不同飼料對(duì)花絨寄甲生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖和成蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落的影響

郭佳麗, 張岑鈺, 張 猛, 唐光輝, 張正青

(西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院, 楊凌 712100)

花絨寄甲Dastarcushelophoroides屬鞘翅目(Coleoptera)寄甲科(Bothrideridae),是蛀干類(lèi)害蟲(chóng)天牛的重要寄生性天敵(李孟樓等, 2007)。野外條件下,花絨寄甲初孵幼蟲(chóng)依靠胸足爬行尋找寄主,咬破寄主表皮取食其體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì);成蟲(chóng)食性較雜,喜好取食樹(shù)皮枝條、昆蟲(chóng)尸體、天牛幼蟲(chóng)和真菌等(雷瓊等, 2003; 路紀(jì)芳等, 2016)?，F(xiàn)階段,在生物防治天牛為害的過(guò)程中,主要通過(guò)大量人工飼養(yǎng)花絨寄甲并釋放以達(dá)到有效控制目的。在林間釋放試驗(yàn)中, 釋放花絨寄甲對(duì)光肩星天牛Anoplophoraglabripennis的蟲(chóng)口減退率可達(dá)90.98%,對(duì)黃斑星天牛Aeolestheschrysothrix的防治效果高達(dá)70.70%,對(duì)松褐天牛Monochamusalternatus總校正寄生效率為65.90%(董廣平等, 2013; 仇蘭芬等, 2019)。目前,花絨寄甲已經(jīng)實(shí)現(xiàn)室內(nèi)人工飼養(yǎng)。人工飼養(yǎng)花絨寄甲主要利用替代寄主和人工飼料,尚梅等(2009)依據(jù)寄主光肩星天牛體內(nèi)氨基酸成分及含量,改變?nèi)斯わ暳现邪被岜壤?發(fā)現(xiàn)可以提高花絨寄甲的老熟幼蟲(chóng)的體長(zhǎng)體寬以及羽化率,并研發(fā)出室內(nèi)有效擴(kuò)繁花絨寄甲種群的人工飼料。顏學(xué)武等(2015)比較分別以黃粉蟲(chóng)Tenebriomolitor、大麥蟲(chóng)Zophobasatratus和松墨天牛Monochamusalternatus幼蟲(chóng)為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)制作的人工飼料的飼養(yǎng)效果差異,發(fā)現(xiàn)各組之間無(wú)顯著差異,證明了配方人工飼料在室內(nèi)養(yǎng)殖的適用性。王志華等(2018)綜合比對(duì)不同種人工飼料對(duì)花絨寄甲生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖歷期等的影響,發(fā)現(xiàn)加入黃粉蟲(chóng)干粉、大麥蟲(chóng)幼蟲(chóng)干粉和氨基酸配制的飼料更有利于花絨寄甲的生長(zhǎng)發(fā)育。然而,根據(jù)花絨寄甲成蟲(chóng)在野外條件下食物來(lái)源配制的人工飼料是否適用于現(xiàn)階段長(zhǎng)期室內(nèi)飼養(yǎng)種群生長(zhǎng)發(fā)育有待進(jìn)一步研究。不同配方飼料對(duì)花絨寄甲成蟲(chóng)及后代生長(zhǎng)發(fā)育影響顯著,因此,優(yōu)化飼料配方以利于花絨寄甲生長(zhǎng)發(fā)育和繁育成為人工擴(kuò)繁花絨寄甲種群用于釋放的迫切需求。

昆蟲(chóng)體內(nèi)棲居著大量微生物以腸道菌群的形式定殖在消化道內(nèi)。前人研究表明,飼料的轉(zhuǎn)變會(huì)導(dǎo)致昆蟲(chóng)的腸道微生物也發(fā)生變化,間接影響昆蟲(chóng)的健康(Shietal., 2010)。其中,腸道細(xì)菌廣泛參與宿主食物消化,在幫助宿主合成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、參與宿主免疫防御和生殖代謝中發(fā)揮主要作用,為保證宿主正常生長(zhǎng)發(fā)育提供保障(Kaltenpothetal., 2014)。研究發(fā)現(xiàn),蝗蟲(chóng)腸道含有多種分泌纖維素酶的微生物,具有較高的纖維素分解活性(Suetal., 2014)。核桃果峰斑蛾Acrobasisnuxvorella腸道內(nèi)的一種細(xì)菌可以產(chǎn)生單寧酶以降解單寧中的沒(méi)食子酸酯鍵,成為該蟲(chóng)可以消化單寧的重要原因(Consueloetal., 2022)。利用抗生素清除或剝離腸道細(xì)菌后,昆蟲(chóng)的免疫能力、生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)卵量和存活率均顯著下降(Muhammadetal., 2019)。昆蟲(chóng)取食食物不同對(duì)其腸道菌群結(jié)構(gòu)影響顯著,消化吸收不同的食物成分會(huì)有不同的細(xì)菌參加其中(楊云秋等, 2018)。梨小食心蟲(chóng)Grapholitamolesta在取食蘋(píng)果、桃、油桃、梨、李子等果實(shí)后,腸道細(xì)菌存在差異,取食李子的腸道群落多樣性最高,取食蘋(píng)果的腸道群落多樣性最低(Yuanetal., 2021)。斜紋夜蛾Spodopteralitura在取食自然食物與人工飼料后,腸道群落的優(yōu)勢(shì)菌目明顯不同(Xiaetal., 2018)?；ńq寄甲成蟲(chóng)在人工飼養(yǎng)的條件下壽命可達(dá)3年之久,成蟲(chóng)羽化后20 d開(kāi)始產(chǎn)卵,產(chǎn)卵高峰期持續(xù)兩個(gè)月,新羽化成蟲(chóng)取食繭殼補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)后破繭而出,隨后取食飼料,然而,取食不同配方的人工飼料是否會(huì)對(duì)花絨寄甲成蟲(chóng)腸道菌產(chǎn)生影響,腸道細(xì)菌與其生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖間存在怎樣的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

