基于轉(zhuǎn)錄組的3種纈草SSR位點(diǎn)信息比較分析

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.05.004

收稿日期：2023-11-10

基金項(xiàng)目：貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目；貴州省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳項(xiàng)目（GZCYTX2023-0302）

作者簡(jiǎn)介：王" 鑫（1992-），男，貴州遵義人，碩士研究生，助理研究員，主要研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。（E-mail）1120375576@qq.com

通訊作者：余" 波，（Tel）15085916661，（E-mail）yubonky@163.com

摘要：" 為研究3種纈草SSR分子標(biāo)記的差異，開(kāi)發(fā)相應(yīng)的引物用于纈草的鑒定及分子育種。本研究采用Excel和MISA軟件對(duì)3種纈草轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用Primer 3.0軟件隨機(jī)設(shè)計(jì)SSR引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證引物的有效性和SSR的多態(tài)性。結(jié)果顯示，纈草Valeriana officinalis L.（VOL）、Valeriana officinalis var. iatifolia Miq.（VOI）及Valeriana officinalis var. officinalis Linn.（VOO）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別包含29 462、40 840和29 280個(gè)序列總數(shù)（Unigene），這些Unigene分別包含7 515、8 046和7 330個(gè)SSR位點(diǎn)。3種纈草的SSR位點(diǎn)的發(fā)生頻率為25.50%、19.71%、25.05%，平均距離為4.16 kb、4.20 kb、4.22 kb。SSR單堿基重復(fù)基元的主要類(lèi)型為A/T型，占SSR總數(shù)的41.76%、41.30%、38.50%。VOL、VOI、VOO 3種纈草的獨(dú)有重復(fù)基元數(shù)量分別是44種、45種、25種。隨機(jī)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增SSR的有效率為77.78%，具有SSR高多態(tài)性的引物占比55.56%?？傊?種纈草的SSR位點(diǎn)具有分布密度高、出現(xiàn)頻率高、重復(fù)基元類(lèi)型多等特點(diǎn)，多態(tài)性好，可為3種纈草后續(xù)的鑒定及分子育種提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：" 纈草；SSR位點(diǎn)；轉(zhuǎn)錄組；PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：" S562""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：" A""" 文章編號(hào)：" 1000-4440（2024）05-0796-10

Comparative analysis of SSR loci information of three Valeriana officinalis L. species based on transcriptome

WANG Xin1，" WU Junda1，" JIANG Lingling1，" ZHOU Jingrui1，" LYU Zhongyun2，" LUO Wenju1，" AI Rong1，" SHU Fuxing2，" XU Haoxiang1，" RAN Jiang1，" LEI Lu1，" ZHONG Xuezhi3，" YU Bo1

（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang 550000， China;2.Zunyi Medical University， Zunyi 563000， China;3.Guizhou Yuntai Xianmu Fine Fruits Co.， Ltd.， Qiandongnan 556200， China）

Abstract：" To study the differences in SSR molecular markers of three Valeriana officinalis L. species， the corresponding primers were developed for the identification and molecular breeding of Valeriana officinalis L. species. In this study， Excel and MISA software were used to analyze the SSR loci data in the transcriptome of three Valeriana officinalis L. species. Primer 3.0 software was used to randomly design SSR primers， and PCR amplification and agarose gel electrophoresis were performed to verify the effectiveness of the primers and the polymorphism of SSR. The results showed that the transcriptome data of Valeriana officinalis L. （VOL）， Valeriana officinalis var. iatifolia Miq. （VOI）， and Valeriana officinalis var. officinalis Linn. （VOO） contained 29 462， 40 840， and 29 280 Unigenes. These Unigenes included 7 515， 8 046， and 7 330 SSR loci， respectively. The occurrence frequency of SSR loci in the three Valeriana officinalis L. species was 25.50%， 19.71%， and 25.05%， with average distance of 4.16 kb， 4.20 kb， and 4.22 kb. The predominant type of single-nucleotide repeat units in SSR was A/T， accounting for 41.76%， 41.30%， 38.50% of the total SSR. The number of unique repeat units of VOL， VOI， VOO was 44， 45 and 25， respectively. The effective rate of SSR amplification by randomly designed primers was 77.78%， and the proportion of highly polymorphic SSR primers was 55.56%. In conclusion， the SSR loci of three Valeriana officinalis L.species exhibited characteristics such as high distribution density， high occurrence frequency， and diverse types of repeat units， indicating good polymorphism. The results of this study can provide a theoretical basis for the subsequent identification and molecular breeding of the three Valeriana officinalis L. species.

