CA2、CA9蛋白在舌鱗狀細(xì)胞癌的表達(dá)及預(yù)后價值

肖巧玲　祖木熱提古麗?阿不來提　趙格　徐江　黎昌學(xué)

摘要：目的 探討CA2、CA9蛋白在舌鱗狀細(xì)胞癌（TSCC）中的表達(dá)及生存意義，并分析兩者表達(dá)相關(guān)性及在癌癥中的潛在機(jī)制。方法 UCSC Xena在線分析CA2、CA9 mRNA在TSCC和對應(yīng)正常組織中的表達(dá)，免疫組化驗證CA2、CA9蛋白在89例TSCC及29例癌旁正常組織中的表達(dá)，并分析CA2、CA9蛋白表達(dá)相關(guān)性及其與臨床因素相關(guān)性，同時研究了CA2、CA9對TSCC的診斷及生存意義。最后用STRING和Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步探索了CA2和CA9蛋白潛在作用機(jī)制。結(jié)果 與癌旁正常組織相比，UCSC Xena數(shù)據(jù)庫顯示CA2、CA9 mRNA在TSCC中均高表達(dá)（均P<0.05），同時免疫組化實驗表明CA2、CA9蛋白在TSCC中也顯著高表達(dá)（均P<0.05）。其中，CA2蛋白在TSCC中高表達(dá)率為21.35%，CA9高表達(dá)率達(dá)61.80%。CA2蛋白高表達(dá)與TSCC更好的分化程度相關(guān)（P<0.05），CA9過度表達(dá)與更差的T分期明顯相關(guān)（P<0.05），且CA2與CA9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.240， P<0.05）。CA2、CA9蛋白在TSCC中的ROC曲線下面積分別為83.9%、85.8%，且兩者過度表達(dá)均與患者的不良預(yù)后相關(guān)（均P<0.05）。COX多因素模型提示CA9過度表達(dá)可能是TSCC預(yù)后不良的獨立因素（HR：2.748， P<0.05）。CA2、CA9可能參與了調(diào)節(jié)pH、缺氧反應(yīng)等生物過程。結(jié)論 CA2、CA9蛋白高表達(dá)提示TSCC患者的預(yù)后不良。

關(guān)鍵詞：舌鱗狀細(xì)胞癌；CA2；CA9；診斷；預(yù)后

中圖分類號：R739.86中圖分類號文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識碼

Expression and prognostic value of CA2 and CA9 proteins in tongue squamous

cell carcinoma

XIAO? Qiaoling1，ABULAITI·Zumuretiguli1，ZHAO? Ge2，XU? Jiang3，LI? Changxue3*

（1 School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000，China; 2 Yantai Stomatological Hospital， Yantai，Shandong

264008， China; 3 The First Affiliated Hospital， School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000， China）

Abstract： Objective To investigate the expression and survival significance of CA2 and CA9 protein in TSCC （tongue squamous cell carcinoma， TSCC）， and to analyze the correlation between the expression of CA2 and CA9 proteins and their potential mechanisms in cancer. Methods UCSC Xena analyzed the expression of CA2 and CA9 mRNA in TSCC and corresponding normal tissues. Then we detected the expression of CA2 and CA9 proteins in 89 cases of TSCC and 29 cases of normal tissues adjacent to cancer by immunohistochemistry and analyzed the correlation between CA2 and CA9 protein expression and clinical factors. Meanwhile， we studied the significance of CA2 and CA9 in the diagnosis and survival of TSCC. Finally， the potential mechanisms of CA2 and CA9 proteins were further explored using STRING and Metascape databases.Results Compared with normal adjacent tissues， CA2 and CA9 mRNA were highly expressed in TSCC by UCSC Xena database （both P<0.05）， and immunohistochemical experiments indicated that CA2 and CA9 protein were also significantly higher in TSCC （both P<0.05）. The high expression rate of CA2 and CA9 protein in TSCC was 21.35% and 61.80%， respectively. In TSCC， the high expression of CA2 protein was correlated with the better differentiation （P<0.05）， the overexpression of CA9 was significantly related to the worse T-stage （P<0.05）. The results showed the expression of CA2 was positively correlated with CA9 in TSCC （r=0.240， P<0.05）. The area under ROC curved of CA2 and CA9 of TSCC was 83.9%and 85.8%， respectively. And the overexpression of CA2 and CA9 was correlated with poor prognosis of patients （both P<0.05） in TSCC.COX multivariate model suggested that CA9 overexpression might be an independent factor of poor prognosis of TSCC （HR：2.748， P<0.05）. Furthermore， CA2 and CA9 might be involved in biological processes such as pH regulation and hypoxia response.Conclusion High expression of CA2 and CA9 protein suggested poor prognosis of TSCC patients.