本研究以花絨寄甲成蟲(chóng)為研究對(duì)象,分析取食不同配方飼料對(duì)花絨寄甲親代成蟲(chóng)體重、體長(zhǎng)、體寬、產(chǎn)卵前期、持續(xù)產(chǎn)卵量及子一代孵化率、幼蟲(chóng)歷期、寄生效率、結(jié)繭率、繭期和羽化率的影響;同時(shí)利用16S rDNA基因測(cè)序,分析長(zhǎng)期取食不同配方飼料后花絨寄甲成蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落的變化情況,并對(duì)腸道細(xì)菌核心群落豐度與宿主生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。為優(yōu)化人工飼料配方,建立適合于室內(nèi)長(zhǎng)期飼養(yǎng)花絨寄甲種群的人工飼料,實(shí)現(xiàn)室內(nèi)大量擴(kuò)繁花絨寄甲種群奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)及飼育處理

所用花絨寄甲均來(lái)自于西部森林生物災(zāi)害治理國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。全齡飼養(yǎng)條件為:溫度(23±2) ℃,相對(duì)濕度75%±5%,光周期16L∶8D。共配制6種人工飼料(飼料Ⅴ為現(xiàn)有人工飼料配方),飼料配方如表1所示。

表1 室內(nèi)飼養(yǎng)花絨寄甲飼料配方

按配方分別配制6種飼料置于-20 ℃保存?zhèn)溆?飼喂前取出,放置室溫下30 min后使用,隨機(jī)挑選24頭新羽化花絨寄甲成蟲(chóng)(雌∶雄=1∶1)放入一個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)盒內(nèi)(長(zhǎng)×寬×高=10 cm×10 cm×6.5 cm),每隔2 d以不同的配方飼料分別飼喂成蟲(chóng),每飼料處理3個(gè)重復(fù);以新羽化未飼喂飼料成蟲(chóng)為對(duì)照。

1.2 花絨寄甲生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖參數(shù)測(cè)定

每5 d分別統(tǒng)計(jì)1.1節(jié)取食不同飼料花絨寄甲親代成蟲(chóng)體重(g)、體長(zhǎng)(cm)和體寬(cm);飼喂64 d時(shí),統(tǒng)計(jì)花絨寄甲成蟲(chóng)累計(jì)死亡率(%);從成蟲(chóng)羽化后至每個(gè)飼養(yǎng)盒中雌成蟲(chóng)開(kāi)始產(chǎn)卵時(shí)為止,統(tǒng)計(jì)親代雌成蟲(chóng)產(chǎn)卵前期(d); 從產(chǎn)卵盒發(fā)現(xiàn)第1粒卵開(kāi)始持續(xù)觀察64 d,統(tǒng)計(jì)親代單雌日均產(chǎn)卵量 (每2 d統(tǒng)計(jì)1次求平均) 及觀察期內(nèi)單雌總產(chǎn)卵量。以未取食飼料的新羽化成蟲(chóng)為對(duì)照組,每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。

將取食不同飼料花絨寄甲親代產(chǎn)的卵孵化后人工接種至替代寄主大麥蟲(chóng)蛹上,統(tǒng)計(jì)取食不同配方飼料花絨寄甲子一代孵化率、幼蟲(chóng)寄生率、結(jié)繭率、幼蟲(chóng)歷期、繭期和羽化率。將含有卵塊的卵片放置培養(yǎng)皿中,在解剖鏡下統(tǒng)計(jì)卵的孵化率[孵化率(%)=(孵化孔數(shù)量/總卵數(shù)量)×100],隨機(jī)選取10頭花絨寄甲初孵幼蟲(chóng)接種在大小一致的大麥蟲(chóng)蛹上,統(tǒng)計(jì)寄生率[寄生率(%)=(成功寄生幼蟲(chóng)數(shù)量/接種幼蟲(chóng)數(shù)量)×100],觀察結(jié)繭率[結(jié)繭率(%)=(幼蟲(chóng)結(jié)繭數(shù)量/成功寄生幼蟲(chóng)數(shù))×100],記錄幼蟲(chóng)歷期[幼蟲(chóng)歷期(d)=幼蟲(chóng)接種至結(jié)繭的時(shí)間]、繭期[繭期(d)=幼蟲(chóng)結(jié)繭至羽化成蟲(chóng)的時(shí)間]及羽化率[羽化率(%)=(羽化成蟲(chóng)數(shù)量/幼蟲(chóng)結(jié)繭數(shù)量)×100]。以未取食飼料的新羽化成蟲(chóng)為對(duì)照組,各處理進(jìn)行20個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 花絨寄甲成蟲(chóng)腸道DNA提取及16S rDNA測(cè)序

對(duì)照組和分別取食不同飼料10, 20和40 d成蟲(chóng)隨機(jī)挑選5頭成蟲(chóng)饑餓24 h后進(jìn)行腸道無(wú)菌解剖, 5條腸道為1組進(jìn)行基因組DNA提取,每處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù),利用通用引物515F(5′-GTGCCAG CMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3′)(Itohetal., 2014)對(duì)16S rDNA V4-V5區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系(25 μL): 2×ES Taq MasterMix (北京康為世紀(jì)生物公司)12.5 μL, ddH2O 9.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程序: 94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性1 min, 48 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 30個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后用膠回收試劑盒切膠回收。純化的擴(kuò)增子采用Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序。

