河南省西峽縣雞源沙門氏菌分離鑒定及藥敏性檢測

摘 要：為探究河南省南陽市西峽縣雞源沙門氏菌的流行及耐藥性情況，對來自養(yǎng)雞場的疑似感染雞沙門氏菌的病死雞的54份病料組織進行分離菌培養(yǎng)及鏡檢、生化鑒定反應(yīng)和PCR鑒定，并檢測所有分離菌株對14種抗生素的耐藥性。檢測結(jié)果顯示，共分離出18株雞沙門氏菌，檢出率為33.33%；其中，雞白痢沙門氏菌有12株，腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌各3株；分離出的菌株對氯霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、慶大霉素的耐藥性較高，對四環(huán)素、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、紅霉素、頭孢吡肟較敏感，耐藥種類分布在1種到8種之間，多重耐藥率為88.89%（16/18），以耐5種抗生素的菌株最多。研究結(jié)果可為西峽縣沙門氏菌流行態(tài)勢的評估和防治措施的制定提供參考。

關(guān)鍵詞：雞；沙門氏菌；分離鑒定；耐藥性

中圖分類號：S852.61 文獻標志碼：B 文章編號：1674-7909（2024）2-101-4

DOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2024.02.023

0 引言

雞沙門氏菌病是由沙門氏菌（Salmonella）引起的、廣泛存在于養(yǎng)雞場中的細菌性疾病。雛雞感染該病菌后，會出現(xiàn)腹瀉、消瘦、脫水癥狀；母雞感染該病菌后，會出現(xiàn)卵囊炎、腹膜炎癥狀，產(chǎn)蛋率下降，且發(fā)病率和死亡率較高，從而給養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失［1］。沙門氏菌屬腸桿菌科，是一種人畜共患的革蘭氏陰性菌和條件致病菌，通常寄生在動物和人類的腸道內(nèi)，在宿主機體免疫力下降、外界環(huán)境變化時會成為優(yōu)勢菌，并導(dǎo)致宿主發(fā)病。沙門氏菌可通過污染的飲水、飼料、飼用器具和糞污等在雞群中進行水平傳播，還能通過感染受精卵進行垂直傳播。沙門氏菌血清型眾多，迄今為止已發(fā)現(xiàn)2 600多種血清型，我國主要流行的沙門氏菌血清型為雞白痢沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌［2-3］。不同地區(qū)不同時期流行的沙門氏菌血清型不一致，明確當?shù)亓餍械纳抽T氏菌血清型對實現(xiàn)沙門氏菌病的有效防治具有重要指導(dǎo)意義?？股乜捎糜诜乐渭仪莸亩喾N疾病，能提高家禽生產(chǎn)性能、降低飼料成本和疾病發(fā)生風險，但長期不合理使用抗生素會導(dǎo)致耐藥菌株日益增多，且形成多種耐藥性，嚴重影響抗生素的臨床應(yīng)用效果。對當?shù)亓餍芯甑哪退幮赃M行檢測，可為臨床合理使用抗生素提供參考，從而提高抗生素藥效。筆者通過調(diào)查河南省南陽市西峽縣部分養(yǎng)雞場，對當?shù)仉u源沙門氏菌流行的血清型進行鑒定，并對養(yǎng)雞場常用抗生素的耐藥性進行檢測分析，為雞沙門氏菌病的防治提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 臨床病料采集及質(zhì)控菌株

無菌采集西峽縣5家養(yǎng)雞場內(nèi)疑似患沙門氏菌病死亡的雞的心、肝、腸等器官組織，共54份，并裝袋編號送檢。以大腸埃希菌ATCC25922為標準質(zhì)控菌株（購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.2 主要培養(yǎng)基和試劑

測試所用的材料包括緩沖蛋白胨水（BPW）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MAC）、LB固體培養(yǎng)基（均購自青島青藥生物工程有限公司），細菌基因組DNA提取試劑盒、細菌生化鑒定管（均購自北京索萊寶科技有限公司），DL 2000 DNA Marker、2×Taq PCR Master Mix（均購自北京百奧萊博科技有限公司），藥敏紙片（購自杭州濱河微生物科技有限公司）。