Key words： tongue squamous cell carcinoma;CA2;CA9;diagnosis;prognosis

口腔癌約占惡性腫瘤的3%［1］，其中90%是鱗狀細(xì)胞癌，而舌鱗狀細(xì)胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）高達(dá)50%～60%［2］。TSCC的發(fā)病率和死亡率較高，5年生存率僅為50%［2］，因此尋求有效的生物標(biāo)記物改善TSCC患者的預(yù)后和治療很有必要性。

碳酸酐酶（carbonic anhydrases，CAs）是一種鋅蛋白酶家族，目前在人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)15種亞型，它們具有不同的序列，卻有相似的3D結(jié)構(gòu)［3］。根據(jù)細(xì)胞定位主要分為胞質(zhì)、膜結(jié)合、線粒體及分泌相關(guān)同工酶，其中，CA2屬于胞質(zhì)型，CA9屬于膜結(jié)合型。碳酸酐酶主要參與人體二氧化碳與碳酸氫根之間的轉(zhuǎn)化、pH調(diào)節(jié)、糖異生、鈣化等生理過程，同樣也在青光眼、肥胖、溶血性貧血及腫瘤等病理過程中發(fā)揮重要作用［4］。研究發(fā)現(xiàn)CA2表達(dá)與結(jié)直腸癌的侵襲性相關(guān)［3］，也會影響腦膜瘤的增殖［5］。CA9促進(jìn)多種癌癥發(fā)生發(fā)展，可能通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子表達(dá)來增加肝癌惡性并影響預(yù)后［6］，同時也是腎透明細(xì)胞癌、乳腺癌的治療靶點［4，7］。

目前，關(guān)于CA9在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)已有初步研究，但CA2的表達(dá)水平仍缺乏探索。本研究擬通過免疫組化實驗和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析CA2、CA9在TSCC中的潛在表達(dá)機(jī)制與臨床應(yīng)用價值，并初步探索兩者之間的相關(guān)性，以期為TSCC新的診斷治療靶點提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 患者和樣本

收集來自2004年至2020年石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科手術(shù)切除的89例原發(fā)TSCC患者的石蠟標(biāo)本，并選取29例對應(yīng)的癌旁正常組織作為對照組。整理所有病例的臨床病理資料，并參照第8版AJCC（the American Joint Committee on Cancer，AJCC）TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期。通過病歷、電話和其他方法對患者進(jìn)行隨訪，截止日期為2021年07月31日或死亡日期。

1.2 免疫組化

免疫組化采用EnVision兩步法，切片在二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各脫蠟5 min，然后在90%、80%、70%無水乙醇中再水合，加入一抗（稀釋比例：CA2∶1∶200;CA9∶1∶200）在4℃下孵育過夜，然后用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌切片組織，并使用EnVision TM 37℃溫箱孵育30 min，用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色觀察，樣本用蘇木精復(fù)染，再用酒精和二甲苯脫水封片。

1.3 評分標(biāo)準(zhǔn)

兩名病理學(xué)家采用獨立雙盲法完成免疫組化染色評分，CA2、CA9染色結(jié)果分別以胞漿、胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，并通過陽性細(xì)胞所占面積和染色強(qiáng)度兩者計分乘積來判斷。（1）陽性細(xì)胞面積百分比：＜5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。（2）細(xì)胞著色強(qiáng)度：無著色、黃色、棕黃色、棕色分別為0、1、2、3分。≤7分為低表達(dá)，8～12分為高表達(dá)。

1.4 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)

UCSC Xena（https：//xenabrowser.net/）是由TCGA數(shù)據(jù)庫衍生的一個非常直觀的在線網(wǎng)站。本研究篩選條件：數(shù)據(jù)來源：TCGA Head and Neck Cancer（HNSC）數(shù)據(jù)集；基因表達(dá)RNAseq：llluminaHiSeq；解剖部位：舌和舌根；組織學(xué)類型：鱗狀細(xì)胞癌；樣本類型：原發(fā)腫瘤。最終篩選出155例原發(fā)TSCC組織和對應(yīng)的15例正常組織。

