牙齦卟啉單胞菌外膜囊泡對(duì)牙周炎影響的研究進(jìn)展

鄧 愉 曹牛奔 劉笑夢(mèng) 于維先

牙周炎是一種慢性炎癥性疾病，表現(xiàn)為結(jié)締組織破壞，牙槽骨吸收，最終導(dǎo)致牙齒脫落。革蘭氏陰性菌—牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis）是牙周炎的主要病原菌[1]。

研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)革蘭氏陰性菌在生長過程中能夠通過外膜的囊泡化產(chǎn)生一種直徑約50～250 nm的球形雙層膜狀結(jié)構(gòu)，稱為外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）。OMVs 主要含有磷脂、脂多糖、外膜和周漿間隙的蛋白質(zhì)、核酸、酶和毒力因子等，在生物分子的傳遞、細(xì)胞間相互作用、生物膜形成及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[2，3]。更重要的是，OMVs 似乎比親本細(xì)菌更具有優(yōu)勢(shì)性。例如，OMVs 可以免受蛋白水解酶降解，在遠(yuǎn)端器官或組織中傳播[4]。

20 世紀(jì)80 年代，Williams 首次報(bào)道P.gingivalis能夠產(chǎn)生OMVs[5]。OMVs攜帶大量親本細(xì)菌的毒力因子，擁有P.gingivalis的基本生物學(xué)特性，如誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、損害宿主細(xì)胞和將毒力因子傳遞到宿主細(xì)胞[6]，在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。本文綜述了牙齦卟啉單胞菌外膜囊泡（Porphyromonas gingivalisouter membrane vesicles,P. gingivalisOMVs）的產(chǎn)生、毒力作用及其對(duì)牙周炎的影響，旨在為牙周炎的預(yù)防和治療提供新思路。

一、P.gingivalis OMVs的形成機(jī)制及影響因素

1.形成機(jī)制

OMVs 是由細(xì)菌外膜包裹周質(zhì)內(nèi)容物、肽聚糖片段和核酸通過出芽的方式形成[7]。OMVs 的形成機(jī)制目前尚未完全闡明。當(dāng)前已建立的假說試圖從分子水平解釋OMVs 的形成機(jī)制：①細(xì)菌外膜和肽聚糖之間共價(jià)鍵的丟失或重新定位，以及細(xì)菌外膜的生長速度較細(xì)胞壁快，使得細(xì)菌外膜突出，從而引發(fā)囊泡形成[8]；②肽聚糖片段或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的累積對(duì)細(xì)菌外膜施加膨脹壓力，導(dǎo)致外膜膨脹，最終收縮形成囊泡[9]；③磷脂、脂多糖和其他特定分子富集在細(xì)菌外膜上，使得細(xì)菌外膜的曲率發(fā)生變化從而產(chǎn)生OMVs[10]；④Roier 等人提出了一種可由磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)體VacJ/Yrb ABC 調(diào)節(jié)OMVs 產(chǎn)生的機(jī)制。首先VacJ/Yrb基因表達(dá)的減少或缺失導(dǎo)致磷脂在細(xì)菌外膜中積聚，這種不對(duì)稱膨脹會(huì)觸發(fā)細(xì)菌外膜向外膨脹；其次細(xì)菌外膜上的正曲率和負(fù)曲率將導(dǎo)致磷脂進(jìn)一步富集，并支持細(xì)菌外膜出芽，最終釋放形成OMVs[11]。上述機(jī)制可能都參與了P.gingivalisOMVs的形成，但P.gingivalis在不同的環(huán)境條件下或在不同的生長階段產(chǎn)生OMVs 的機(jī)制是否一致還有待研究。