1.3 分離菌培養(yǎng)及鏡檢

在無菌環(huán)境中挑取病料，并將其接種于緩沖蛋白胨水中進行預(yù)增菌。將菌懸液分別接種于LB固體培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基中，于37 ℃下培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落特征。挑取特征菌落進行革蘭氏染色，并對涂片進行鏡檢，觀察分離菌的形態(tài)特性。

1.4 生化鑒定反應(yīng)

按照細菌生化鑒定管操作說明書中的要求，將上述增菌液接種于生化反應(yīng)鑒定管中，并觀察反應(yīng)結(jié)果，根據(jù)《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）［4］中的要求對反應(yīng)結(jié)果進行判斷。

1.5 PCR鑒定

參照文獻［5］～［7］，設(shè)計invA、stn、sdf、P1、P2、STM4497共6對引物（引物的基本信息見表1），用來對沙門氏菌血清型進行鑒定，引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。用細菌基因組DNA提取試劑盒來提取增菌液中的DNA，并以此為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為分離菌1 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O補足至25 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性35 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共運行35個循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。取部分擴增產(chǎn)物，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，并將結(jié)果在Genbank數(shù)據(jù)庫經(jīng)BLAST比對。

1.6 藥敏試驗

參考美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）推薦的K-B紙片法，檢測沙門氏菌對氯霉素、青霉素、頭孢噻肟、頭孢吡肟、多西環(huán)素、氟苯尼考、卡那霉素、慶大霉素、紅霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、多黏菌素、阿米卡星等14種抗生素藥物的耐藥性。檢測試驗以大腸埃希菌ATCC25922為對照組。將吸取到的菌懸液均勻地涂布在LB固體營養(yǎng)瓊脂平板上，并在表面平鋪藥敏紙片（紙片之間要保持適當距離），于37 ℃恒溫培養(yǎng)16～24 h，然后測量抑菌圈直徑，并判定沙門氏菌對每種抗生素的敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌培養(yǎng)及鏡檢

對病料分別進行接種和培養(yǎng)后，分離菌菌落形態(tài)與鏡檢結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，接種分離菌的LB固體培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基會形成邊緣整齊、表面無色透明的菌落。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果見圖1（c），分離菌為單個分散或數(shù)個聚集分布、兩端鈍圓的陰性菌，共有18個菌落的形態(tài)和鏡檢特征基本符合沙門氏菌特性。

2.2 生化鑒定反應(yīng)

細菌微量生化鑒定反應(yīng)結(jié)果見表2。有18株分離菌發(fā)酵為葡萄糖、鳥氨酸、賴氨酸脫羧酶，6株分離菌具有運動性，7株分離菌發(fā)酵為衛(wèi)矛醇，18株分離菌不發(fā)酵乳糖，且尿素和氰化鉀試驗為陰性，上述結(jié)果與沙門氏菌生化特性一致。根據(jù)傷寒沙門氏菌不發(fā)酵鳥氨酸的生化特點，且分離菌株均不能發(fā)酵鳥氨酸，所以判斷分離菌株不含雞傷寒沙門氏菌。結(jié)合雞白痢沙門氏菌無運動性的特性，判斷有12株雞白痢沙門氏菌。綜上所述，18株分離菌中有12株雞白痢沙門氏菌，6株為副傷寒沙門氏菌。