SRTING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）是一個可以基于單個或多個蛋白預(yù)測其可能蛋白網(wǎng)絡(luò)的在線網(wǎng)站。本研究篩選條件：最低置信度得分：中等可信度（0.400）。

Metascape（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）是一個專注于基因功能注釋和富集通路分析的網(wǎng)站。分析條件：個性化分析；最小重疊區(qū)域：3；最小富集：1.5；P值截點：0.01；富集分析：分子功能、生物功能和細(xì)胞成分GO分析及KEGG通路分析。

1.5 統(tǒng)計

使用SPSS軟件23.0版進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。用χ2檢驗評估CA2、CA9在TSCC中的表達(dá)及其與臨床病理因素的相關(guān)性。Spearman分析CA2與CA9表達(dá)的相關(guān)性并繪制散點圖。ROC曲線評估CA2、CA9對TSCC的免疫診斷價值，Kaplan-Meier分析繪制存活曲線，COX單因素及多因素模型評估CA2、CA9對TSCC的生存影響。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)均采用在線統(tǒng)計分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000）。

2 結(jié)果

2.1 CA2、CA9 mRNA和蛋白在TSCC中的表達(dá)

利用UCSC Xena在線數(shù)據(jù)庫的TCGA數(shù)據(jù)集篩選出TSCC樣本后分析CA2、CA9 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常組織相比，CA2、CA9 mRNA在TSCC中均表現(xiàn)出高表達(dá)（P<0.001;P<0.000），結(jié)果見圖1。

免疫組化結(jié)果表明，CA2、CA9蛋白在TSCC中的表達(dá)水平都高于癌旁正常組織（P=0.015，P<0.000），CA2主要定位于細(xì)胞漿，CA9定位于細(xì)胞膜（圖2）。其中，CA2在TSCC中高表達(dá)率為21.35%，CA9在TSCC中高表達(dá)率占61.80%，結(jié)果見表1。

2.2 CA2、CA9蛋白與TSCC臨床因素相關(guān)性

TSCC中，CA2蛋白過度表達(dá)與較好的分化程度顯著相關(guān)（P=0.027），結(jié)果見圖3，與患者年齡、性別、淋巴轉(zhuǎn)移、T及TNM分期無明顯相關(guān)；CA9蛋白高表達(dá)與更差的T分期明顯相關(guān)（P=0.018），而與年齡、性別、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期和分化程度無相關(guān)性，結(jié)果見表2。

2.3 TSCC中，CA2與CA9蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

同時，根據(jù)免疫組織化學(xué)評分結(jié)果，Spearman分析表明，CA2與CA9蛋白表達(dá)水平在TSCC中呈正相關(guān)，且有統(tǒng)計學(xué)意義（r=0.240，P=0.023），結(jié)果見圖4。

2.4 CA2、CA9蛋白與TSCC的ROC曲線

接著，利用ROC曲線評估CA2、CA9蛋白對TSCC患者的免疫組化診斷價值。CA2、CA9蛋白在TSCC中的ROC曲線下面積分別為83.9%、85.8%。同時根據(jù)約登指數(shù)最大值得出CA2的敏感度為77.5%，特異性為79.3%，CA9的敏感度和特異性分別為87.6%和75.9%，結(jié)果見圖5。

2.5 CA2、CA9蛋白與TSCC患者的預(yù)后分析

進(jìn)一步研究CA2、CA9蛋白表達(dá)對TSCC患者的預(yù)后影響。89例TSCC患者中，71例獲得隨訪信息。對71例TSCC患者進(jìn)行Kaplan-Meier分析，結(jié)果表明CA2高表達(dá)預(yù)測了TSCC患者更低的生存率（P=0.023），同時，CA9蛋白過度表達(dá)也與TSCC更短的生存率顯著相關(guān)（P=0.005），結(jié)果見圖6。