1.4 花絨寄甲成蟲(chóng)腸道細(xì)菌序列分析

使用fastq(v0.14.1)軟件對(duì)測(cè)序原始序列雙端的原始讀段數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量剪裁(-W4-M20),并根據(jù)序列兩端的引物信息利用cutadapt (v4.1)軟件去除引物,得到質(zhì)控后的paired-end Clean Reads(PE reads)。根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系,利用usearch-fastq_mergepairs (V10)進(jìn)行雙端序列拼接,再根據(jù)不同區(qū)域的長(zhǎng)度范圍對(duì)拼接后數(shù)據(jù)過(guò)濾,獲得最終Effective Tags。利用Uparse(v7.0.1001)對(duì)所有樣本Effective Tags進(jìn)行聚類(lèi),默認(rèn)以97%的一致性(identity)將序列聚類(lèi)成為可操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units, OTUs)(Haasetal., 2011)。

利用Mothur(v1.40.45)軟件OTU代表序列與Silva138數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.arb-silva.de/)比對(duì)進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1),在各分類(lèi)水平下(門(mén)、綱、目、科、屬、種和OTU)統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成(Edgar, 2013)。使用R繪制成樣品各分類(lèi)學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖?；贠TU豐度表,取每處理3個(gè)重復(fù)的平均值,統(tǒng)計(jì)OTU在各處理中出現(xiàn)的情況并繪制Venn圖,同時(shí)選取取食同種飼料不同時(shí)間腸道細(xì)菌在屬水平上平均豐度前15物種,生成ternaryplot(三元相圖),以反映不同環(huán)境下優(yōu)勢(shì)物種的差異?；贠TU豐度表,使用usearch-alpha_div(V10)評(píng)估個(gè)樣品腸道細(xì)菌組成的豐富度和均勻性(Alpha多樣性),包括Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)等,并利用usearch -alpha_div_rare (V10)繪制在不同深度時(shí)的上述多樣性指數(shù)的稀釋曲線?；贠TU豐度表,使用R vegan軟件進(jìn)行Beta多樣性分析,比較各樣品在物種多樣性方面的相似性,并基于weighted unifrac距離算法進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis, PCoA),并使用R語(yǔ)言ggplot2包進(jìn)行繪圖。使用PICRUSt(v1.1.0)軟件對(duì)OTU豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,通過(guò)每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的greengene id比對(duì)到KEGG(Kyoto Encylopaedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)花絨寄甲新羽化成蟲(chóng)和取食飼料不同時(shí)間成蟲(chóng)腸道內(nèi)細(xì)菌功能進(jìn)行預(yù)測(cè)(Parksetal., 2014)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS(v23.0)軟件分析花絨寄甲生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖等數(shù)據(jù),結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,多組比較采用one-way ANOVA中Duncan氏多重檢驗(yàn)(鄒垚, 2022)。利用R中的Pearson分析單雌日均產(chǎn)卵量隨時(shí)間變化情況,置信區(qū)間95%。使用R Vegan軟件進(jìn)行兩組間和多組間的Alpha多樣性指數(shù)比較,分別進(jìn)行Welch’st檢驗(yàn)和Tukey氏HSD檢驗(yàn)?；贐ray-Curtis距離算法,利用Adonis分析檢定新羽化成蟲(chóng)與取食飼料后成蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著性?；贙EGG level 2表,利用Wilcox秩和檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間通路差異分析。使用R中的Pearson相關(guān)系數(shù)分析取食不同飼料后花絨寄甲成蟲(chóng)腸道核心細(xì)菌屬相對(duì)豐度與生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖參數(shù)的相關(guān)性,并以熱圖表示。

2 結(jié)果

2.1 取食不同飼料對(duì)花絨寄甲親代成蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖的影響

取食不同飼料的花絨寄甲成蟲(chóng)體寬無(wú)顯著差異(P>0.05),體重及體長(zhǎng)差異顯著(P<0.05)(表2)。其中,取食飼料Ⅵ的花絨寄甲成蟲(chóng)體重最大,為0.0287 g;取食飼料Ⅳ的次之,為0.0271 g;取食飼料Ⅰ的體重、體長(zhǎng)最小,分別為0.0248 g和7.6250 cm。取食飼料Ⅰ、飼料Ⅱ、飼料Ⅲ、飼料Ⅳ和飼料Ⅵ花絨寄甲成蟲(chóng)64 d內(nèi)累計(jì)死亡率差異不顯著(P>0.05),取食飼料Ⅱ的64 d內(nèi)累計(jì)死亡率最高,為18.05%,取食飼料Ⅴ的64 d內(nèi)累計(jì)最低,為6.94%。取食飼料Ⅳ和飼料Ⅵ的花絨寄甲成蟲(chóng)產(chǎn)卵前期最短,從羽化后21 d開(kāi)始產(chǎn)卵;而取食飼料Ⅰ的花絨寄甲成蟲(chóng)產(chǎn)卵前期較長(zhǎng),羽化后24 d才開(kāi)始產(chǎn)卵。在整個(gè)觀察周期中,取食飼料Ⅳ和飼料Ⅵ的花絨寄甲成蟲(chóng)64 d內(nèi)單雌總產(chǎn)卵量最多,分別為1 068.19和1 199.03粒, 取食飼料Ⅲ的花絨寄甲64 d內(nèi)單雌總產(chǎn)卵量最低,為732.61粒,整個(gè)觀察周期內(nèi),取食飼料與日均產(chǎn)卵量的相關(guān)性分析表明,取食飼料Ⅰ、飼料Ⅳ、飼料Ⅴ和飼料Ⅵ的單雌日均產(chǎn)卵量隨取食時(shí)間顯著增加(P<0.05),而取食飼料Ⅱ和Ⅲ的單雌產(chǎn)卵量隨取食時(shí)間逐漸降低(圖1)。

