葡萄IRT基因的克隆、鑒定及其對氨基酸-鐵復(fù)合肥的響應(yīng)特征

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.05.016

收稿日期：2023-04-15

基金項(xiàng)目：山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（重大科技創(chuàng)新工程）（2022CXGC010605）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-29-17）；國家留學(xué)基金項(xiàng)目（202208370080）；煙臺市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020XCZX026）

作者簡介：鄭秋玲（1983-），女，山東菏澤人，碩士，助理研究員，主要從事葡萄遺傳育種與分子生物學(xué)研究。（Tel）15165769956；（E-mail）zhengql0225@163.com

通訊作者：宋志忠，（E-mail）Szhzh2000@163.com

摘要：" 為揭示葡萄鐵素吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制，明確鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因VvIRT在葡萄果實(shí)不同發(fā)育時期的表達(dá)差異及其對葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥的響應(yīng)特征，本研究以煙釀1號為材料，分離并克隆葡萄鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因IRT，分析IRT基因分布、結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白質(zhì)的保守基序等特征；設(shè)置葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥處理，利用實(shí)時熒光定量PCR分析煙釀1號IRT基因在果實(shí)不同發(fā)育時期的表達(dá)差異及其對葉面噴施處理的響應(yīng)特征。結(jié)果表明：在葡萄基因組中克隆得到10個VvIRT基因（VvIRT1～VvIRT10），分布在7條染色體上。其編碼蛋白質(zhì)均含有Fe2+ 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或鋅/鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體（PF02535），屬于典型的鐵調(diào)節(jié)蛋白。VvIRT1、VvIRT2、VvIRT4、VvIRT5、VvIRT8等基因編碼的蛋白質(zhì)屬于堿性蛋白質(zhì)，而其他5個蛋白質(zhì)屬于酸性蛋白質(zhì)。VvIRT5蛋白和VvIRT8蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白，其他8個蛋白為穩(wěn)定蛋白。VvIRT7蛋白主要定位于液泡膜，其他蛋白質(zhì)均主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜。VvIRT7在葡萄果實(shí)不同發(fā)育時期各組織中的整體表達(dá)水平都是最高的，其次為VvIRT9和VvIRT6，而VvIRT1、VvIRT3、VvIRT5、VvIRT8和VvIRT10在葡萄果實(shí)發(fā)育過程中均無表達(dá)。葉面噴施鐵肥處理下， 韌皮部中VvIRT7表達(dá)量和果實(shí)及韌皮部中VvIRT9表達(dá)量在花后35 d（幼果期）至70 d（轉(zhuǎn)色期）明顯增加，而在花后85 d（第2次膨大期）至115 d（成熟期），韌皮部和葉片中VvIRT7和VvIRT9表達(dá)量明顯減少。因此，葡萄VvIRT基因?qū)θ~面噴施鐵肥的響應(yīng)特征與果實(shí)發(fā)育時期及器官類型密切相關(guān)，VvIRT7、VvIRT9基因編碼蛋白質(zhì)是葡萄果實(shí)發(fā)育過程中2個重要的鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

關(guān)鍵詞：" 葡萄；鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；鐵肥；VvIRT基因

中圖分類號：" Q786；S663.1""" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）05-0913-09

Cloning and identification of IRT genes and their response to amino acid-iron compound fertilizer in grape

ZHENG Qiuling1，2，" WANG Jianping1，" XIAO Huilin1，" SHI Shengpeng3，" NING Youzheng3，" DU Yuanpeng4，5，" GUAN Xueqiang5，" TANG Meiling1，2，5，" SONG Zhizhong1，2，3

（1.Shandong Engineering Research Center for Grape Breeding and Cultivation， Yantai Academy of Agricultural Sciences， Yantai 265500， China;2.The Engineering Research Institute of Agriculture and Forestry， Ludong University， Yantai 264025， China;3.Department of Plant Science， University of Cambridge， Cambridge CB2 3EA， United Kingdom;4.College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agriculture University， Tai’an 271018， China；5.Shandong Technology Innovation Center of Wine Grape and Wine/COFCO Great Wall Wine （Penglai） Co.， Ltd.， Yantai 264000， China）

