Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7與宮頸癌復發(fā)相關性臨床研究

張繼屏，范鍶絲，江潔麗，鄭建瑩，閔燕飛

（1.廣東醫(yī)科大學研究生院第一臨床學院；2.佛山市婦幼保健院婦科；3.佛山市第一人民醫(yī)院泌尿生殖腫瘤科，廣東 佛山 528000）

相關調查數(shù)據顯示我國每年宮頸癌新發(fā)病率超過9.8萬例，已發(fā)展成為一種嚴重的社會公共衛(wèi)生問題[1]。通過積極有效的外科手術、輔助放化療等措施可達到根治宮頸癌、遏制病情進展、改善預后的目的，但宮頸癌術后復發(fā)仍是不可避免的問題，同時也是影響宮頸癌患者遠期生存率與生活質量的重要因素，因此宮頸癌術后復發(fā)的準確預測一直是近年來臨床研究熱點與難點[2-3]。免疫組化是一種應用免疫學抗原抗體反應原理顯色特定組織細胞內抗原的技術，能夠實現(xiàn)定位、定性、相對定量的研究；免疫組化技術在胃腸道多種腫瘤疾病的診斷、治療、預后等多方面具有廣泛應用[4]。Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7為宮頸癌患者相對較為常用的免疫組化檢測指標，但Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7與宮頸癌患者預后關系的報道則相對較少。本組研究是回顧分析Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7免疫組化因素與宮頸癌術后復發(fā)相關性的臨床研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月至2022年1月在佛山市婦幼保健院和佛山市第一人民醫(yī)院收治的符合條件的120例宮頸癌患者臨床資料進行回顧性分析，根據患者復發(fā)預后情況及收治時間將其分為復發(fā)組與未復發(fā)組各60例。復發(fā)組年齡：27～73歲，平均年齡（56.91±12.48）歲；腫瘤直徑：0.5～8.5 cm，平均直徑（5.12±2.43）cm；病理類型：鱗癌35例，腺癌11例，小細胞癌等其他類型癌14例；病理分期[5]：Ⅰa1期2例，Ⅰa2期2例，Ⅰb1期8例，Ⅰb2期15例，Ⅰb3期12例，Ⅱa2期1例，Ⅱb期1例，Ⅲc1p期17例，Ⅲc2p期2例；明確宮旁浸潤8例，明確淋巴結轉移21例。未復發(fā)組年齡25～76歲，平均年齡（55.14±13.19）歲；腫瘤直徑0.2～8.5 cm，平均腫瘤直徑（5.28±1.97）cm；病理類型：鱗癌52例，腺癌6例，小細胞等其他類型癌2例；病理分期：Ⅰa1期2例，Ⅰa2期4例，Ⅰb1期21例，Ⅰb2期8例，Ⅰb3期11例，Ⅱa1期11例，Ⅲc1p期3例；明確宮旁浸潤0例，明確淋巴結轉移4例。本研究已通過佛山市婦幼保健院和佛山市第一人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。納入標準：①宮頸癌初診患者，經組織病理學確診，并接受規(guī)范手術治療[6]；②術前、術后臨床資料完整；③均進行Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7免疫組化病理檢測。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②嚴重心、肝、腎功能不全；③妊娠期患者；④精神疾病；⑤新輔助化療患者。

1.2 研究方法 回顧性采集宮頸癌患者Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7免疫組化表達情況，收集臨床相關資料進行分析，根據患者宮頸癌復發(fā)情況將其分為復發(fā)組與未復發(fā)組，通過單因素、多因素Logistic回歸分析宮頸癌術后復發(fā)的風險因素。以組織病理學結果作為診斷金標準，分析Ki67聯(lián)合突變型P53、突變型P16、CK7表達情況對宮頸癌術后復發(fā)的預警價值，并據此建立宮頸癌術后復發(fā)風險模型。