圖1 取食不同飼料后花絨寄甲成蟲(chóng)單雌日均產(chǎn)卵量與取食時(shí)間的相關(guān)性

表2 取食不同飼料后花絨寄甲親代成蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育與繁殖參數(shù)

飼料配方見(jiàn)表1。表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;同一行數(shù)據(jù)后標(biāo)注不同小寫(xiě)字母表示經(jīng)Duncan氏多重比較后在0.05水平差異顯著;表3同。For diet formulae, see Table 1. Data in the table are mean±SE. Different letters following the data in the same row indicate significant difference at the 0.05 level by Duncan’s multiple comparisons. The same for Table 3.

表3 取食不同飼料后花絨寄甲成蟲(chóng)的子一代的生長(zhǎng)發(fā)育與繁殖參數(shù)

2.2 取食不同飼料對(duì)花絨寄甲子一代生長(zhǎng)發(fā)育的影響

取食不同飼料的花絨寄甲成蟲(chóng)子一代幼蟲(chóng)歷期和繭期無(wú)顯著差異(P>0.05),而孵化率、幼蟲(chóng)寄生率、結(jié)繭率和羽化率差異顯著(P<0.05)(表2)。取食飼料Ⅵ的花絨寄甲子一代孵化率最高, 為92.53%;取食飼料Ⅳ和飼料Ⅴ的次之,分別為90.03%和88.85%;取食飼料Ⅰ的最低,為86.91%。取食不同飼料成蟲(chóng)的子一代結(jié)繭率由高到低為:取食飼料Ⅲ>取食飼料Ⅵ>取食飼料Ⅴ>取食飼料Ⅳ>取食飼料Ⅱ>取食飼料Ⅰ;取食不同飼料成蟲(chóng)的子一代羽化率由高到低為:取食飼料Ⅵ>取食飼料Ⅴ>取食飼料 Ⅳ>取食飼料 Ⅲ>取食飼料 Ⅱ>取食飼料 Ⅰ。

2.3 取食不同飼料花絨寄甲成蟲(chóng)腸道細(xì)菌16S rDNA序列拼接組裝與OTU聚類(lèi)

取食不同飼料花絨寄甲成蟲(chóng)腸道16S rDNA基因V4-V5區(qū)序列測(cè)定共得到5 037 493條有效讀段序列,進(jìn)一步優(yōu)化得到4 781 552條高質(zhì)量有效序列。整體有效序列所占比例97%以上,滿足后續(xù)分析要求。對(duì)OTU進(jìn)行聚類(lèi)得到758個(gè)OTUs,分別注釋到11門(mén)22綱40目63科90屬。其中,對(duì)照組腸道細(xì)菌OTU數(shù)量高于取食不同配方飼料成蟲(chóng)的。取食不同配方飼料后花絨寄甲腸道細(xì)菌屬水平種類(lèi)隨取食時(shí)間均有增加。

將同處理下新羽化未取食飼料對(duì)照組成蟲(chóng)與取食不同飼料不同時(shí)間成蟲(chóng)3個(gè)重復(fù)的腸道細(xì)菌OTU取平均值后進(jìn)行聚類(lèi)分析,發(fā)現(xiàn)共有的OTU 為 34個(gè),而對(duì)照組細(xì)菌特有OTU最多,為32個(gè)(圖2)。隨取食時(shí)間增加,取食不同飼料成蟲(chóng)腸道內(nèi)特有細(xì)菌OTU數(shù)量逐漸增加,其中取食飼料Ⅰ、飼料Ⅱ和飼料Ⅲ 40 d時(shí)的花絨寄甲成蟲(chóng)腸道特有細(xì)菌OTU數(shù)最多,取食飼料Ⅳ、飼料Ⅴ和飼料Ⅵ 20 d 時(shí)的特有細(xì)菌OTU數(shù)最多。分別選取持續(xù)取食不同配方飼料10-40 d時(shí)花絨寄甲腸道細(xì)菌在屬水平上平均豐度排名前15的物種,生成的ternaryplot結(jié)果表明,優(yōu)勢(shì)菌屬隨著取食時(shí)間增加逐漸形成。此外,部分優(yōu)勢(shì)菌屬如乳球菌屬Lactococcus、不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter和Hafnia-Obesumbacterium等的豐度隨取食時(shí)間逐漸增加。

圖2 取食不同飼料不同時(shí)間點(diǎn)花絨寄甲成蟲(chóng)腸道細(xì)菌可操作分類(lèi)單元(OTU)分布Venn圖

2.4 取食不同飼料花絨寄甲成蟲(chóng)腸道細(xì)菌Alpha和Beta多樣性

Alpha 多樣性分析結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,取食飼料后成蟲(chóng)腸道細(xì)菌豐富度均顯著降低(P<0.05)(圖3: A)。取食飼料Ⅰ、飼料Ⅱ、飼料Ⅲ和飼料Ⅳ的成蟲(chóng)腸道細(xì)菌Chao 1指數(shù)隨著取食天數(shù)的增加漸漸升高;其中取食飼料Ⅳ成蟲(chóng)腸道細(xì)菌豐富度隨取食時(shí)間顯著增加(P<0.05)。Shannon指數(shù)用于反映群落的多樣性,取食飼料導(dǎo)致腸道細(xì)菌多樣性與對(duì)照組比顯著降低(P<0.01)(圖3: B)。除取食飼料Ⅰ成蟲(chóng)外,取食其他飼料不同時(shí)間成蟲(chóng)腸道細(xì)菌多樣性無(wú)顯著差異。