2.影響因素

OMVs 是細(xì)菌對(duì)各種外部應(yīng)激的反應(yīng)產(chǎn)物，其包含的物質(zhì)是動(dòng)態(tài)的，可根據(jù)不同的生長條件進(jìn)行調(diào)整[12]。首先，OMVs的形成受基因調(diào)控。P.gingivalis菌株根據(jù)菌毛主要亞單位FimA 的基因型分為六種類型（Ⅰ型和Ib-V 型）。Ⅰ型（ATCC 33277）和Ⅲ型（ATCC 49417）菌株分泌的OMVs 要比Ⅳ型（W83）菌株的多。當(dāng)Ⅳ型FimA 基因被插入Ⅰ型菌株時(shí)，F(xiàn)imA 親本菌株和受體菌株形成的OMVs 數(shù)量相似，這表明菌毛亞型參與了P.gingivalisOMVs 的形成[13]。編碼牙齦蛋白酶的rgpA 基因的缺失也會(huì)導(dǎo)致OMVs 的生成減少[14]。其次，OMVs 的生成數(shù)量及內(nèi)容物還會(huì)隨著環(huán)境的變化而變化，尤其在應(yīng)激條件下，例如PH值和溫度的變化、低濃度血紅素、噬菌體感染以及與宿主細(xì)胞和其它細(xì)菌的相互作用等，都會(huì)增加OMVs的生成和釋放[12，15]。

二、P.gingivalis OMVs的成分及作用

OMVs 為球形納米蛋白脂質(zhì)體，具有體積小且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的特點(diǎn)，能更好的進(jìn)入深層組織，激活宿主炎癥反應(yīng)[15，16]。OMVs中的脂多糖、蛋白質(zhì)等毒力因子以及遺傳物質(zhì)等在促進(jìn)疾病發(fā)展、調(diào)節(jié)菌斑生物膜以及使細(xì)菌發(fā)生免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[17～19]。

1.脂多糖

脂多糖是革蘭氏陰性菌的基本結(jié)構(gòu)，是革蘭氏陰性菌表面最豐富的抗原[20]。脂多糖由脂質(zhì)A、多糖核心和一條稱為O 抗原的多糖長鏈組成[16]。P.gingivalisOMVs中富含大量脂多糖，與OMVs 的形成及蛋白質(zhì)內(nèi)容物的組成有關(guān)[9]。P.gingivalis表達(dá)兩種類型的脂多糖，帶中性電荷的脂多糖和帶負(fù)電荷的脂多糖，其中帶負(fù)電荷的脂多糖的O 抗原鏈有助于OMVs 的形成[21]。另外，根據(jù)多糖的組成或長度，脂多糖可選擇性的將外膜蛋白組裝到OMVs 中，這一機(jī)制促進(jìn)牙齦蛋白酶優(yōu)先組裝到OMVs 中[22]。牙齦蛋白酶可導(dǎo)致不同類型的細(xì)胞死亡，包括內(nèi)皮細(xì)胞、人牙齦成纖維細(xì)胞、人牙齦上皮細(xì)胞以及成骨細(xì)胞[23]，在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。

2.蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示OMVs 與親本細(xì)菌外膜具有相似的蛋白質(zhì)圖譜[24]，但OMVs 中的蛋白質(zhì)組成和特定蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度與親本細(xì)菌表面不同[25]。通過比較OMVs 和細(xì)菌外膜中外膜蛋白的相對(duì)豐度，發(fā)現(xiàn)具有C 末端結(jié)構(gòu)域的蛋白和一些脂蛋白優(yōu)先被分選到OMVs，而Ton-B依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和具有外膜蛋白A樣蛋白肽聚糖結(jié)合基序的蛋白質(zhì)優(yōu)先保留在細(xì)菌外膜[26]。富集C 末端結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)能夠與帶負(fù)電荷的脂多糖連接促進(jìn)電子致密表面層的形成，為OMVs 提供光滑的表面，研究發(fā)現(xiàn)，具有光滑表面的OMVs 在與宿主細(xì)胞膜相互作用時(shí)能夠保持其球形結(jié)構(gòu)，而粗糙型OMVs 結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生扭曲。OMVs的結(jié)構(gòu)又會(huì)影響OMVs的內(nèi)化：球形納米顆粒傾向于被宿主細(xì)胞膜完全包裹，而結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲的納米顆粒傾向于留在細(xì)胞表面[21，27]。牙齦蛋白酶是OMVs 中的主要致病蛋白，具有蛋白水解活性，可以直接和（或）間接破壞牙周組織，已被認(rèn)為是重要的毒力因子[28]。有研究表明，具有C 末端結(jié)構(gòu)域的牙齦蛋白酶在OMVs 中表現(xiàn)出中高比率，且含量是親本細(xì)菌的三到五倍[29]，在細(xì)菌聚集及生物膜形成方面發(fā)揮重要作用[20]。