Abstract：" In order to reveal the molecular mechanism of iron absorption and transport in grape， and to clarify the expression difference of iron regulatory transporter gene VvIRT in different development stages of grape fruit and its response characteristics to foliar application of amino acid-iron compound fertilizer， Yanniang 1 was used as the material in this study. The IRT encoding iron regulatory transporter was isolated and cloned， and the distribution and structure of IRT gene and conserved motifs of proteins encoded by IRT gene were analyzed. The expression difference of IRT gene in different development stages of Yanniang 1 fruit and its response characteristics to foliar spraying treatment were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that 10 VvIRT genes （VvIRT1-VvIRT10） were cloned from the grape genome and distributed on seven chromosomes. The encoded proteins contained Fe2+ transporters or zinc/iron transporters （PF02535）， which were typical iron regulatory proteins. The proteins encoded by VvIRT1， VvIRT2， VvIRT4， VvIRT5 and VvIRT8 were alkaline proteins， while the other five proteins were acidic proteins. VvIRT5 protein and VvIRT8 protein were unstable proteins， and the other eight proteins were stable proteins. The VvIRT7 protein was mainly located in the vacuolar membrane， and the other proteins were mainly located in the plasma membrane. The overall expression level of VvIRT7 was the highest in all tissues at different developmental stages of grape fruit， followed by VvIRT9 and VvIRT6， while VvIRT1， VvIRT3， VvIRT5， VvIRT8 and VvIRT10 were not expressed during the development of grape fruit. Under foliar application of iron fertilizer， the expression levels of VvIRT7 in phloem and VvIRT9 in fruit and phloem increased significantly from 35 d after flowering （young fruit stage） to 70 d after flowering （veraison stage）， while the expression levels of VvIRT7 and VvIRT9 in phloem and leaves decreased significantly from 85 d after flowering （second expansion stage） to 115 d after flowering （mature stage）. Therefore， the response characteristics of VvIRT gene to foliar application of iron fertilizer are closely related to fruit development stage and organ type. The proteins encoded by VvIRT7 and VvIRT9 genes are two important iron regulatory transporters during grape fruit development.

Key words：" grape;iron-regulated transporter;iron fertilizer;VvIRT gene

鐵（Fe）是植物生長發(fā)育不可或缺的微量元素之一，參與植物光合作用、呼吸作用和DNA修復(fù)等多種代謝途徑或生命過程。水果生產(chǎn)中，鐵肥的施用與果實(shí)品質(zhì)和果實(shí)產(chǎn)量密切相關(guān)，土壤中鐵素虧缺不但限制果樹的生長和發(fā)育，還將導(dǎo)致水果產(chǎn)量減少和品質(zhì)降低。

土壤中的鐵多為Fe3+，植物根系難以直接吸收和利用。植物正常生長所需鐵濃度為1×10-9～1×10-4mol/L，而通常土壤中Fe2+和Fe3+的濃度通常低于1×10-15mol/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足植物生長的基本需求。Romheld等最早提出了高等植物為適應(yīng)缺鐵環(huán)境而進(jìn)化出的2種根際鐵吸收策略：策略Ⅰ是通過定位于根細(xì)胞膜表面的H-ATP酶向根際土壤分泌H+，降低根際土壤pH值，促進(jìn)Fe3+的溶解，并通過鐵還原酶FRO將根系周圍的Fe3+還原為Fe2+，再通過定位于細(xì)胞膜上的鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT（iron-regulated transporter）轉(zhuǎn)運(yùn)至根系被植物吸收利用，此機(jī)制常見于雙子葉植物和非禾本科的單子葉植物；策略Ⅱ是通過一系列酶促反應(yīng)合成和分泌麥根酸類物質(zhì)，與根際土壤的Fe3+形成螯合物，由專一的鐵載體PS（Phytosiderophore）吸收途徑被根系吸收利用，此機(jī)制多見于禾本科植物。水稻等部分植物同時存在吸收策略Ⅰ和吸收策略Ⅱ。

鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT在策略 Ⅰ 植物根系轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+的過程中發(fā)揮重要作用，且能調(diào)控Fe3+、Mn2+、Cd2+和 Zn2+等金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。目前，有關(guān)植物鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT的生物學(xué)功能研究主要集中于擬南芥、水稻等模式植物。Eide等最早從擬南芥根部外皮層中克隆到高表達(dá)基因AtIRT1，其表達(dá)水平受缺鐵脅迫誘導(dǎo)，敲除AtIRT1的擬南芥在缺鐵土壤中表現(xiàn)出黃化癥狀，生長嚴(yán)重受阻甚至死亡；酵母異源表達(dá)試驗(yàn)結(jié)果表明AtIRT1具有廣泛的底物特異性，可高效轉(zhuǎn)運(yùn) Fe2+、Mn2+、Cd2 +和 Zn2+離子 。擬南芥AtIRT2在根表皮中的表達(dá)受缺鐵脅迫的誘導(dǎo)，AtIRT2蛋白定位于細(xì)胞囊泡中，不直接參與根系的Fe2+吸收，可能通過區(qū)室化儲存以防止表皮細(xì)胞吸收過多Fe2+而造成的毒害。水稻是特殊的策略 Ⅱ 植物，雖然不能還原Fe3+，但能吸收Fe2+，水稻OsIRT1和OsIRT2蛋白定位在根表皮細(xì)胞質(zhì)膜，具有類似策略Ⅰ植物轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+的功能，能夠轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+和 Cd2+。此外，IRT1同源蛋白在番茄（Solanum lycopersicum）、小金海棠（Malus xiaojinensis）、落花生（Arachis hypgaea）、杜梨（Pyrus betulaefolia）等植物中被鑒定和報(bào)道。然而，有關(guān)IRT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的研究全部集中于植物根部，而在植物其他部分的IRT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作用尚未見報(bào)道。

葡萄（Vitis vinifera L.）是一種深受全球消費(fèi)者喜愛的水果，其基因組信息已被注釋和公布。然而在葡萄鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因VvIRT的特征、葡萄果實(shí)不同發(fā)育時期VvIRT基因的表達(dá)差異及其對葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥的響應(yīng)特征等方面還未見報(bào)道。本研究以山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院自主培育的葡萄新品種煙釀1號為材料，克隆葡萄IRT基因（VvIRT），并通過實(shí)時熒光定量PCR分析煙釀1號花后不同發(fā)育時期不同組織VvIRT的表達(dá)差異及其對葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥的響應(yīng)特征，為解析葡萄鐵素營養(yǎng)吸收與高效利用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 試材及采樣

本研究的供試材料為山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院葡萄資源圃中樹體健壯的5 a生煙釀1號葡萄。葡萄資源圃中葡萄南北行向種植，常規(guī)田間管理。根據(jù)含氨基酸水溶肥料生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)配制氨基酸-鐵水溶性復(fù)合肥，肥料中FeSO4的終含量為1 g/kg。選取長勢一致的葡萄，分別于盛花后28 d、63 d、78 d上午10：00 h（天氣晴朗）進(jìn)行氨基酸-鐵水溶性復(fù)合肥葉面噴施處理，以葉片上的液體均勻滴落為準(zhǔn)。以葉面噴施蒸餾水為對照（CK）。上述處理每5棵作為1組，共噴施3組。參照張璐等方法，分別于盛花后35 d（幼果期）、50 d（硬核期）、70 d（轉(zhuǎn)色期）、85 d（第2次膨大期）、115 d（成熟期）采集葉面鐵肥噴施處理和CK的果實(shí)、結(jié)果枝中間部分的葉片及韌皮部，迅速用液氮處理并置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)重復(fù)3年（2019至2021年），結(jié)果一致，本研究展示2019年的試驗(yàn)結(jié)果。