圖3 取食不同飼料不同時(shí)間點(diǎn)花絨寄甲成蟲(chóng)腸道細(xì)菌Alpha多樣性Chao 1指數(shù)(A)和Shannon指數(shù)(B)

PCoA結(jié)果表明(圖4),基于weighted_unifrac距離矩陣的坐標(biāo)軸PCoA1和PCoA2的解釋度分別為59.2%和34.8%,利用Adonis分析對(duì)照組和取食不同飼料成蟲(chóng)腸道細(xì)菌各樣本間的差異性,得到R2=0.679,P=0.001,說(shuō)明取食不同飼料顯著改變了花絨寄甲成蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落組成。此外,取食不同飼料不同時(shí)間成蟲(chóng)腸道細(xì)菌組成聚類(lèi)接近,可能表明取食現(xiàn)有不同飼料對(duì)成蟲(chóng)腸道群落組成影響較小。

圖4 取食不同飼料不同時(shí)間點(diǎn)花絨寄甲成蟲(chóng)腸道細(xì)菌β多樣性主坐標(biāo)分析(PCoA)

2.5 取食不同飼料花絨寄甲成蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

對(duì)照組花絨寄甲成蟲(chóng)腸道的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)(Firmicutes),相對(duì)豐度0.588,其次為變形菌門(mén)(Protebacteria)和放線菌門(mén)(Actinobacteria),相對(duì)豐度分別為0.205和0.169(圖5: A)。取食不同飼料不同時(shí)間成蟲(chóng)間腸道細(xì)菌菌群相似,以厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)為主,與對(duì)照組比放線菌門(mén)相對(duì)豐度降低。此外,隨著取食時(shí)間增加,相比于取食10 d時(shí),取食飼料Ⅳ-Ⅵ 40 d時(shí)的成蟲(chóng)腸道內(nèi)厚壁菌門(mén)豐度分別增加0.224, 0.171和0.170。

圖5 取食不同飼料不同時(shí)間點(diǎn)花絨寄甲成蟲(chóng)腸道細(xì)菌門(mén)(A)和屬水平(B)相對(duì)豐度

在屬水平,對(duì)照組新羽化成蟲(chóng)腸道豐度排名前6的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為乳球菌屬Lactococcus、棒狀桿菌屬Corynebacterium、芽孢桿菌屬Bacillus、葡萄球菌屬Staphylococcus、乳桿菌屬Lactobacillus和腸球菌屬Enterococcus,相對(duì)豐度分別為0.183, 0.165, 0.126, 0.089, 0.092和0.054(圖5: B)。取食不同飼料后成蟲(chóng)腸道細(xì)菌主要由乳球菌屬組成,相對(duì)豐度較對(duì)照組顯著增加0.084～0.549 (P<0.05)。其中,取食飼料Ⅳ-Ⅵ成蟲(chóng)腸道乳球菌屬的相對(duì)豐度隨時(shí)間逐漸上升,取食飼料Ⅰ和飼料Ⅲ 20 d時(shí)成蟲(chóng)腸道乳球菌屬相對(duì)豐度最高。與對(duì)照組相比,取食飼料后未鑒定菌屬(unassigned)的相對(duì)豐度占比增加,表明成蟲(chóng)在取食飼料后具有較多新物(種)發(fā)揮了功能,具有深入挖掘的潛力。此外,取食飼料Ⅰ 20 d時(shí)成蟲(chóng)腸道(S12)不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter相對(duì)豐度最高,為0.073;取食飼料Ⅱ和飼料Ⅲ的成蟲(chóng)腸道中Hydrotalea相對(duì)豐度隨取食時(shí)間增長(zhǎng)在取食40 d時(shí)的相對(duì)豐度占比分別為0.016和0.0149;取食飼料Ⅳ的成蟲(chóng)腸道Hafnia-Obesumbacterium相對(duì)豐度隨著取食時(shí)間增大,取食10, 20和40 d時(shí)相對(duì)豐度占比分別為0.0052, 0.0463和0.0558。

2.6 取食不同飼料花絨寄甲成蟲(chóng)腸道細(xì)菌基因功能

花絨寄甲成蟲(chóng)腸道細(xì)菌基因在KEGG level 2共注釋到15種代謝通路(圖6)。對(duì)照組成蟲(chóng)腸道細(xì)菌80.74%基因參與新陳代謝相關(guān)通路,包括參與碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)(占14.54%)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)(占12.55%)以及輔因子和維生素代謝(metabolism of cofactors and vitamins)(占11.89%)。取食不同飼料不同時(shí)間成蟲(chóng)腸道細(xì)菌基因參與代謝通路與對(duì)照組相似,代謝通路數(shù)量差異不顯著(P>0.05)。

圖6 取食不同飼料不同時(shí)間點(diǎn)花絨寄甲成蟲(chóng)腸道細(xì)菌基因KEGG level 2通路相對(duì)豐度分布

2.7 取食不同飼料成蟲(chóng)腸道核心細(xì)菌屬相對(duì)豐度與花絨寄甲生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖的相關(guān)性