Key words：" Valeriana officinalis L.；SSR loci；transcriptome；PCR

纈草（Valeriana officinalis L.）具有悠久的藥用歷史，主要藥用部位為根莖，具有理氣止痛、鎮(zhèn)靜安神、解攣止痛、抗抑郁和抗腫瘤等功效。纈草的用途廣泛，例如其揮發(fā)油可用于藥品和保健品中。纈草作為天然藥物在歐洲銷(xiāo)售額很高，并且居全球植物藥銷(xiāo)售額前10。 中國(guó)纈草資源豐富，共有17個(gè)種和2個(gè)變種，貴州省以寬葉纈草（VOV）分布最廣。隨著市場(chǎng)對(duì)寬葉纈草需求的增加，纈草優(yōu)良種子種苗的需求也日益增長(zhǎng)。然而，纈草的品種會(huì)出現(xiàn)退化，導(dǎo)致藥材質(zhì)量下降等問(wèn)題。不同種類(lèi)的纈草功效各具特色，因此，開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記可以為纈草優(yōu)良品種的選育提供理論和技術(shù)支撐。相關(guān)學(xué)者已經(jīng)意識(shí)到開(kāi)發(fā)纈草分子標(biāo)記的重要性。錢(qián)志瑤等采用試劑盒研究了纈草的擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）方法，然而，這種方法存在一些缺點(diǎn)：首先，由于顯性遮蓋作用，RAPD位點(diǎn)之間的遺傳距離計(jì)算準(zhǔn)確性較低；其次，RAPD方法對(duì)反應(yīng)條件相當(dāng)敏感，如模板濃度和酶濃度，導(dǎo)致重復(fù)性較差。萬(wàn)新利用ITS研究了6種纈草屬的遺傳多樣性，盡管ITS具有高度保守性，但大量研究結(jié)果表明ITS在區(qū)分近似物種方面效果不佳。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）是一種在非基因區(qū)域頻繁出現(xiàn)的串聯(lián)重復(fù)序列，一般由1～6個(gè)堿基組成；在真核和原核生物基因組中分布廣泛。SSR標(biāo)記區(qū)分物種的能力高于RAPD標(biāo)記和ITS標(biāo)記。在許多作物中，QTL數(shù)量性狀位點(diǎn)作圖的首選方法一直是SSR方法。目前，基因組 和轉(zhuǎn)錄組 是大量SSR位點(diǎn)信息的主要來(lái)源。最初，傳統(tǒng)SSR開(kāi)發(fā)過(guò)程繁瑣且失敗率高，造成成本和工作量的增加。EST-SSR是基于轉(zhuǎn)錄組表達(dá)序列信息分析而來(lái)，極大地簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)SSR的開(kāi)發(fā)程序。雖然已經(jīng)有關(guān)于寬葉纈草轉(zhuǎn)錄組的報(bào)道，但NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)中可查閱的纈草的EST序列非常有限，基于轉(zhuǎn)錄組的SSR位點(diǎn)信息尚未見(jiàn)報(bào)道。通常，為了能夠檢驗(yàn)EST-SSR的有效性，常常會(huì)設(shè)計(jì)隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，并開(kāi)發(fā)出具有高多態(tài)性的引物為后續(xù)植株鑒定或者分子育種提供基礎(chǔ)。

本研究旨在對(duì)3種纈草進(jìn)行SSR分析，并設(shè)計(jì)引物進(jìn)行凝膠電泳驗(yàn)證，以便從分子水平上區(qū)分這3個(gè)變種并輔助纈草的分子育種。

1" 材料與方法

1.1" 材料

3種纈草變種來(lái)自中國(guó)貴州省銅仁市江口縣黃柏山村（海拔337 m，東經(jīng)105°51′15″，北緯28°32′13″），3種纈草變種在同樣環(huán)境的種植基地種植，生長(zhǎng)旺盛，無(wú)病蟲(chóng)害發(fā)生，經(jīng)過(guò)貴州大學(xué)植物物種鑒定中心鑒定，3種供試?yán)i草為不同的變種，分別為：Valeriana officinalis L.（VOL）、Valeriana officinalis var. iatifolia Miq.（VOI）及Valeriana officinalis var. officinalis Linn. （VOO）。

