一步自激活性驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3種培養(yǎng)基(SD-TL, SD-TLHA和LacZ)上,陽性對(duì)照(pGBKT7-53+pGADT7-T)菌落均能夠良好生長,表明無毒性。同時(shí),實(shí)驗(yàn)組(pGBKT7-MD14-3-3)與陰性對(duì)照(pGBKT7-Lam+pGADT7-T)結(jié)果一致,而與陽性對(duì)照結(jié)果相反(圖3),表明該基因不具有轉(zhuǎn)錄激活活性可進(jìn)一步篩庫。

圖3 家蠅MD14-3-3誘餌蛋白自激活檢測

2.4 酵母雙雜交篩庫分析

將成功構(gòu)建的pGBKT7-MD14-3-3載體進(jìn)行酵母搖菌、質(zhì)粒抽提、轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌感受態(tài)細(xì)胞,進(jìn)行SD/TL培養(yǎng)基(150 μL/塊,64塊)、SD/THLA/AbA培養(yǎng)基(150 μL/塊, 2塊)、(SD/THLA/ X-α-Gal/ AbA培養(yǎng)基(150 μL/塊, 2塊) 平板篩選,最終兩次重復(fù)均獲得2個(gè)陽性克隆(圖4)。

圖4 家蠅酵母雙雜交cDNA文庫篩選MD14-3-3互作蛋白

2.5 回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

將MD14-3-3與2.4節(jié)中的2個(gè)陽性克隆進(jìn)行一對(duì)一回轉(zhuǎn)驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染的酵母其均能在SD-TL, SD-TLHA/AbA與X-α-Gal的培養(yǎng)基中正常生長,且與陽性對(duì)照的結(jié)果一致,與陰性對(duì)照的結(jié)果相反,表明目標(biāo)分子T1和T2為MD14-3-3互作蛋白(圖5), 進(jìn)一步對(duì)其測序并在NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)T1為抗菌肽ctenidin-1(GenBank登錄號(hào): XM_ 005181706.1),T2為mucin-like protein HKR1(GenBank登錄號(hào): XM_011293334.2)。

圖5 與MD14-3-3互作的目標(biāo)蛋白回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

3 討論

利用酵母雙雜交構(gòu)建cDNA文庫,從中篩選誘餌蛋白互作分子,建立目標(biāo)蛋白互作的上下游關(guān)系,對(duì)探究分子機(jī)制具有非常重要的意義。其中,cDNA文庫的容量和文庫的重組率是評(píng)價(jià)文庫完整性的核心指標(biāo),由于完整的mRNA由5′UTR, 3′UTR和CDS組成,因此要求重組cDNA片段足夠長,即庫容反映了mRNA的完整性,其最小庫容應(yīng)該在1×106CFU,重組率應(yīng)在98%以上(Johnsson and Varshavsky, 1994)。本研究構(gòu)建了家蠅初級(jí)文庫與次級(jí)的cDNA文庫,最終文庫庫容為1.6×107CFU,重組率為100%,插入片段長度在500～2 000 bp之間,平均長度>1 000 bp(圖2),表明成功構(gòu)建文庫,可用于進(jìn)一步篩選。

14-3-3蛋白定位于昆蟲的血細(xì)胞,主要參與血細(xì)胞吞噬、包囊、黑化等免疫功能(Obsil and Obsilova, 2011; Shandalaetal., 2011; Jiaoetal., 2022)。然而14-3-3互作蛋白及其介導(dǎo)免疫的分子機(jī)制尚不清楚。前期發(fā)現(xiàn)果蠅與斑馬魚14-3-3蛋白抵抗G+菌和G-菌感染中發(fā)揮重要作用(Shandalaetal., 2011; Wangetal., 2021)。我們近期發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白可穿透細(xì)胞膜殺死大腸桿菌E.coli和金黃色葡萄球菌S.aureus(Jiaoetal., 2022)。本研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽ctenidin-1可與14-3-3蛋白直接互作,據(jù)此推測其可能直接誘導(dǎo)細(xì)胞合成抗菌肽,而不通過Toll或者IMD信號(hào)通路來啟動(dòng)抗菌肽的合成。我們的研究為后期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路探究奠定了基礎(chǔ)。

Mucin-like蛋白主要定位于昆蟲的唾液腺,參與個(gè)體發(fā)育和免疫防御。例如,在果蠅中發(fā)現(xiàn)Mucin-like蛋白與其發(fā)育密切相關(guān)(Huangetal., 2022);而埃及伊蚊Mucin-like蛋白可與登革熱病毒互作,從而抑制病毒感染自身(Yadavetal., 2023);有趣的是,白背飛虱Sogatellafurcifera的Mucin-like 蛋白誘導(dǎo)宿主免疫防御反應(yīng)(Liuetal., 2022);而褐飛虱Nilaparvatalugens的Mucin-like蛋白與卵的發(fā)育密切相關(guān)(Louetal., 2019)。然而,我們發(fā)現(xiàn)Mucin-like蛋白可與14-3-3蛋白直接互作,這就解釋了家蠅取食并攜帶多種病原但自身不感染,可能是病原體伴隨Mucin-like蛋白進(jìn)入體內(nèi),隨即結(jié)合14-3-3蛋白并啟動(dòng)抗菌肽ctenidin-1合成,進(jìn)而殺死病原防止自身感染。我們的假說還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上,我們成功構(gòu)建了家蠅感染病原體后的酵母雙雜交構(gòu)建cDNA文庫,并利用MD14-3-3蛋白為誘餌篩選到了兩個(gè)互作蛋白(抗菌肽ctenidin-1和唾液mucin-like蛋白HKR1),提示mucin-like蛋白可能是MD14-3-3蛋白的上游調(diào)控分子,而ctenidin-1為其下游調(diào)控蛋白。我們的研究為后期探究MD14-3-3蛋白介導(dǎo)的免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路奠定了重要基礎(chǔ)。