花絨寄甲成蟲(chóng)腸道核心細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度與其親代繁殖及子代生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)指標(biāo)關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明(圖7),核心細(xì)菌相對(duì)豐度與親代成蟲(chóng)體重、體長(zhǎng)、體寬、產(chǎn)卵前期、64 d內(nèi)累計(jì)死亡率、64 d內(nèi)單雌總產(chǎn)卵量以及子一代孵化率、幼蟲(chóng)寄生率、結(jié)繭率和羽化率呈現(xiàn)出不同的相關(guān)性。其中,親代成蟲(chóng)體重與乳桿菌屬相對(duì)豐度顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),而與Mesorhizobium、Phreatobacter、 沙雷氏菌屬Serratia、Bradyrhizobium、Boseae和Hydrotalea相對(duì)豐度顯著正相關(guān)(P<0.05)。64 d內(nèi)單雌總產(chǎn)卵量與Bradyrhizobium和腸球菌屬相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。子一代孵化率與片球菌屬Pediococcus相對(duì)豐度極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),與Lentimicrohium相對(duì)豐度顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),幼蟲(chóng)寄生率與腸球菌屬相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)?；ńq寄甲親代成蟲(chóng)產(chǎn)卵前期與乳桿菌屬相對(duì)豐度極顯著正相關(guān)(P<0.01),但與腸球菌屬相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。子一代羽化率與芽孢桿菌屬相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),但與腸球菌屬相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。綜上,片球菌屬可能會(huì)降低子一代孵化率,腸球菌屬可能縮短親代成蟲(chóng)產(chǎn)卵前期、降低子一代幼蟲(chóng)寄生率增加羽化率,腸球菌屬分別與乳桿菌屬在產(chǎn)卵前期以及與芽孢桿菌屬在羽化率方面作用相反。

圖7 取食不同飼料花絨寄甲成蟲(chóng)腸道核心細(xì)菌屬與生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖相關(guān)性分析

3 討論

3.1 取食不同飼料對(duì)花絨寄甲親代成蟲(chóng)及子一代適合度影響分析

綜合親代成蟲(chóng)和子一代幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖的相關(guān)指標(biāo),研究顯示取食飼料Ⅳ和飼料Ⅵ的成蟲(chóng)體重高、體長(zhǎng)大、死亡率低、產(chǎn)卵前期短,并且單雌日均產(chǎn)卵量和單雌總產(chǎn)卵量均高于取食其他飼料的花絨寄甲成蟲(chóng)的(表2; 圖1)。相比于飼料Ⅲ和飼料Ⅴ,飼料Ⅳ和飼料Ⅵ利用大麥蟲(chóng)粉代替了原有飼料中的蠶蛹粉(表1)。與熟知的黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)、蠶蛹、蟋蟀、白蠟蟲(chóng)和家蠅相比,大麥蟲(chóng)的蛋白質(zhì)、氨基酸和能量均居首位,具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(王利娟, 2014)。大麥蟲(chóng)中含有豐富功能性氨基酸,如精氨酸和亮氨酸等,可參與合成多種生物活性物質(zhì),可能有利于花絨寄甲的生殖(周根來(lái)和殷潔鑫, 2021)。同時(shí),寄生性天敵昆蟲(chóng)不僅因地理隔離產(chǎn)生種群分化,也可能因寄生不同的寄主產(chǎn)生種群內(nèi)的分化,從而更加適應(yīng)寄主的生活特性和棲境條件,形成許多適應(yīng)性策略,寄生昆蟲(chóng)本身的學(xué)習(xí)行為,包括產(chǎn)卵期間經(jīng)歷的線索或與寄主接觸等過(guò)程,也能夠修正寄生昆蟲(chóng)的初始選擇(王小藝和楊忠岐, 2010)。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)長(zhǎng)期大量飼養(yǎng)的花絨寄甲種群,主要以大麥蟲(chóng)作為替代寄主,經(jīng)過(guò)多代持續(xù)擴(kuò)繁,其成蟲(chóng)可能已形成適應(yīng)大麥蟲(chóng)粉作為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的人工飼料。營(yíng)養(yǎng)匱乏不利于昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育和生態(tài)行為能力(Reimetal., 2019)。本研究所配制的飼料Ⅰ和飼料Ⅱ未添加任何蟲(chóng)粉,相較于其他飼料蛋白營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏,不利于寄生性天敵昆蟲(chóng)花絨寄甲的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖。飼料Ⅱ、飼料Ⅴ和飼料Ⅵ較飼料Ⅰ、飼料Ⅲ和飼料Ⅳ分別添加了木粉(楊樹(shù)韌皮部表皮與柳樹(shù)嫩枝研磨成粉),取食前3種飼料雌成蟲(chóng)的總產(chǎn)卵量均有增加,木材由無(wú)數(shù)小的細(xì)胞組成,細(xì)胞壁由多糖的纖維素和半纖維素以及具有芳香性的木質(zhì)素組成,其中纖維素占40%～62%,木質(zhì)素占18%～38%,半纖維素占8%～37%,淀粉60%以上,糖占6%,蛋白質(zhì)占1%～2%,這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能會(huì)促進(jìn)花絨寄甲的生長(zhǎng)發(fā)育。取食飼料Ⅳ和Ⅵ成蟲(chóng)單雌日均產(chǎn)卵量均隨取食時(shí)間顯著增加(圖1),但取食飼料Ⅵ成蟲(chóng)的64 d內(nèi)單雌總產(chǎn)卵量和子一代孵化率、結(jié)繭率顯著高于取食飼料Ⅳ成蟲(chóng)的。研究表明,雌成蟲(chóng)在選擇產(chǎn)卵時(shí)往往對(duì)棲息地的變化和宿主的質(zhì)量敏感,食物質(zhì)量和豐度差異是決定后代生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵因素(Smithetal., 2018)。綜上所述,綜合考慮親代成蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖以及子一代的適合度,本研究中的配方飼料Ⅵ更適合于室內(nèi)長(zhǎng)期飼養(yǎng)花絨寄甲種群。