建立CA2、CA9蛋白及TSCC臨床病理因素的COX單因素、多因素模型，如圖7所示。

COX單因素回歸模型顯示CA2、CA9蛋白表達(dá)及T分期的增加均是TSCC患者預(yù)后差的重要影響因素（風(fēng)險比（hazard ratio，HR）：2.353，P= 0.027;HR：2.866，P=0.008；HR：5.139，P=0.000）。COX多因素分析表明CA9蛋白過度表達(dá)及T分期增加是TSCC患者預(yù)后不良的獨立影響因素（HR：2.748，P=0.030;HR：13.682，P=0.001）。

2.6 CA2和CA9蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

基于STRING網(wǎng)站在線分析CA2、CA9人類相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出前50個相關(guān)蛋白，CA2和CA9蛋白通過實驗測定及文本數(shù)據(jù)挖掘表明兩者存在關(guān)聯(lián)，提示CA2、CA9存在蛋白同源性，并預(yù)測兩者之間存在基因共表達(dá)，也再次驗證了免疫組化分析的CA2與CA9蛋白之間明顯相關(guān)的結(jié)論（圖8）。

2.7 CA2、CA9富集通路分析

最后，Metascape數(shù)據(jù)庫根據(jù)CA2、CA9和前50個相關(guān)蛋白進(jìn)行通路富集分析。前20個GO分析表明，CA2和CA9主要位于外側(cè)質(zhì)膜中，兩者主要參與了調(diào)節(jié)PH值和缺氧反應(yīng)等生物過程，可能具備碳酸鹽脫水酶活性等分子功能。前10個KEGG通路顯示CA2和CA9主要參與了腎細(xì)胞癌、粘合連接等信號通路（圖9）。

3 討論

CAs可通過調(diào)節(jié)pH參與人類多種癌癥的發(fā)生發(fā)展，且是多種疾病的標(biāo)記物［3］。最近研究表明CA2在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)［4］，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［8］、脊索瘤［9］中高表達(dá)，CA9在頭頸部鱗癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥中上調(diào)［4］。然而，鮮少有關(guān)于CA2、CA9在TSCC中的表達(dá)及預(yù)后意義的研究。本研究發(fā)現(xiàn)CA2、CA9蛋白在TSCC中的表達(dá)均高于正常組織，且兩者蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系，提示CA2和CA9可能作為促癌基因共同參與TSCC的發(fā)展。

CA2位于染色體8q21.2上，是一種極其活躍的胞質(zhì)相關(guān)同工酶，對CO2的周轉(zhuǎn)率可接近擴(kuò)散極限，并廣泛分布于人體的大腦、肝、結(jié)直腸、肺、生殖器官等多種組織。Korhonen等［5］發(fā)現(xiàn)CA2高表達(dá)增加腦膜瘤的惡性程度，并與腫瘤分化程度相關(guān)。CA2在腹膜假性黏液瘤中高表達(dá)，且預(yù)示著患者的不良預(yù)后［10］，而Zhang等［11］學(xué)者提出相反的結(jié)論，認(rèn)為高表達(dá)的CA2預(yù)示著肝癌患者較好的總體生存率。本研究發(fā)現(xiàn)CA2蛋白與TSCC分化程度相關(guān)，且CA2高表達(dá)是TSCC預(yù)后差的重要影響因素。浸潤深度、腫瘤分級、侵入方式等都影響口腔鱗癌患者的預(yù)后，提示CA2過度表達(dá)是TSCC患者預(yù)后差的潛在標(biāo)記物，CA2在不同組織來源的惡性腫瘤中發(fā)揮不同作用。此外，ROC曲線被廣泛應(yīng)用于評價醫(yī)學(xué)診斷相關(guān)標(biāo)記物，其中，AUC是評估診斷價值的重要指標(biāo)［12］，CA2對TSCC的ROC曲線下面積為83.9%，提示CA2對TSCC免疫組化診斷存在一定價值，可作為潛在標(biāo)記物。Becker等學(xué)者在爪蟾卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CA2具有催化MCT1和MCT4等轉(zhuǎn)運體的作用［13］，單羧酸轉(zhuǎn)運體（monocarboxylate transporters，MCTs）可通過運輸腫瘤微環(huán)境的代謝物發(fā)揮促瘤作用，高表達(dá)的MCT1和MCT4是頭頸部鱗癌的功能性生物標(biāo)記物［14］，CA2可能作為中介為MCT1、MCT4等多種轉(zhuǎn)運體提供底物，從而導(dǎo)致微環(huán)境酸化［4］，而細(xì)胞外較低的pH與惡性腫瘤的侵襲與預(yù)后不良相關(guān)［3］。同時，基因譜分析表明CA2與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能機(jī)制是缺乏CA2可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受pH值波動，保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［15］。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測CA2和CA9可能共同參與了調(diào)節(jié)pH值、缺氧反應(yīng)等生物過程，因此，我們推測CA2在惡性腫瘤中通過調(diào)節(jié)pH發(fā)揮作用。