1.2" 葡萄IRT基因克隆

以擬南芥AtIRT1（AT4G19690）、AtIRT2（AT1G05300）和AtIRT3（AT1G60960）的氨基酸序列為參考，在葡萄基因組數(shù)據(jù)庫Phytozome（http：//www.phytozome.net）中檢索獲得10個潛在的葡萄IRT家族蛋白，檢索結(jié)果在Pfam（http：//pfam.xfam.org/search）在線服務(wù)器均檢測到Fe2+ 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或鋅/鐵轉(zhuǎn)運(yùn)載體（PF02535）功能結(jié)構(gòu)域，屬于典型的鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT。根據(jù)獲得的葡萄IRT家族基因的編碼區(qū)序列（CDS，coding sequence），分別設(shè)計(jì)上下游引物（表1）。利用MiniBEST 植物RNA提取試劑盒（寶生物工程大連有限公司產(chǎn)品）提取煙釀1號組培幼苗的總RNA，通過PrimeScript RT 試劑盒（寶生物工程大連有限公司產(chǎn)品）合成第一鏈cDNA，并以其為模板，借助Prime STAR HS DNA高保真聚合酶（寶生物工程大連有限公司產(chǎn)品）進(jìn)行葡萄IRT家族基因的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序和驗(yàn)證。

1.3 "葡萄IRT家族基因生物信息學(xué)分析

在葡萄基因組數(shù)據(jù)庫Phytozome中獲得葡萄IRT基因的CDS序列及DNA序列，利用Gene Structure Display（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）軟件分析葡萄IRT基因的結(jié)構(gòu)；使用Expasy（http：//web.expasy.org/program/）軟件預(yù)測葡萄IRT蛋白的理論等電點(diǎn)、穩(wěn)定性、總平均親水性（GRAVY，Grand average of hydropathicity）、不穩(wěn)定指數(shù)等理化性質(zhì)；再利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）、PSORT（http：//psort.hgc.jp/form.html）、Mpredict（http：//ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）和SignalP4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）等軟件預(yù)測葡萄IRT蛋白的保守基序（Motif）、保守結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽等。

1.4" 實(shí)時熒光定量PCR分析

利用美國國家生物信息中心（NCBI）網(wǎng)站的Primer-BLAST軟件設(shè)計(jì)葡萄IRT基因的特異性表達(dá)引物（表2），以葡萄Ubiquitin（GenBank No. MH114011）作為內(nèi)參基因。利用SYBR Premix Ex Taq熒光染料（寶生物工程大連有限公司產(chǎn)品），在ABI 7500實(shí)時熒光定量PCR儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品）上檢測不同處理不同組織（果實(shí)、韌皮部和葉片等）葡萄IRT基因的表達(dá)特征。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 s。根據(jù)實(shí)時熒光定量PCR儀得到的各處理Ct值，經(jīng)Ubiquitin均一化處理后，采用2-△△Ct 算法得到不同處理不同組織葡萄IRT基因的相對表達(dá)量及其對葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥的響應(yīng)差異。通過Log2FC （FC為差異倍數(shù)）計(jì)算葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥前后表達(dá)倍數(shù)的變化比值（比值為1，表示沒有顯著性差異，＞1表示上升，＜1表示降低），并通過HemI軟件繪制表達(dá)倍數(shù)變化熱圖。試驗(yàn)設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

1.5" 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用SPSS 19.0（美國IBM公司產(chǎn)品）軟件，選擇t-檢驗(yàn)法進(jìn)行處理間差異顯著性分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 葡萄IRT家族基因的克隆及生物信息學(xué)分析