3.2 取食不同飼料花絨寄甲成蟲(chóng)腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)與組成

對(duì)照組和與取食不同飼料成蟲(chóng)腸道細(xì)菌共注釋到758個(gè)OTUs,發(fā)現(xiàn)34個(gè)共有的OTUs,其中取食飼料Ⅳ的OTU數(shù)量較高。S0共注釋到32個(gè)特有OTUs(圖2)。對(duì)于完全變態(tài)的全變態(tài)昆蟲(chóng),在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中腸道定殖細(xì)菌可能發(fā)生顯著變化,當(dāng)成蟲(chóng)羽化時(shí),其腸道內(nèi)重新被高密度的存在于蛹室中的細(xì)菌種群定殖(Wangetal., 2017)。成蟲(chóng)期持續(xù)取食的昆蟲(chóng)羽化1周后,腸道微生物種群基本穩(wěn)定且不易被其他物種定殖(Dillon and Dillon., 2004)?；ńq寄甲腸道細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬隨著取食時(shí)間增加逐漸形成。研究表明,取食不同食物會(huì)引起昆蟲(chóng)腸道微環(huán)境存在差異,進(jìn)而導(dǎo)致其腸道微生物多樣性的差異(吳曉露等, 2019)。在本研究中,與對(duì)照(S0)相比,取食不同配方飼料后成蟲(chóng)腸道細(xì)菌多樣性顯著降低,取食不同的人工飼料成蟲(chóng)間的腸道細(xì)菌多樣性和群落組成無(wú)顯著差異(圖3)?；ńq寄甲成蟲(chóng)腸道細(xì)菌種類(lèi)豐富,共鑒定了11個(gè)門(mén)22個(gè)綱40個(gè)目63個(gè)科90個(gè)屬。在門(mén)水平,成蟲(chóng)腸道厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)豐度均占比較大,優(yōu)勢(shì)明顯,其余門(mén)類(lèi)占比較小(圖5: A),與前人利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和PCR-DGGE鑒定結(jié)果一致,同時(shí)也與其他鞘翅目昆蟲(chóng)如異色瓢蟲(chóng)Harmoniaaxyridis和松墨天牛腸道優(yōu)勢(shì)菌門(mén)(王偉偉, 2013; 羅巧玉, 2018; 閆裕, 2019)類(lèi)似。

3.3 取食不同飼料花絨寄甲成蟲(chóng)腸道菌群多樣性及特定細(xì)菌組成

與對(duì)照組(S0)相比,取食不同配方飼料后成蟲(chóng)腸道細(xì)菌Alpha和Beta多樣性均顯著降低(圖3),但取食不同飼料成蟲(chóng)腸道細(xì)菌多樣性和群落組成差異較小(圖3)。外源因素如宿主飲食和內(nèi)源因素如宿主系統(tǒng)發(fā)育對(duì)腸道微生物群落結(jié)構(gòu)有著強(qiáng)烈的影響,在直翅目昆蟲(chóng)中取食習(xí)性和分類(lèi)地位共同影響其腸道細(xì)菌群落組成(Zhengetal., 2021),這與我們的研究結(jié)果相似。

在屬水平,對(duì)照組注釋到優(yōu)勢(shì)菌屬分別為乳球菌屬、棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、乳桿菌屬和腸球菌屬,而取食人工飼料后成蟲(chóng)腸道細(xì)菌主要由乳球菌屬組成,且其相對(duì)豐度較對(duì)照組顯著增加(圖5: B)。在環(huán)境因子脅迫下,具有特殊功能的細(xì)菌種類(lèi)可能會(huì)加快繁殖以幫助宿主抵御環(huán)境變化,而其他菌株相應(yīng)減少,以達(dá)到群落平衡(孫文雯等, 2023)?；ńq寄甲成蟲(chóng)羽化后通常在繭內(nèi)停留1～2 d,然后咬破繭殼并取食補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)后再爬出坑道外,室內(nèi)飼養(yǎng)的成蟲(chóng)主要取食人工飼料,可能是造成新羽化成蟲(chóng)與取食后成蟲(chóng)腸道微生物差異的主要原因(路紀(jì)芳等, 2016)。此外,取食不同飼料不同時(shí)間成蟲(chóng)腸道內(nèi)其他菌屬,如不動(dòng)桿菌屬、Hydrotalea、Hafnia-Obesumbacterium和未鑒定菌屬相對(duì)豐度增加,可能原因?yàn)槌上x(chóng)在取食飼料后腸道內(nèi)形成了較多新物(種)發(fā)揮重要功能。