CA9位于染色體9p12-13上，是一種多結(jié)構(gòu)域的膜結(jié)合同工酶，也是頭頸部鱗癌、乳腺癌、前列腺等多種癌癥的潛在標(biāo)記物，目前已有有力證據(jù)表明CA9在缺氧條件下表達(dá)，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的pH，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲等惡性行為［4］。CA9在胰腺癌中與腫瘤大小呈正相關(guān)［16］，也有學(xué)者提出CA9與TSCC的T分期顯著相關(guān)［17］，這與我們的研究結(jié)果一致。同時，本研究發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)的CA9是影響患者預(yù)后不良的獨立因素，一致的是，Smith等［18］也提出高表達(dá)的CA9與前列腺癌較差的預(yù)后有關(guān)，而Gu等［19］認(rèn)為CA9的高表達(dá)預(yù)示膽管癌更好的預(yù)后。此外，CA9對TSCC的ROC曲線下面積為85.8%，提示CA9可作為TSCC免疫組化診斷的潛在標(biāo)記物。低表達(dá)的E-cadherin是增加口腔鱗癌侵襲性的可靠指標(biāo)，CA9可調(diào)節(jié)E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞粘附能力從而增加惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲性，提示CA9可能通過E-cadherin從而增加TSCC的侵襲能力［20］。酸化的微環(huán)境不利于免疫細(xì)胞和正常細(xì)胞的存活與發(fā)揮功能，但能促進(jìn)癌細(xì)胞的生長。CA9可與Na+/HCO3-共轉(zhuǎn)運體和陰離子交換器直接作用，催化細(xì)胞外環(huán)境中的CO2可逆水合作用，促使形成pH過低的腫瘤微環(huán)境，同時，CO2水化作用會導(dǎo)致酸擠壓增強(qiáng)，進(jìn)而增強(qiáng)癌細(xì)胞的pH緩沖活性與抗凋亡特征，并形成堿化的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，此外，缺氧也會存在進(jìn)而激活CA9，加重腫瘤微環(huán)境的酸化程度［21］。提示CA9可能通過參與調(diào)節(jié)pH、缺氧反應(yīng)、增加細(xì)胞粘附促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)展，這與我們通過生物信息學(xué)預(yù)測的一致。CA2和CA9在結(jié)構(gòu)上具有相同的質(zhì)子穿梭殘基和鋅配體，同源性約33%，兩者之間可能通過陰離子交換蛋白致使腫瘤外環(huán)境酸中毒［22］。也有研究報道，CA2和CA9可能通過調(diào)節(jié)pH值促使細(xì)胞酸化而產(chǎn)生適合腫瘤生長的微環(huán)境［22］。提示CA2與CA9之間可能通過共同調(diào)節(jié)pH促進(jìn)TSCC的發(fā)生發(fā)展。但是關(guān)于CA2和CA9在TSCC中的具體機(jī)制仍待進(jìn)一步探索和實驗驗證。

綜上所述，CA2、CA9蛋白在TSCC中明顯高表達(dá)，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)。CA2和CA9對TSCC具有良好的診斷價值，且與預(yù)后不良顯著相關(guān)，提示CA2、CA9可能是TSCC患者潛在的預(yù)后標(biāo)記物。CA2和CA9可能通過共同調(diào)節(jié)pH酸化腫瘤微環(huán)境發(fā)揮促癌作用，但目前仍需更多的樣本驗證其臨床研究價值及潛在表達(dá)機(jī)制。

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（責(zé)任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-05-27

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（82160572）;新疆維吾爾自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新項目（XJ2020G102）

作者簡介：肖巧玲（1996—），女，碩士研究生，專業(yè)方向為口腔頜面外科。

*通信作者：黎昌學(xué)（1969—），男，主任醫(yī)師，從事口腔頜面部腫瘤治療研究，e-mail：lichangxue100@163.com。