OMVs 中其它富集C 末端結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)也被認(rèn)為與毒力有關(guān)，例如：CPG70 羧肽酶、肽基精氨酸脫亞氨酶及血凝素等[26，30]。其中肽基精氨酸脫亞氨酶能被帶負(fù)電荷的脂多糖修飾，在影響OMVs 的形成，促進(jìn)生物膜形成和OMVs 的表面移位中發(fā)揮重要作用，是牙周炎的潛在致病因素[31]。當(dāng)細(xì)菌在不同的環(huán)境條件下生長時(shí)，OMVs 的蛋白質(zhì)組成及含量會(huì)發(fā)生變化，這暗示特定蛋白質(zhì)有選擇地進(jìn)入OMVs，但具體機(jī)制還有待深入研究。

3.遺傳物質(zhì)

OMVs 還攜帶有親本細(xì)菌的DNA 以及mRNA、sRNA 和其他非編碼RNA。OMVs 的獨(dú)特保護(hù)結(jié)構(gòu)使得OMVs能夠?qū)⒓?xì)菌DNA和信號(hào)分子帶到遠(yuǎn)端靶器官而不會(huì)被降解。研究發(fā)現(xiàn)，外膜囊泡中的mRNA 可以在進(jìn)入宿主細(xì)胞后被轉(zhuǎn)錄和翻譯[32，33]，sRNA 能夠被包裝至OMVs，調(diào)節(jié)宿主基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)[34]。因此OMVs 可以在細(xì)胞間傳遞遺傳信息。

三、P.gingivalis OMVs在牙周炎發(fā)生中的作用

P.gingivalis作為紅色復(fù)合體菌群的核心成員與牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[35]。P.gingivalisOMVs能夠發(fā)揮“哨兵”作用提前到達(dá)疾病部位，與宿主細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用[7]。P.gingivalisOMVs 首先黏附定植于上皮細(xì)胞，損害上皮屏障并侵入皮下組織，進(jìn)而激活免疫細(xì)胞及其它組織細(xì)胞，參與牙周炎癥和組織破壞。

1.P.gingivalisOMVs對(duì)牙齦上皮細(xì)胞的作用

P.gingivalis的一個(gè)重要特征是它能夠侵入宿主細(xì)胞并在其中存活。在P.gingivalisOMVs 中發(fā)現(xiàn)了幾種與P.gingivalis黏附和侵襲宿主細(xì)胞有關(guān)的膜蛋白，包括FimA、血凝素A 和熱應(yīng)激蛋白[36]。因此，P.gingivalisOMVs 能侵入牙齦上皮細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞，且Ⅰ型菌株的OMVs比Ⅳ型菌株的OMVs侵襲力更強(qiáng)[37]。菌毛蛋白和牙齦蛋白酶還為OMVs提供了粘附和蛋白水解的能力，使P.gingivalisOMVs能夠破壞粘膜上皮的完整性，其中牙齦蛋白酶可以特異性降解牙齦上皮細(xì)胞連接粘附分子,導(dǎo)致牙齦上皮對(duì)40 kDa右旋糖酐、脂多糖和蛋白聚糖的通透性增大[38]，造成牙齦上皮的進(jìn)一步損傷。細(xì)胞遷移所需的信號(hào)分子轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和整合素也能被OMVs降解，導(dǎo)致上皮細(xì)胞功能受損[39]。

2.P.gingivalisOMVs對(duì)免疫細(xì)胞的作用

P.gingivalisOMVs 在穿過宿主上皮細(xì)胞屏障進(jìn)入粘膜下層后，能夠直接與各種免疫細(xì)胞相互作用，包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，從而引起免疫反應(yīng)失調(diào)和炎癥。