從煙釀1號葡萄中克隆得到10個IRT基因，分別命名為VvIRT1～VvIRT10（圖1和表3）。VvIRT基因主要定位于1號（VvIRT6）、3號（VvIRT5）、4號（VvIRT4）、6號（VvIRT7和VvIRT10）、10號（VvIRT1和VvIRT2）、13號（VvIRT8）和19號（VvIRT3和VvIRT9）染色體上（表3），每個基因至少含有2個長度不一的內(nèi)含子（圖2）。葡萄VvIRT1～VvIRT8蛋白含有7個保守基序（Motif 1～Motif 7），VvIRT9和VvIRT10蛋白僅含有5個保守基序，缺少M(fèi)otif 1和Motif 3（圖2）。VvIRT1、VvIRT2、VvIRT4、VvIRT5和VvIRT8等5個蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)＞7.00，含有的堿性氨基酸較多；VvIRT7、VvIRT3、VvIRT6、VvIRT9和VvIRT10等5個蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)＜7.00，含有酸性氨基酸較多。VvIRT蛋白均含有7～11個跨膜區(qū)，僅VvIRT1、VvIRT2、VvIRT3和VvIRT10蛋白擁有信號肽。VvIRT1～VvIRT10蛋白的總平均親水性指數(shù)均大于0，屬于疏水蛋白質(zhì)；VvIRT5和VvIRT8的不穩(wěn)定指數(shù)＞40，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，而其他8個成員不穩(wěn)定指數(shù)均＜40，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)（表3）。

2.2" VvIRT蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測

不同VvIRT蛋白呈現(xiàn)不同的亞細(xì)胞定位特征。VvIRT7蛋白主要定位于液泡膜和細(xì)胞質(zhì)膜。其余VvIRT蛋白全都主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜，其次是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（VvIRT1、VvIRT4、VvIRT5、VvIRT8、VvIRT9和VvIRT10）、高爾基體（VvIRT1、VvIRT2、VvIRT3、VvIRT6和VvIRT9）和液泡膜（VvIRT1、VvIRT4和VvIRT6）；此外，VvIRT5、VvIRT10和VvIRT9在葉綠體上、VvIRT4和VvIRT8在細(xì)胞核上也有少量分布，VvIRT4和VvIRT5分別在細(xì)胞質(zhì)和線粒體上也有少量分布（表4）。

2.3" VvIRT在果實(shí)發(fā)育不同時期的表達(dá)模式

花后不同時期，煙釀1號葡萄果實(shí)、韌皮部、葉片VvIRT1～VvIRT10基因的表達(dá)量存在差異（圖3）。在葡萄花后不同時期各組織中VvIRT7基因的整體表達(dá)水平都是最高的，且相對表達(dá)量最大值出現(xiàn)在花后70 d（轉(zhuǎn)色期）的葡萄果實(shí)中；表達(dá)水平次之的是VvIRT9和VvIRT6，相對表達(dá)量最大值分別出現(xiàn)在花后50 d（硬核期）的葉片中和花后70 d（轉(zhuǎn)色期）的葡萄果實(shí)中。在花后70 d （轉(zhuǎn)色期）的葉片中VvIRT2基因和花后85 d（第2次膨大期）和115 d（成熟期）的葡萄果實(shí)、韌皮部、葉片中VvIRT4基因均有微量表達(dá)（相對表達(dá)量＜0.065）；而 VvIRT1、VvIRT3、VvIRT5、VvIRT8和VvIRT10等5個基因在不同時期的葡萄采樣組織中均無表達(dá)。從發(fā)育時期上看，在花后35 d（幼果期）到50 d（硬核期），VvIRT7、VvIRT9和VvIRT6在葉片中的相對表達(dá)量遠(yuǎn)高于果實(shí)和韌皮部，其中以VvIRT7和VvIRT9尤為突出；而花后70 d（轉(zhuǎn)色期）至115 d（成熟期），VvIRT7在葡萄果實(shí)中相對表達(dá)最高，其次為韌皮部和葉片，且始終維持較高的表達(dá)水平（相對表達(dá)量＞1.00），而VvIRT9在韌皮部和葉片中特異表達(dá)，而果實(shí)中的相對表達(dá)量極低；VvIRT6僅在花后70 d（轉(zhuǎn)色期）的果實(shí)中相對表達(dá)量較高，而從花后85 d（第2次膨大期）至115 d（成熟期）在葡萄果實(shí)、韌皮部、葉片中的相對表達(dá)量都在0.07以下（圖3）。