1.2" 方法

對(duì)3種纈草的葉長(zhǎng)、葉寬、株高進(jìn)行測(cè)量，每組重復(fù)3次。對(duì)3種纈草葉片拍照進(jìn)行外觀差異比較。采集纈草新長(zhǎng)出的葉子，每個(gè)樣本重復(fù)4次，立即將其放入液氮中冷凍，并在冷凍管中保存，樣品轉(zhuǎn)錄組由北京諾禾致源科技股份有限公司測(cè)序。之后，參考舒福興等的方法，聯(lián)合MISA在線網(wǎng)站（https：//webblast.ipk-gatersleben.de/misa/）和Excel軟件對(duì)SSR位點(diǎn)進(jìn)行分析。同時(shí)利用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)3種纈草的SSR隨機(jī)引物，并從每種纈草中隨機(jī)挑選3對(duì)引物進(jìn)行后續(xù)SSR凝膠電泳分析，引物信息見(jiàn)表1。DNA的提取方法、PCR及瓊脂糖凝膠電泳方法參考忻雅等的方法。

1.3" 統(tǒng)計(jì)分析方法

使用Excel軟件和仙桃學(xué)術(shù)（https：//www.xiantaozi.com/）在線分析軟件繪制圖表，3種纈草的生物學(xué)性狀數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用單因素方差分析比較不同組間的差異性。同時(shí)，利用Excel和MISA軟件對(duì)SSR重復(fù)單元的類(lèi)型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用韋恩圖對(duì)3種纈草獨(dú)有的SSR重復(fù)基元進(jìn)行分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 3種纈草的生物學(xué)性狀分析

從圖1A可見(jiàn)，3種纈草葉型外觀有明顯的區(qū)別。由圖1B所示，VOL、VOI、VOO的葉寬分別為6.47±0.06 cm、7.17±0.29 cm、6.73±0.64 cm，三者之間差異不顯著；VOL、VOI、VOO的葉長(zhǎng)分別為10.57±0.51 cm、15.67±1.15 cm、9.57±0.97 cm，VOI與VOL、VOO之間差異顯著，VOL和VOO之間差異不顯著。VOL、VOI、VOO的株高分別為33.17±3.25 cm、43.17±0.76 cm、16.30±0.75 cm，VOL與VOO、VOI與VOO之間存在顯著差異。

2.2" 3種纈草轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的分布特征

測(cè)序結(jié)果顯示，3種纈草轉(zhuǎn)錄組序列總長(zhǎng)度從高到低順序?yàn)閂OIgt;VOLgt;VOO，3種纈草總序列數(shù)量從高到底排序與序列總長(zhǎng)度的排序一致。含有SSR的序列數(shù)從高到底的排序?yàn)閂OIgt;VOOgt;VOL。VOI的各項(xiàng)數(shù)值均高于其他纈草變種（表2）。

2.3" 3種纈草轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的重復(fù)基元類(lèi)型及占比

從表3可見(jiàn)，3種纈草存在多種SSR重復(fù)基元類(lèi)型，不同的基元類(lèi)型在數(shù)量上有差異。其中，單堿基重復(fù)類(lèi)型最多。在VOL、VOI、VOO中，分別有3 150個(gè)、3 336個(gè)、2 848個(gè)單堿基重復(fù)類(lèi)型，分別占本變種SSR總量的41.92%、41.46%和38.85%。3種纈草中，VOI的單堿基重復(fù)類(lèi)型最多，VOO最少。二堿基重復(fù)類(lèi)型在各變種中數(shù)量居第2位，分別為2 413個(gè)、2 696個(gè)和 2 737個(gè)，分別占本變種SSR總數(shù)的32.11%、33.51 %和37.34%。VOO的二堿基重復(fù)類(lèi)型數(shù)量和比例都超過(guò)VOL和VOI。三堿基重復(fù)類(lèi)型在各變種中數(shù)量居第3位，分別為1 592個(gè)、1 678個(gè)和1 492個(gè)，占本變種SSR總數(shù)的21.18%、20.86%和20.35%。其他基元重復(fù)類(lèi)型的比例較低，3個(gè)變種中剩余3種基元重復(fù)類(lèi)型的總和分別占本變種SSR總數(shù)的4.79%、4.18%和3.47%?？傮w而言，基元中包含的堿基數(shù)越多，基元類(lèi)型的數(shù)量就越少。從SSR的出現(xiàn)頻率來(lái)看，VOL、VOI、VOO分別為25.50%、19.71%及25.05%。其中，具有單堿基重復(fù)基元的出現(xiàn)頻率分別為10.69%、8.17%和9.73%；二堿基重復(fù)基元的出現(xiàn)頻率分別為8.19%、6.60%和9.35%；三堿基重復(fù)基元的出現(xiàn)頻率分別為5.40%、4.11% 和5.10%；其他類(lèi)型重復(fù)基元出現(xiàn)頻率很低。整體上，3種纈草中的單堿基、二堿基和三堿基SSR是優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，在各種纈草變種本身及纈草變種之間的出現(xiàn)頻率均不相同。VOL、VOI、VOO 的SSR平均距離分別為4.16 kb、4.20 kb和4.22 kb?？傮w上，隨著重復(fù)基元所含堿基數(shù)的增加，SSR的遺傳距離會(huì)變長(zhǎng)。