2.3 PCR擴增

經(jīng)PCR擴增鑒定后，18株分離菌均可得到長約為605 bp、260 bp的目的條帶，分別與invA和stn基因符合，這表明18株分離菌均為沙門氏菌屬，見圖2（a）；12株分離菌均可獲得長約為417 bp的目的條帶，與P1基因符合，表明這12株分離菌為雞白痢沙門氏菌，見圖2（b）；3株分離菌均可獲得長約為203 bp的目的條帶，與sdf基因符合，表明這3株分離菌為腸炎沙門氏菌，見圖2（c）；3株分離菌均可獲得長約為523 bp的目的條帶，與STM4497基因符合，表明這3株分離菌為鼠傷寒沙門氏菌，見圖2（d）。未見同時擴增獲得P1和P2基因條帶，這表明分離菌中無雞傷寒沙門氏菌。將基因測序結(jié)果在Genbank數(shù)據(jù)庫內(nèi)經(jīng)BLAST比對可知，核酸相似性在97.6%以上。

2.4 藥敏試驗

對18株分離菌進行14種抗生素耐藥性K-B法檢測，結(jié)果見表3。分離菌株對氯霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、慶大霉素的耐藥性比較嚴重，耐藥率為62.31%～81.98%；對四環(huán)素、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、紅霉素、頭孢吡肟比較敏感，敏感率在50%以上。分離菌株耐藥種類分布如圖3所示，耐藥種類分布在1種到8種之間，多重耐藥率（耐3種及3種藥物以上）為88.89%（16/18），以耐5種抗生素最多，耐藥率為27.78%（5/18）。

3 結(jié)論

沙門氏菌廣泛存在于自然界，是影響畜牧業(yè)發(fā)展的常見病原菌，也是重要的食源性人畜共患病病原菌之一，并具有多重耐藥性，對全球公共衛(wèi)生安全構(gòu)成威脅［8］。通過對采集自西峽縣部分養(yǎng)雞場疑似感染沙門氏菌病的病死雞的54份器官組織病料進行細菌培養(yǎng)、生化試驗和PCR擴增反應(yīng)，鑒定出18株雞沙門氏菌，檢出率為33.33%（18/54），這表明雞沙門氏菌病在當?shù)剌^為流行。楊瑞等［9］研究發(fā)現(xiàn)，秦皇島地區(qū)雞源沙門氏菌的分離率為17.06%；宋欣媛等［10］研究發(fā)現(xiàn)，昆明周邊養(yǎng)雞場沙門氏菌感染率為16.00%。各地區(qū)雞源沙門氏菌的檢出率不同，可能與養(yǎng)殖環(huán)境、采樣部位、時間、菌株流行程度等因素有關(guān)。沙門氏菌的血清型不同，其致病力也存在差異，確定一個地區(qū)的雞沙門氏菌血清型有助于疫苗研發(fā)和提高防治成效。筆者對18株沙門氏菌進行異性引物PCR擴增和測序驗證，發(fā)現(xiàn)12株為雞白痢沙門氏菌，3株為腸炎沙門氏菌，3株為鼠傷寒沙門氏菌，表明西峽縣雞沙門氏菌流行的優(yōu)勢菌株為雞白痢沙門氏菌。這可為下一步防治明確重點方向。此研究結(jié)果與鞏新廷等［11］、宋艷等［12］的研究結(jié)果基本一致。

由于長期不規(guī)范使用抗生素，雞沙門氏菌的耐藥性較高，嚴重降低了抗生素的治療效果。此研究結(jié)果表明，從西峽縣部分養(yǎng)雞場分離的18株雞源致病性沙門氏菌均具有耐藥性，耐藥種類分布在1種到8種之間，且多重耐藥率（耐3種及3種藥物以上）為88.89%（16/18），以耐5種抗生素的菌株最多，且對氯霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、慶大霉素耐藥性比較嚴重，對四環(huán)素、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、紅霉素、頭孢吡肟較為敏感。這可能與當?shù)仞B(yǎng)雞場臨床使用抗生素習慣、飼養(yǎng)管理模式和菌株致病力等有關(guān)。耐藥性研究結(jié)果表明，西峽縣雞源致病性沙門氏菌的耐藥情況較為嚴重，多重耐藥率較高，可通過輪換用藥、選用敏感性藥物、使用抑菌中草藥等方式來防治雞沙門氏菌病，避免細菌的耐藥性進一步增強。

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