2.4" VvIRT對葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥處理的響應(yīng)差異

葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥處理后，花后不同發(fā)育時期煙釀1號葡萄果實(shí)、韌皮部、葉片中VvIRT1～VvIRT10基因的表達(dá)倍數(shù)存在較大的差異（圖4）。葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥處理后，花后35 d（幼果期）至70 d（轉(zhuǎn)色期），果實(shí)、韌皮部、葉片中VvIRT7和VvIRT9基因的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，其中，以韌皮部最為明顯；而花后85 d（第2次膨大期）至115 d（成熟期），韌皮部和葉片中VvIRT7和VvIRT9的表達(dá)水平顯著降低；同樣，葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥處理后韌皮部和葉片中VvIRT6的表達(dá)水平在花后35 d（幼果期）至70 d（轉(zhuǎn)色期）內(nèi)得到增強(qiáng)。雖然VvIRT2整體表達(dá)量相對較低，但在葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥處理后，韌皮部和葉片中的表達(dá)量在花后35 d（幼果期）至115 d（成熟期）都得到提升；而同樣整體表達(dá)量相對較低的基因VvIRT4，在葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥處理后，表達(dá)量變化不大。雖然CK中，在不同時期的葡萄果實(shí)、韌皮部、葉片中VvIRT3基因均無表達(dá)，但在葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥處理中，花后35 d（幼果期）至70 d（轉(zhuǎn)色期）內(nèi)葡萄果實(shí)、韌皮部和葉片中VvIRT3基因均有表達(dá)。在葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥處理中，葡萄果實(shí)、韌皮部和葉片中均沒有檢測到VvIRT1、VvIRT5、VvIRT8和VvIRT10等4個基因的表達(dá)，與CK一致。

3" 討論

3.1" VvIRT蛋白結(jié)構(gòu)及定位特征

鐵在水果果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量形成方面發(fā)揮重要作用。然而，果樹中鐵素吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的生物學(xué)功能依然研究甚少。葡萄屬于雙子葉植物，其鐵素吸收方式屬于策略Ⅰ，但目前葡萄鐵吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制尚未見報(bào)道。

本研究從煙釀1號葡萄中克隆并鑒定出10個VvIRT基因，葡萄不同VvIRT蛋白含有的保守基序數(shù)量存在差異，進(jìn)化關(guān)系較近的VvIRT9和VvIRT10蛋白質(zhì)具有一致的保守基序，比VvIRT1～VvIRT8蛋白少2個保守基序，這可能會導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)具有不同的生物學(xué)功能，這也說明同一家族的葡萄鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)（IRT）不同成員之間雖然遺傳關(guān)系相近，但在長期進(jìn)化過程中其功能可能發(fā)生了演變。小金海棠、落花生、擬南芥、水稻等植物的IRT蛋白主要定位于根表皮細(xì)胞質(zhì)膜上，本研究發(fā)現(xiàn)葡萄中除VvIRT7蛋白主要定位于液泡膜外，其他VvIRT蛋白亦主要分布在細(xì)胞質(zhì)膜上，這與擬南芥和水稻中的報(bào)道相一致。

3.2" VvIRT基因在葡萄果實(shí)發(fā)育不同時期表達(dá)特征差異顯著

擬南芥AtIRT1和AtIRT2、水稻OsIRT1和OsIRT2、落花生AhIRT1 、小金海棠MxIRT1、杜梨PbIRT1 、蘿卜RsIRT1 等基因均在根部有特異性表達(dá)，且在缺鐵環(huán)境中表達(dá)量顯著增加。但I(xiàn)RT基因在葡萄果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)特征及其生物學(xué)功能未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)在葡萄花后不同發(fā)育時期，果實(shí)、韌皮部和葉片中VvIRT7基因均有較高的表達(dá)水平，在轉(zhuǎn)色期至成熟期葡萄果實(shí)中的相對表達(dá)量高于韌皮部和葉片。由于VvIRT7蛋白僅定位于液泡膜和細(xì)胞質(zhì)膜，說明該基因可能在葡萄果實(shí)發(fā)育過程中（特別是轉(zhuǎn)色期至成熟期）參與果肉細(xì)胞液泡膜和質(zhì)膜中Fe2+的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而調(diào)節(jié)或維持果肉細(xì)胞鐵素動態(tài)平衡。此外，煙釀1號葡萄葉片中VvIRT9基因在花后不同發(fā)育時期的相對表達(dá)量均保持較高水平，韌皮部VvIRT6基因在轉(zhuǎn)色期有高表達(dá)量，說明這2個基因在葡萄花后特定時期葉片或韌皮部Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)中亦發(fā)揮作用。