3.4 取食不同飼料花絨寄甲成蟲(chóng)腸道乳球菌重要功能

取食不同飼料后花絨寄甲成蟲(chóng)腸道內(nèi)相對(duì)豐度最高細(xì)菌的是乳球菌屬,其中,取食飼料Ⅳ-Ⅵ成蟲(chóng)腸道乳球菌屬的相對(duì)豐度隨時(shí)間逐漸上升,取食飼料Ⅰ和飼料Ⅲ 20 d時(shí)成蟲(chóng)腸道乳球菌屬相對(duì)豐度最高(圖5)。乳球菌大量存在于乳制品、牛奶、蔬菜和活性污泥,通常用于食品生產(chǎn)(Choetal., 2008)?；ńq寄甲成蟲(chóng)腸道細(xì)菌主要參與碳水化合物代謝、萜類(lèi)化合物和聚酮的代謝、異源生物降解和代謝以及聚糖生物合成和代謝(圖6)。王建梅(2020)通過(guò)長(zhǎng)翅素木蝗Shirakiacrisshirakii和花脛綠紋蝗Aiolopustamulus的消化率與微生物相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)腸球菌屬和乳球菌屬與纖維素的消化具有顯著相關(guān)性。白蟻后腸中分離得到的乳球菌屬在以葡萄糖和纖維二糖上培養(yǎng)基上生長(zhǎng)消耗氧氣,可能與碳水化合物的代謝有關(guān)(Baueretal., 2000)。紅棕象甲R(shí)hynchophorusferrugineus幼蟲(chóng)的腸道中鑒定出能夠通過(guò)編碼相應(yīng)的水解酶來(lái)降解多糖和蔗糖的細(xì)菌種類(lèi),如乳酸乳球菌Lactococcuslactis。用環(huán)氧蟲(chóng)啶處理后的美洲大蠊Periplanetaamericana前腸中的乳球菌屬相對(duì)豐度從0.16%增加到10.68%,發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵產(chǎn)物可為產(chǎn)甲烷菌提供碳源,同時(shí)可能與水解和產(chǎn)酸有關(guān)(Baoetal., 2021)。

3.5 取食不同飼料花絨寄甲成蟲(chóng)腸道核心細(xì)菌屬與其生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖的關(guān)系

分析花絨寄甲腸道豐度較高的核心細(xì)菌屬的相對(duì)豐度與親代成蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖及子代適合度的相關(guān)性發(fā)現(xiàn),腸道乳桿菌屬相對(duì)豐度與成蟲(chóng)體重呈顯著顯著負(fù)相關(guān),而與親代產(chǎn)卵前期呈顯著正相關(guān)(圖7),說(shuō)明乳桿菌的大量存在可能導(dǎo)致成蟲(chóng)體重降低、產(chǎn)卵前期延長(zhǎng),乳桿菌屬細(xì)菌具有合成果膠降解酶、糖苷水解酶和多糖水解酶的能力,可能參與昆蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)代謝(張靜和張博, 2017)。研究發(fā)現(xiàn),低劑量乳桿菌干預(yù)前后,雌鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)并不存在顯著的變化,而高劑量組雄鼠腸道菌群的多樣性則顯著降低(何嘉怡, 2018)。腸球菌屬相對(duì)豐度與成蟲(chóng)產(chǎn)卵量和子一代羽化率呈顯著正相關(guān)而與親代產(chǎn)卵前期與呈顯著負(fù)相,說(shuō)明,腸球菌的高豐度可以增加成蟲(chóng)產(chǎn)卵量、減少親代產(chǎn)卵前期并提高子代羽化數(shù)量。腸道中的腸球菌屬含有與豐富的纖維素、木聚糖和果膠降解相關(guān)的酶編碼基因,在幫助宿主降解聚合物方面發(fā)揮著重要作用(Xiaetal., 2018)。乳球菌屬通過(guò)促進(jìn)降解和消化食物給機(jī)體補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng),但本研究發(fā)現(xiàn)成蟲(chóng)取食后腸道內(nèi)高豐度細(xì)菌乳球菌的相對(duì)豐度與生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)相關(guān)性并不顯著,可能其作為一種益生菌廣泛參與寄主的生長(zhǎng)和免疫(Becketal., 2015)。芽孢桿菌屬相對(duì)豐度與子一代羽化率呈顯著負(fù)相關(guān),但Toledo等(1999)研究表明,暴露于蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensisβ-外毒素處理中的幸存成蟲(chóng)在壽命、繁殖力和孵化率(生育能力)方面沒(méi)有負(fù)面影響,高歡歡等(2016)研究表明,枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis對(duì)韭菜遲眼蕈蚊Bradysiaodoriphaga孵化率、蛹羽化率及成蟲(chóng)產(chǎn)卵量均無(wú)影響。體重與Mesorhizobium、Phreatobacter、沙雷氏菌屬Serratia、Bradyrhizobium、Bosea和Hydrotalea對(duì)豐度顯著正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng)沙雷氏菌對(duì)于崇明擬異小桿線蟲(chóng)的繁殖、生長(zhǎng)、發(fā)育都有明顯促進(jìn)作用(張崇星, 2009)。Hydrotalea是一種纖維素降解菌且食物纖維含量與草魚(yú)腸道中纖維素降解菌群多樣性之間存在正相關(guān)關(guān)系(Lietal., 2016)。

綜上所述,取食不同飼料對(duì)花絨寄甲成蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖及腸道細(xì)菌均有顯著影響。隨著室內(nèi)長(zhǎng)期飼養(yǎng),花絨寄甲人工種群逐漸適應(yīng)了以大麥蟲(chóng)為替代寄主和以大麥蟲(chóng)為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的人工飼料,新的配方飼料在花絨寄甲體重、產(chǎn)卵量、產(chǎn)卵前期和羽化率上均表現(xiàn)較好。因此,人工飼料Ⅳ和Ⅵ可以作為后續(xù)花絨寄甲長(zhǎng)期室內(nèi)飼養(yǎng)種群成蟲(chóng)的食物。同時(shí),本研究首次利用16S rDNA的分析了取食不同飼料花絨寄甲腸道細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu);并探索了腸道細(xì)菌與成蟲(chóng)生長(zhǎng)繁殖和子代適應(yīng)性的關(guān)聯(lián)性,發(fā)現(xiàn)了可能在花絨寄甲生長(zhǎng)繁殖種發(fā)揮重要作用的乳球菌屬,可為下一步改善花絨寄甲室內(nèi)養(yǎng)殖技術(shù)以提高花絨寄甲成蟲(chóng)產(chǎn)卵及幼蟲(chóng)寄生和羽化提供研究基礎(chǔ)。