2.4" 3種纈草轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)基元堿基組成分析

通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，在VOL的SSR重復(fù)基元中，共發(fā)現(xiàn)堿基組成類(lèi)型145種。單堿基基元至六堿基基元的堿基組成類(lèi)型分別有2種、4種、10種、24種、49種和56種。在VOI的SSR重復(fù)基元中，共有堿基組成類(lèi)型139種。單堿基基元至六堿基基元的堿基組成類(lèi)型分別有2種、4種、10種、20種、40種和63種。在VOO的SSR重復(fù)基元中，共發(fā)現(xiàn)堿基組成類(lèi)型113種。單堿基基元至六堿基基元的堿基組成類(lèi)型分別有2種、4種、10種、22種、26種和49種。

對(duì)3種纈草中排名前20的堿基組成類(lèi)型占比分析發(fā)現(xiàn)，A/T、AT/AT、AC/GT、AAG/CTT入圍前4，其余類(lèi)型占比較低（圖2）。3種纈草共有55種重復(fù)基元的堿基組成類(lèi)型相同，而VOL、VOI、VOO各自獨(dú)有的重復(fù)基元的堿基組成類(lèi)型分別為44種、45種、25種（圖3）。獨(dú)有重復(fù)基元的堿基組成類(lèi)型詳見(jiàn)表4。

2.5" 3種纈草SSR多態(tài)性分析

2.5.1" 3種纈草SSR基元重復(fù)次數(shù)" 從表5可見(jiàn)，3種纈草中，不同堿基類(lèi)型基元的數(shù)量和比例隨著SSR基元重復(fù)次數(shù)的增加而逐步下降。VOL的SSR重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)主要集中在5～20次，共7 149個(gè)，占總數(shù)的95.13%。其中，有4 979個(gè)重復(fù)基元的重復(fù)數(shù)為5～10次（低重復(fù)），占總數(shù)的66.25%；有1 752個(gè)重復(fù)基元的重復(fù)數(shù)為11～15次（中重復(fù)），占總數(shù)的23.31%；有418個(gè)重復(fù)基元的重復(fù)數(shù)為16～20次（高重復(fù)），占總數(shù)的5.56%。在所有基元類(lèi)型中，重復(fù)次數(shù)排前三的依次是10次、6次和5次，分別含有1 265、1 222、1 074個(gè)基元，各占SSR重復(fù)基元總數(shù)的16.83%、16.26%、14.29%。VOI的SSR重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)主要集中在5～20次，共7 626個(gè)，占總數(shù)的94.78%。其中，低重復(fù)基元有5 345個(gè)，

占總數(shù)的66.43%；中重復(fù)基元有1 856個(gè)，占總數(shù)的23.08%；高重復(fù)基元有425個(gè)，占總數(shù)的5.28%。在所有類(lèi)型中，重復(fù)次數(shù)排前三的依次是10次、6次和5次，分別含有1 412、1 313、1 145個(gè)基元，各占SSR重復(fù)基元總數(shù)的17.55%、16.32%、14.23%。VOO的SSR重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)主要集中在5～20次，共7 130個(gè)，占總數(shù)的97.27%。其中，低重復(fù)基元有5 136個(gè)，占總數(shù)的70.07%；中重復(fù)基元有1 655個(gè)，占總數(shù)的22.58%；高重復(fù)基元有339個(gè)，占總數(shù)的4.62%。在所有類(lèi)型中，重復(fù)次數(shù)排前三分別是10次、6次和5次，分別含有1 429、1 309、920個(gè)基元，各占SSR重復(fù)基元總數(shù)的19.50%、17.86%、12.55%。