中性粒細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)對(duì)抗微生物病原體的主要效應(yīng)體，也是齦溝液中最豐富的細(xì)胞。中性粒細(xì)胞除了作為吞噬細(xì)胞，還可以釋放其細(xì)胞外染色質(zhì)、核蛋白和絲氨酸蛋白酶形成網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，稱為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps, NETs）。P.gingivalisOMVs 中的牙齦蛋白酶在NETs 的形成中起著雙重作用：牙齦蛋白酶是NETs 形成的有效直接誘導(dǎo)劑，但同時(shí)也可阻止NETs 對(duì)P.gingivalis的誘捕。這導(dǎo)致牙周袋中存在大量的中性粒細(xì)胞和NETs，但牙周病原體和相關(guān)的病原體也依然大量存在[40]。P.gingivalisOMVs 中富含的脂多糖也會(huì)影響中性粒細(xì)胞，包括細(xì)胞因子和NETs 的產(chǎn)生及細(xì)胞死亡。例如脂多糖能夠促進(jìn)炎癥因子白細(xì)胞介素（interleukin, IL）-8 的分泌。IL-8 是一種誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞募集的趨化因子[41]，這種招募可能會(huì)導(dǎo)致牙周組織長時(shí)間處于炎癥狀態(tài)。

P.gingivalisOMVs 能夠刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α）、IL-6 和IL-10 等，還會(huì)引起巨噬細(xì)胞代謝的改變，從氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒?，這一轉(zhuǎn)變使得線粒體耗氧量減少以及線粒體活性氧生成增加，使得OMVs 更能激活炎癥信號(hào)和細(xì)胞焦亡[42]。體外研究發(fā)現(xiàn)，P.gingivalisOMVs 能夠促進(jìn)人U937 巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞表面脂多糖受體CD14的脫落和裂解，這導(dǎo)致巨噬細(xì)胞對(duì)脂多糖刺激的反應(yīng)性降低，使P.gingivalis和其它牙周病原體逃避宿主免疫系統(tǒng)的能力增加[43]。OMVs 還可作用于樹突狀細(xì)胞，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟并參與免疫調(diào)節(jié)[44]。

3.P.gingivalisOMVs對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用

在牙周炎的進(jìn)展過程中往往伴隨著新生血管的形成，以修復(fù)炎癥所破壞的牙周組織。體外研究發(fā)現(xiàn)P.gingivalisOMVs 能夠抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，通過激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1 and 2, ERK1/2）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK）抑制小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮合酶的表達(dá)，以劑量依賴性方式抑制毛細(xì)血管的形成[39，45，46]。P.gingivalisOMVs 中的牙齦蛋白酶能夠降解血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1 和血管內(nèi)皮鈣粘蛋白，破壞內(nèi)皮細(xì)胞的連接，導(dǎo)致血管損傷和內(nèi)皮通透性增加，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[47]。P.gingivalisOMVs也被觀察到能夠影響內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。例如，在γ干擾素刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中加入P.gingivalisOMVs可抑制細(xì)胞表面Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合物的上調(diào)，從而調(diào)節(jié)抗原呈遞并有利于病原體的存活[43]。

4.P.gingivalisOMVs對(duì)其它組織細(xì)胞的作用

OMVs 已被證明是細(xì)菌和宿主組織之間通信的重要媒介。P.gingivalisOMVs 包含大量微生物相關(guān)分子模式能夠與宿主模式識(shí)別受體結(jié)合，啟動(dòng)促炎級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞因子、趨化因子和抗菌肽的產(chǎn)生[48]，其啟動(dòng)病原體識(shí)別和炎癥信號(hào)的方式可能受到所包含的鞘磷脂亞型的限制[39]。在進(jìn)入黏膜下層后，OMVs 中的牙齦蛋白酶既可通過引起細(xì)胞凋亡導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能受損，又能促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞增殖，促進(jìn)核因子-κB 受體激活因子配體誘導(dǎo)的成熟破骨細(xì)胞的分化并增強(qiáng)破骨細(xì)胞的功能[23，49]，使得骨吸收大于骨再生，最終導(dǎo)致牙齒脫落。