1.3 檢測方法 檢查患者術后病理切片組織中Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7表達情況，采用免疫組化PV-9000法進行檢測，所有抗體均由北京中杉金橋生物技術提供。常規(guī)石蠟包埋并制成4 μm切片，脫蠟水化組織切片并應用高壓鍋抗原熱修復，應用3%H2O2去離子水孵育阻斷內源性過氧化物酶，滴加一抗后4 ℃過夜。PBS沖洗后滴加聚合物酶輔助劑，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗后滴加酶標山羊抗小鼠IgG多聚體，37 ℃孵育30 min后應用DAB溶液顯色。最后用自來水沖洗、復燃、脫水、透明、封片。每例患者選擇2張切片進行觀察，以腫瘤細胞平均值作為細胞陽性率，其中突變型P16陽性反應為P16蛋白缺失率≥50%，細胞核呈少部分著色棕黃色，陽性定位處于細胞質與細胞核，陽性細胞百分率為陽性細胞數(shù)/計數(shù)細胞總數(shù)，占比≥10%表示陰性（-）；突變型P53陽性表現(xiàn)為異常細胞核過度表達，反應為腫瘤細胞中-強彌漫性核染色≥80%，細胞核呈強棕黃色，腫瘤細胞任何強度的非彌漫性核染色＜80%或者異常完全缺失表示陰性（-）；Ki67陽性反應是胞核棕黃色，僅在基底層細胞中有表達為陰性（-）；CK7陽性定義為≥1%細胞細胞質彌漫性染色。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用 SPSS 19統(tǒng)計學軟件。計量資料以()表示，組內采用配對t檢驗，組間采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以[例(%)]表示，采用χ2檢驗；使用多因素Logistic回歸分析篩選出影響宮頸癌術后復發(fā)的危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌術后復發(fā)的單因素分析 回顧性收治的120例宮頸癌患者按復發(fā)預后情況分為宮頸癌復發(fā)組(n=60)與未復發(fā)組(n=60)。單因素分析結果顯示：復發(fā)組腫瘤直徑≥4 cm、中或低分化、病理分期（Ⅱa～Ⅲ期）、淋巴轉移、脈管陽性、殘端陽性及Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7表達陽性的患者占比均高于未復發(fā)組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05)，見表1。

表1 宮頸癌術后復發(fā)的單因素分析[例(%)]

2.2 宮頸癌術后復發(fā)的多因素Logistic回歸分析 以宮頸癌術后是否復發(fā)作為因變量，將單因素分析中差異有統(tǒng)計學意義的數(shù)據作為自變量，并對其進行賦值；將腫瘤直徑＜4 cm賦值為0，腫瘤直徑≥4 cm賦值為1；分化程度：未分化賦值2，中低分化賦值為1，高分化賦值為0；病理分期：Ⅰa1～Ib3賦值為0，Ⅱa1～Ⅲ賦值為1；無淋巴轉移賦值為0，淋巴轉移為1；Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7表達陰性均為0，表達陽性均為1。納入Logistic回歸模型，結果顯示：腫瘤直徑≥4 cm、中或低分化、病理分期（Ⅱa～Ⅲ期）、淋巴結轉移、殘端陽性、脈管陽性及Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7表達陽性是宮頸癌術后復發(fā)的危險因素，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05)，見表2。

表2 宮頸癌術后復發(fā)的多因素Logistic回歸分析

2.3 Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7對宮頸癌術后復發(fā)的預警價值 以組織病理學診斷結果作為金標準，對比宮頸癌術后復發(fā)、未復發(fā)組Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7檢測結果，結果顯示：Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7陽性檢出對宮頸癌術后復發(fā)的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值均較高，見表3、表4。

表3 Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7檢測結果（例）

表4 Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7檢測結果對宮頸癌術后復發(fā)的預測價值（%）