2.5.2" 纈草高多態(tài)性SSR分析" 從圖4可見(jiàn)，在VOL中，平均長(zhǎng)度lt;12 bp的重復(fù)基元數(shù)量占總數(shù)的20.42%，12～20 bp的占53.45%，≥20 bp的占26.12%。在VOI中，平均長(zhǎng)度lt;12 bp的重復(fù)基元數(shù)量占總數(shù)的20.32%，12～20 bp的占52.19%，≥20 bp的占27.49%。VOO中平均長(zhǎng)度lt;12 bp的重復(fù)基元數(shù)量占總數(shù)的23.27%，12～20 bp的占52.75%，≥20 bp的占23.99%。3種纈草之間，符合高多態(tài)性SSR特征的比例從高到低排序?yàn)閂OIgt;VOLgt;VOO。在VOL中，復(fù)雜混合型重復(fù)單元最長(zhǎng)為306 bp，從單堿基基元到六堿基基元最長(zhǎng)長(zhǎng)度分別為66 bp、58 bp、81 bp、44 bp、40 bp和72 bp。在VOV中，重復(fù)單元最長(zhǎng)的是復(fù)雜混合型，長(zhǎng)度為244 bp，從單堿基基元到六堿基基元最長(zhǎng)長(zhǎng)度分別為76 bp、68 bp、63 bp、60 bp、45 bp和84 bp。VOO中，重復(fù)單元最長(zhǎng)的是復(fù)雜混合型，長(zhǎng)度為269 bp，從單堿基基元到六堿基基元最長(zhǎng)長(zhǎng)度分別為79 bp、62 bp、66 bp、76 bp、50 bp和78 bp。

2.6" 引物的篩選及SSR標(biāo)記的多態(tài)性

從圖5可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增及凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，本研究所設(shè)計(jì)的引物有效率為77.78%；具有高多態(tài)性的引物占比達(dá)55.56%。引物中除了VOI3、VOO2外，其余引物在3種纈草之間均擴(kuò)增出大小不同的條帶。其中VOL1、VOL2、VOL3、VOI1和VOO3擴(kuò)增出的SSR條帶多態(tài)性良好，能明確鑒定出3種纈草；而VOI2可以鑒定出VOO，但對(duì)VOI和VOL無(wú)法進(jìn)行有效區(qū)分；VOO1能有效鑒定VOO與其他2種纈草的區(qū)別，但區(qū)分VOI與VOL的能力較差。

3" 討論

纈草中含有多種具有藥用價(jià)值的成分。例如：纈草作為治療胃腸道疾病和焦慮癥的中藥被收錄于《中國(guó)藥典》。對(duì)纈草SSR分子標(biāo)記的研究及相關(guān)引物的開(kāi)發(fā)對(duì)纈草雜交育種和混合樣品的鑒定等有較大的理論和應(yīng)用價(jià)值。然而，關(guān)于纈草SSR的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。盡管有許多研究SSR的方法，例如ISSR-PCR方法、磁珠富集法，但這些方法在挖掘數(shù)量和可用性上遠(yuǎn)不如轉(zhuǎn)錄組法。利用轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行SSR位點(diǎn)分析已經(jīng)在多種植物上得到應(yīng)用，尤其是針對(duì)無(wú)基因組信息的植物，轉(zhuǎn)錄組法可以提供大量的標(biāo)記信息。由此可見(jiàn)，有必要通過(guò)纈草轉(zhuǎn)錄組分析SSR位點(diǎn)。