5.調(diào)節(jié)菌斑生物膜

牙菌斑是附著在牙齒表面的一種復(fù)雜生物膜，大約由700 多種細(xì)菌組成。在易感個(gè)體中，齦下菌斑生物膜中的細(xì)菌會(huì)促使微生物失調(diào)，導(dǎo)致牙齒支持組織逐漸破壞[50]。在菌斑生物膜中不同細(xì)菌之間的相互作用是通過粘附素與其受體之間的特異性識(shí)別而建立。P.gingivalisOMVs 中存在多種粘附素，如菌毛、牙齦蛋白酶和血凝素等。因此，P.gingivalisOMVs 可以與其他細(xì)菌相互作用，參與調(diào)節(jié)整個(gè)微生物群落[51]。P.gingivalisOMVs 介導(dǎo)了白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的聚集。在沒有OMVs 或熱處理OMVs 的情況下白色念珠菌和金黃色葡萄球菌則不會(huì)發(fā)生聚集。因此，P.gingivalisOMVs 可能是這兩種細(xì)菌之間的紐帶[6]。此外，P.gingivalisOMVs 還可以增強(qiáng)福賽坦氏菌對(duì)上皮細(xì)胞的附著和侵襲[36]。而P.gingivalisOMVs中的蛋白酶能夠降低具核梭桿菌表面粘附相關(guān)蛋白FadA 和FomA 的表達(dá)水平，抑制具核梭桿菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞的侵襲及具核梭桿菌的自聚集[52]。P.gingivalisOMVs 可以保護(hù)其它細(xì)菌免受血清殺菌作用的影響，并通過OMVs 中的脂多糖與洗必泰結(jié)合，從而為P.gingivalis和其它口腔細(xì)菌提供保護(hù)[53]。

四、P.gingivalis OMVs應(yīng)用研究前景展望

OMVs 最初被認(rèn)為是細(xì)胞碎片，然而隨著研究的不斷深入，其在細(xì)胞間通訊、防御和宿主的免疫調(diào)節(jié)等過程中的重要作用已被逐步認(rèn)知。近年來，OMVs 在疫苗開發(fā)以及藥物載體等方面顯示出了巨大的應(yīng)用前景。OMVs 具有被免疫細(xì)胞攝取的最佳體積，并且具有結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性，表現(xiàn)為①OMVs在不同溫度及條件下能夠保持完整和穩(wěn)定；②具有無生命活性、非復(fù)制性和佐劑作用，含有大量與親本細(xì)菌相關(guān)的免疫原性成分[54]，能夠引發(fā)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[55]。有研究表明，P.gingivalisOMVs能夠作為牙周炎疫苗的候選黏膜免疫原和佐劑[56]，并且已經(jīng)取得了一些令人滿意的結(jié)果。經(jīng)鼻或經(jīng)皮給予P.gingivalis的40-kDa 外膜蛋白可在血清和唾液中誘導(dǎo)特異性血清免疫球蛋白（immune globulin,Ig）G抗體，抑制P.gingivalis的共聚集活性，這意味著這種片段化的外膜蛋白對(duì)慢性牙周炎的疫苗接種是有用的[57]。繼而，Nakao 等人又對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)免疫，評(píng)估P.gingivalisOMVs 作為疫苗抗原的能力。在接種P.gingivalisOMVs 后，鼻腔沖洗液和唾液中以O(shè)MVs 的劑量依賴性方式產(chǎn)生P.gingivalis特異性抗體IgA 以及血清中IgG 和IgA 水平顯著升高，分別維持至少28 和18 天[58]。研究人員進(jìn)一步指出，P.gingivalisOMVs 中的脂多糖和帶負(fù)電荷脂多糖的修飾蛋白是導(dǎo)致小鼠體內(nèi)產(chǎn)生P.gingivalis特異性抗體的決定因素[59]。除此之外，與合成載體相比，OMVs具有多種優(yōu)點(diǎn)，如小顆粒尺寸、可靠的載藥能力和優(yōu)良的生物相容性[60]。因此，OMVs 有望成為一種潛在的藥物傳遞系統(tǒng)。

然而，P.gingivalisOMVs 的應(yīng)用仍然面臨一些問題。首先，OMVs 的大規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)還存在一定的難度，達(dá)不到目前臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)；其次，OMVs具有一定毒性，能夠?qū)C(jī)體產(chǎn)生部分毒副作用，需要仔細(xì)衡量免疫效果和潛在副作用之間的平衡；第三，作為藥物遞送的載體，還需要更多的修改技術(shù)來提高其穩(wěn)定性、靶向性和安全性[61，62]；最后，Gabarrini等人從P.gingivalis臨床分離株中初步檢測(cè)到肽基精氨酸脫亞氨酶，其中包含的兩種蛋白成分與OMVs相同[63]，但目前關(guān)于P.gingivalis臨床分離株OMVs的研究尚不充分。