2.4 模型建立 根據多因素Logistic回歸分析結果明確聯(lián)合預測因子，模型建立為LogitP =-9.543+腫瘤直徑×2.623+分化程度×2.764+病理分期×2.052+淋巴結轉移×2.046+殘端陽性×2.439+脈管陽性×2.413+Ki67表達×2.177+突變型P53表達×2.039+突變型P16表達×1.883+CK7表達性×2.098，上述公式直接代入數(shù)據，若LogitP＞0.496，即預警宮頸癌復發(fā)風險高。

3 討論

Ki67是一種半衰期相對較短的核抗原，細胞活性檢查中Ki67的水平可直接反映組織細胞的增殖活性，其與細胞增殖的數(shù)目具有直接關系，并且Ki67作為反映增殖活性時的穩(wěn)定性極高，在臨床檢驗中通常用于評估細胞合成代謝狀態(tài)與代謝功能等，是一項可靠而準確、方便的檢測指標，通常在惡性腫瘤組織內呈高表達狀態(tài)[7-8]，既往臨床研究已證實Ki67的表達水平與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)、預后等具有密切聯(lián)系，并在宮頸癌的診治與預后預測方面亦具有重要地位[9-10]。P53為一種抑癌基因，通常在上皮組織基底層中變動，可在鱗狀上皮細胞中檢測出P53基因表達陽性，而一旦P53基因發(fā)生基因突變而失去其原有的抑癌效果時，則可導致細胞組織失去相應的周期性調節(jié)功能，導致細胞異常增殖與異常突變、分化等現(xiàn)象的發(fā)生，對腫瘤細胞的抑制作用喪失，P53基因突變在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[11]，既往臨床可通過對突變型P53基因表達的檢測實現(xiàn)宮頸癌的早期篩查與診斷，并能夠作為宮頸癌進展與預后評價的客觀依據。P16與P53均為抑癌基因，但不同的是P16能夠直接參與進細胞周期調控活動中，一般在炎癥組織中可有微量表達，并且伴隨著炎癥的加重而逐漸表達上升，使細胞周期滯留于第一階段[12]，而當P16基因發(fā)生失活、缺失、突變等異常行為時，會極大程度上增加惡性腫瘤細胞的發(fā)生與增殖，在宮頸癌患者中可檢出突變型P16基因甲基化與患者病情進展具有密切聯(lián)系[13]。CK7是一種堿性Ⅱ型細胞角蛋白，在多數(shù)腺上皮、異性上皮中表達，可發(fā)揮維持上皮細胞完整的作用，一般情況下CK7主要在上皮腫瘤中表達，在宮頸鱗癌中表達呈陽性，但在其他部位鱗狀細胞癌CK7多呈陰性表達狀態(tài)[14-15]，這便導致其與宮頸癌發(fā)生發(fā)展及預后具有更為密切且對應的聯(lián)系。

本組研究結果顯示而復發(fā)組與未復發(fā)組年齡是否小于50歲、有無吸煙、成年前是否性生活、有無宮頸癌家族史、病理類型、術后放化療比例比較無顯著差異。將宮頸癌術后是否復發(fā)作為因變量，將影響術后復發(fā)的差異有統(tǒng)計學意義的指標作為自變量，納入多因素Logistic回顧分析模型，結果顯示：復發(fā)組腫瘤直徑≥4 cm、中或低分化、病理分期（Ⅱa～Ⅲ期）、淋巴轉移、殘端陽性、脈管陽性及Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7表達陽性是宮頸癌術后復發(fā)的主要風險因素結合本組研究結果分析認為，Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7表達水平與宮頸癌術后復發(fā)的關系可建立風險模型評估。Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7免疫組化檢測方法與過程相對較為簡單，檢測費用不昂貴，可在各級醫(yī)院中開展。

綜上所述，Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7表達陽性是宮頸癌術后復發(fā)的危險因素；Ki67、突變型P53、突變型P16、CK7免疫組化因素與宮頸癌術后復發(fā)相關性模型研究具有一定的研究價值及預警作用。