從生物學(xué)性狀上看，3種纈草在葉型上存在很大的差異，由于其生境相同，排除地理隔離引起的差異，葉型差異可能是由于遺傳因素引起，那么其核酸水平可能存在差異。轉(zhuǎn)錄組序列分析結(jié)果顯示，VOL、VOI、VOO 3種纈草測(cè)得的序列長(zhǎng)度分別為31 253 766 bp、33 795 128 bp、30 941 295 bp，對(duì)應(yīng)29 462個(gè)、40 840個(gè)、29 280個(gè)序列總數(shù)，分別獲得7 515個(gè)、8 046個(gè)、7 330個(gè)SSR，出現(xiàn)頻率分別為25.50%、19.71%、25.05%。VOL和VOO的SSR出現(xiàn)頻率高于柴胡（20.08%）及雜花苜蓿（20.03%），低于大麻（33.10%）及睡蓮（33.98%），而VOI的SSR出現(xiàn)頻率均低于上述植物。VOL、VOI、VOO 3種纈草的轉(zhuǎn)錄組SSR分布的平均距離分別為4.16 kb、4.20 kb、4.22 kb，與其他植物相比，VOL、VOI、VOO轉(zhuǎn)錄組SSR分布的平均距離高于苜蓿、白及、南美蟛蜞菊，低于半夏、紅花。這可能與植物遺傳背景和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)有關(guān)。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)3種纈草在SSR出現(xiàn)頻率上表現(xiàn)出差異性，VOL和VOO的差異不大，但是二者與VOI之間的差異較大。這說(shuō)明纈草不同變種之間轉(zhuǎn)錄水平不同，因此有必要對(duì)其他纈草變種進(jìn)行研究。總體來(lái)說(shuō)，3種纈草的SSR種類(lèi)和數(shù)量都比較豐富，可以為纈草育種提供依據(jù)。

3種纈草的SSR均以單堿基最多，這與南美蟛蜞菊、睡蓮、大麻一致，而柴胡的SSR以二堿基最多，這種差異可能來(lái)自種屬之間的差異。3種纈草中單堿基A/T型是最多的重復(fù)基元類(lèi)型，與大多數(shù)植物的SSR優(yōu)勢(shì)重復(fù)類(lèi)型一致；二堿基、三堿基的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元僅有輕微差異，而四堿基、五堿基、六堿基基元重復(fù)類(lèi)型數(shù)量上三者之間出現(xiàn)非常大的差異，3種纈草獨(dú)有的重復(fù)基元全部集中在四堿基、五堿基、六堿基重復(fù)基元類(lèi)型上。這說(shuō)明具有這些重復(fù)基元的SSR具有區(qū)分3種纈草的分子標(biāo)記的潛力，而這些SSR所在序列的表達(dá)可能是3種纈草生長(zhǎng)發(fā)育或者代謝產(chǎn)物差異的重要基礎(chǔ)。

大量的研究結(jié)果表明， SSR重復(fù)基元長(zhǎng)度＜12 bp，多態(tài)性極低。SSR重復(fù)基元重復(fù)的次數(shù)≥12次時(shí)，多態(tài)性標(biāo)記的開(kāi)發(fā)潛力隨著重復(fù)次數(shù)的增加逐漸增大。本研究中，VOL、VOI、VOO 3種纈草不同SSR重復(fù)基元重復(fù)次數(shù)主要集中在5～20次，所占比例分別為95.13%、94.78%、97.27%，重復(fù)基元長(zhǎng)度≥20 bp的比例分別為26.12%、27.49%、23.99%。這表明3種纈草轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)理論上具有較大開(kāi)發(fā)潛力。本研究發(fā)現(xiàn)3種纈草之間存在獨(dú)有的SSR重復(fù)基元類(lèi)型，這些類(lèi)型對(duì)3種纈草的分子育種具有重要作用。但是根據(jù)之前在各個(gè)物種中利用轉(zhuǎn)錄組分析的SSR均采取了隨機(jī)引物驗(yàn)證，本研究也通過(guò)隨機(jī)設(shè)計(jì)的引物及3種纈草DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)引物有效率為77.78%，其中引物VOL1、VOL2、VOL3、VOI1和VOO3擴(kuò)增出的SSR條帶多態(tài)性良好，能明確鑒定出3種纈草；而引物VOI2可以鑒定出VOO，但對(duì)VOI和VOL無(wú)法進(jìn)行有效區(qū)分；引物VOO1能有效鑒定VOO與其他2種纈草的區(qū)別，但區(qū)分VOI和VOL的能力較差。在山東銀蓮花中引物有效率為68%，高多態(tài)性引物只占11%；在辣椒中引物有效率為93.10%，多態(tài)率為17.24%，本研究的引物高多態(tài)率（55.56%）比銀蓮花和辣椒高，引物有效率居中?？蔀楹笃诶i草分子育種及鑒定等方面提供理論依據(jù)及具體引物。

4" 結(jié)論

3 種纈草的轉(zhuǎn)錄組中，SSR位點(diǎn)分布密度大、重復(fù)基元類(lèi)型豐富、出現(xiàn)頻率高，本研究篩選出高多態(tài)性標(biāo)記SSR隨機(jī)引物5對(duì)，可以為進(jìn)一步研究纈草遺傳多樣性和分子標(biāo)記輔助育種提供理論基礎(chǔ)及具體引物。

參考文獻(xiàn)：

張進(jìn)芳. 銅仁寬葉纈草的研究現(xiàn)狀與展望. 廣東化工，2021，48（18）：107-147.