3.3" VvIRT基因?qū)θ~面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥處理的響應(yīng)差異

果樹生長中，秋季發(fā)生的養(yǎng)分回流可保障多年生木本樹體實(shí)現(xiàn)養(yǎng)分的循環(huán)利用 。進(jìn)入秋季后，桃樹葉片中的鐵含量開始降低，而葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥能提升桃果實(shí)的內(nèi)在品質(zhì)，促進(jìn)桃葉片的發(fā)育、改善樹體鐵素營養(yǎng)狀況，并增強(qiáng)Fe-S簇裝配機(jī)制相關(guān)基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥處理下，不同組織中VvIRT基因的表達(dá)倍數(shù)隨花后發(fā)育時間呈現(xiàn)不同的特征。從幼果期至轉(zhuǎn)色期，韌皮部VvIRT7、VvIRT9和VvIRT6基因的表達(dá)水平及葡萄幼果中VvIRT9的表達(dá)水平受葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥的誘導(dǎo)而顯著增強(qiáng)，而從第2次膨大期至成熟期，韌皮部和葉片中VvIRT7和VvIRT9的表達(dá)水平在葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥處理下顯著降低，而葡萄果實(shí)、韌皮部和葉片中VvIRT6的表達(dá)水平不受葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥影響。盡管在CK的葡萄果實(shí)、韌皮部和葉片中沒有檢測到VvIRT3的表達(dá)量，但在葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥處理下從幼果期至轉(zhuǎn)色期，葡萄果實(shí)、韌皮部和葉片中VvIRT3表達(dá)量得到誘導(dǎo)。在葡萄發(fā)育初期至轉(zhuǎn)色期，葡萄樹體可能需要更多的Fe2+用于果實(shí)發(fā)育和品質(zhì)形成，葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥處理后，VvIRT的表達(dá)水平大多受誘導(dǎo)而增強(qiáng)，進(jìn)而發(fā)揮其轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+的功能。而轉(zhuǎn)色期至成熟期，果實(shí)、韌皮部和葉片中VvIRT7基因持續(xù)穩(wěn)定的高表達(dá)，韌皮部和葉片中VvIRT9特異高表達(dá)，從而能夠滿足葡萄這一發(fā)育時期對鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)的需求。

盡管花后不同發(fā)育時期，煙釀1號不同組織中VvIRT4的整體表達(dá)量相對較低，但其表達(dá)非常穩(wěn)定，且在葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥處理下，其表達(dá)倍數(shù)沒有明顯變化，說明VvIRT4蛋白在葡萄花后不同發(fā)育時期能持續(xù)發(fā)揮Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)作用。同樣，葡萄不同組織中VvIRT2的整體表達(dá)量亦相對較低，但該基因?qū)θ~面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥最為敏感；從幼果期至成熟期，特別是在韌皮部和葉片中該基因的表達(dá)量持續(xù)得到誘導(dǎo)增強(qiáng)，說明該基因更傾向于在外界Fe2+供應(yīng)豐富的情況下發(fā)揮作用。此外，煙釀1號不同組織中均沒有檢測到VvIRT1、VvIRT5、VvIRT8和VvIRT10等4個基因的表達(dá)，且其對葉面噴施氨基酸-鐵復(fù)合肥也沒有響應(yīng)，說明這些基因編碼的鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在葡萄果實(shí)發(fā)育過程中發(fā)揮的功能較少。

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