李文杰，李美陽(yáng). 藥用植物纈草的研究進(jìn)展. 北方園藝，2019（12）：139-145.

劉慶軍，沈鶴霄，李國(guó)龍，等. 纈草在制備促進(jìn)腸道有益菌增殖的產(chǎn)品中的應(yīng)用：CN113768996B. 2022-08-26.

彭建玉，李宗悟，賈金迪，等. 一種心神安膠囊的中藥組成物及其制備方法：CN115040604A. 2022-09-13.

熊義濤，喻小軍，蔡" 凱，等. 一種治療痛經(jīng)的中藥及其制備方法和用途：CN112472755B. 2022-06-07.

胡祥正，丁增尼瑪. 一種具有安神抗菌效果的香水及其制備方法：CN116139047A. 2023-05-23.

謝小麗，于福來(lái)，王" 凱，等. 一種含纈草油與艾納香油的復(fù)合微乳面膜液及其制備方法：CN114306154B. 2023-05-19.

聶鮮鈺，陸春云，文大成，等. 寬葉纈草種苗分級(jí)及其對(duì)產(chǎn)量質(zhì)量的影響. 種子，2020，39（10）：151-154.

王茹靜，黃" 青，雍" 妍，等. 纈草屬植物的化學(xué)成分及生物活性研究概況. 中國(guó)中藥雜志，2016，41（8）：1405-1414.

錢(qián)志瑤，周" 鎂，黃秀平，等. 黔產(chǎn)寬葉纈草的RAPD分析. 中成藥，2015，37（8）：1751-1756.

萬(wàn) ""新. 纈草屬常用藥用植物形態(tài)特征、光譜鑒別及ITS序列研究. 北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2007.

王" 滑，閻亞波，張俊佩，等. 應(yīng)用ITS序列及SSR標(biāo)記分析核桃與鐵核桃親緣關(guān)系. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，33（6）：35-38.

董" 巖，陳" 輝，趙明文，等. 真姬菇栽培菌株的ITS和SSR分析. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25（3）：59-64.

舒福興，黃" 瑤，賈" 啟，等. 胡蘿卜果膠桿菌侵染下半夏轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)信息分析. 種子，2023，42（2）：116-120.

DUHAN N， KAUNDAL R. LegumeSSRdb：a comprehensive microsatellite marker database of legumes for germplasm characterization and crop improvement. International Journal of Molecular Sciences，2021，22（21）：11350.

李卓蔚，邱" 遷，郎佳琪，等. 尖刀唇石斛和翅梗石斛葉綠體全基因組分析. 中草藥，2022，53（16）：5159-5169.

李衛(wèi)崗，張文生，吳潔珊，等. 一組用于鑒別茶枝柑品種的SSR引物組成及其應(yīng)用：CN116574835A. 2023-08-11.

顏鳳霞，王蓮輝，田" 凡，等. 長(zhǎng)瓣兜蘭花2個(gè)不同時(shí)期轉(zhuǎn)錄組分析. 種子，2021，40（5）：91-97.

李怡鵬，石" 林，楊夢(mèng)飛，等. 基于EST-SSR標(biāo)記的19份子蓮品種資源遺傳多樣性分析. 種子，2022，41（2）：65-69.

PARK Y J， LI X， NOH S J， et al. Transcriptome and metabolome analysis in shoot and root of Valeriana fauriei. BMC Genomics，2016，17：303.

聶智星，傅鴻妃，李高青，等. 辣椒花藥轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)信息分析及標(biāo)記開(kāi)發(fā). 分子植物育種，2023，21（23）：7803-7810.

楊" 也，李勝輝，張素勤，等. 蜜本南瓜EST-SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)及多態(tài)性分析. 分子植物育種，2024，22（6）：1934-1943.

忻" 雅，崔海瑞，盧美貞，等. 白菜EST-SSR信息分析與標(biāo)記的建立. 園藝學(xué)報(bào)，2006，（3）：549-554.

孟繁旭. 歐洲纈草根的活性成分分析及其揮發(fā)性成分鑒定. 延吉：延邊大學(xué)，2022.

錢(qián)志瑤，周道堂，黃秀平，等. 黔產(chǎn)寬葉纈草ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化. 生物技術(shù)通報(bào)，2015，31（7）：69-75.

富" 貴，李軍喬，包錦淵，等. 磁珠富集法開(kāi)發(fā)蕨麻SSR標(biāo)記引物. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2018，27（2）：124-134.

劉小飛，任桂萍，余超然，等. 基于SSR標(biāo)記的12個(gè)非洲菊品種指紋圖譜構(gòu)建及雜交F1后代鑒定. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，50（9）：16-24. DOI：10.16768/j.issn.1004-874X.2023.09.002.

張" 興，馮嘉馨，陳" 佳，等. 雄性不育枸杞花藥比較轉(zhuǎn)錄組分析. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2022，41（6）：1274-1285.

伍" 越，王甜甜，李澤秀，等. 木瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及其遺傳多樣性分析. 植物生理學(xué)報(bào)，2021，57（4）：847-861.

肖雨沙，陳秀清，李紅春，等. 基于南美蟛蜞菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及鑒定. 分子植物育種，2021，19（7）：2293-2299.

羅芊芊，李峰卿，肖德卿，等. 兩個(gè)南方紅豆杉天然居群的交配系統(tǒng)分析. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2023，47（5）：80-86.

錢(qián)麗華，嚴(yán)建立，吳曉疆，等. 基于滇黃精轉(zhuǎn)錄組序列的SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)及其在黃精屬資源分析中的應(yīng)用. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2023，39（5）：1120-1131.

吳民華，葉曉霞，譚靖怡，等. 密花豆葉綠體基因組序列特征及密碼子偏好性分析. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2023，54（6）：1633-1645.

楊宇婷，張" 強(qiáng). 甜葉菊多倍體變異機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組及SSR分析. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，51（2）：44-50.

呂" 鋒，解孝滿，韓" 彪，等. 基于SSR標(biāo)記的麻櫟天然群體遺傳多樣性分析. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2022，46（3）：109-116.

劉" 迪，歐陽(yáng)艷飛，徐" 鵬，等. 柴胡轉(zhuǎn)錄組SSR的分布及序列特征分析. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2022，53（3）：676-683.

王彬彬，高妍夏，郭欣慰，等. 基于高通量測(cè)序的北柴胡根轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)信息分析. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2024，33（4）：707-717.

徐" 舶，石鳳翎，烏日娜，等. 草原1號(hào)雜花苜?；ɡ俎D(zhuǎn)錄組SSR序列特征. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2021，49（8）：17-24.

陶" 杰，張江江，常" 麗，等. 鹽脅迫下大麻SSR標(biāo)記的分布特征分析. 中國(guó)麻業(yè)科學(xué)，2022，44（1）：5-12.

蘇" 群，田" 敏，劉" 俊，等. 基于生物信息學(xué)的睡蓮SSR位點(diǎn)特征分析. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2021，34（10）：2076-2083.

陳紅波. 基于白及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的EST-SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)、驗(yàn)證及應(yīng)用. 遵義：遵義醫(yī)科大學(xué)，2019.

肖雨沙，陳秀清，李紅春，等. 基于南美蟛蜞菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及鑒定. 分子植物育種，2021，19（7）：2293-2299.

陳賢軍. 基于SSR和InDel標(biāo)記的紅花遺傳圖譜構(gòu)建與遺傳多樣性分析.武漢：中南民族大學(xué)，2020.

梁燕妮，黃銀霞，魏詩(shī)琴，等. 紫芽六堡茶轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)序列分析. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，50（3）：42-48.

蔣路園，吳文麗，張愷愷，等. 南方紅豆杉轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)分析及其分子標(biāo)記開(kāi)發(fā). 中草藥，2024，55（3）：928-936.

陳凱凌，武" 濤，徐逸群，等. 燕麥全基因組SSR位點(diǎn)鑒定及多態(tài)性標(biāo)記開(kāi)發(fā). 生物技術(shù)通報(bào)，2024，40（2）：120-129.

THAO D V， YAMASHITA M， WATANABE A， et al. Development of tetranucleotide microsatellite markers in Pinus kesiya Royle ex Gordon. Conservation Genetics Resources，2013，5（2）：405-407.

（責(zé)任編輯：黃克玲）