石榴籽油的提取及脂質(zhì)組成分析

摘 要：以石榴籽為原料，將石榴籽烘干至不同水分含量，用研磨和碾碎等機械法進行破殼，并用溶劑震蕩法提取石榴籽油，以此探究水分含量對破殼強度及石榴籽油基本理化品質(zhì)的影響.結(jié)果表明：石榴籽油的破殼強度隨水分含量的降低而增大，酸價和過氧化值則隨水分含量的降低而降低，在5 wt%以下時，酸價為1.35 mg KOH/g，過氧化值為0.23 mmol/kg.對石榴籽油進行甘油酯組成分析及脂類伴隨物組成分析，發(fā)現(xiàn)石榴籽油中的甘油酯主要為甘油三酯，占97%～98%，脂類伴隨物中生育酚主要為γ-生育酚，為1 738.23 mg/kg，角鯊烯含量達880.39 mg/kg；進一步分析甘油三酯分子種類，發(fā)現(xiàn)石榴籽油主要由11種甘油三酯分子組成，其中PiPiPi含量最高，占62.30%.

關鍵詞：石榴籽油； 提?。?脂質(zhì)組成； 脂類伴隨物

中圖分類號：TS225.1

文獻標志碼： A

Extraction and lipid composition analysis of pomegranate seed oil

PENG Yi-fan， LI Dao-ming*， LIU Kan-kan， DING Xiao-gang， MEI Ling， ZHANG Chu-jie

（School of Food Science and Engineering， Shaanxi University of Science amp; Technology， Xi′an 710021， China）

Abstract：The pomegranate seeds were dried to different moisture contents with pomegranate seeds as raw materials.Mechanical methods such as grinding and crushing were used to break the shells，and pomegranate seed oil was extracted using solvent shaking method.This study investigated the effect of moisture content on the breaking strength and basic physicochemical quality of pomegranate seed oil.The results indicate that the breaking strength of pomegranate seed oil increases with the decrease of water content，while the acid value and peroxide value decreases with the decrease of water content.When the content is below 5 wt%，the acid value is 1.35 mg KOH/g，and the peroxide value is 0.23 mmol/kg.An analysis of the glyceride composition and lipid concomitants of pomegranate seed oil was conducted.It is found that the glycerides in pomegranate seed oil are mainly triglycerides，accounting for 97% to 98%.The tocopherols in the lipid concomitants are mainly γ-tocopherol.Phenol is 1 738.23 mg/kg，and squalene content is 880.39 mg/kg.Pomegranate seed oil is mainly composed of 11 types of TAG molecules，of which PiPiPi has the highest content，accounting for 62.30%.

Key words：pomegranate seed oil； extraction； lipid composition； lipid concomitant

0 引言

石榴品種繁多，種植面積廣泛.在我國，石榴的種植主要集中在安徽懷遠、山東棗莊、陜西臨潼、四川會理、云南蒙自以及新疆葉城等地［1］.石榴果實可以分為三部分，即外果皮、囊衣和假種皮，其中假種皮是石榴果實籽粒的肉質(zhì)可食用部分，包含78%的石榴汁和22%的石榴籽［2，3］.近年來，隨著對石榴中功能性成分研究的不斷深入，從石榴汁中的膳食多酚、有機酸［4］，到石榴皮中的多酚類化合物［5］，再到石榴籽中的功能性油脂［6］，石榴的應用范圍已擴展到營養(yǎng)、醫(yī)藥和化妝品等領域.

研究表明，石榴籽是生物活性成分和功能性油脂的一個極好的來源，籽中含油量約12%～24%［7］，但石榴籽不同于芝麻、大豆、花生等油料種子，其具有堅硬的外殼，因此增大了提油難度.但常規(guī)的機榨工藝，石榴籽與榨膛反復摩擦使加工溫度難以控制，容易破壞油脂中生物活性成分，為保證石榴籽油的品質(zhì)，對石榴籽破殼的研究尤為重要［8］.此外，油脂中的生育酚、植物甾醇、角鯊烯等脂類伴隨物，均具有一定的抗氧化活性，尤其生育酚和植物甾醇是普遍存在于油脂中的天然抗氧化劑；石榴酸是石榴籽油中的主要脂肪酸，也是發(fā)揮一系列生理功能的主要活性物質(zhì)，其在體內(nèi)的代謝特征決定了其具有各種生理功能.因此明確石榴籽油脂肪酸組成、甘油三酯分子種類、測定脂質(zhì)伴隨物、了解其脂質(zhì)構(gòu)成，是開發(fā)和應用石榴籽油的基礎.

本文以陜西臨潼凈皮甜石榴為研究對象，采用研磨和搟碎兩種機械方式，對不同水分含量的石榴籽進行處理并通過監(jiān)控石榴籽烘干過程中水分含量變化來降低提油的難度，尋求最佳的破殼強度；隨后，采用溶劑振蕩法提取石榴籽油，并從溶劑損耗的成本考慮，優(yōu)化了料液比；考察了烘干過程中水分含量對石榴籽油理化品質(zhì)的影響；最后對石榴籽油的脂質(zhì)組成進行了表征，為石榴籽油的研究及開發(fā)利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

石榴為陜西臨潼凈皮甜石榴.

1.2 試劑藥品

正己烷，甲酸，碘化鉀，購于天津市科密歐化學試劑有限公司；異丙醇，無水硫酸鈉，無水碳酸鈉，硫代硫酸鈉，冰乙酸，可溶性淀粉，購于天津市天力化學試劑有限公司；三氯甲烷，購于國藥集團化學試劑有限公司.

1.3 儀器與設備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鞏義市予華儀器有限責任公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）；分析精密天平（BSA224S，賽多利斯科學儀器北京有限公司）；電熱鼓風干燥箱（DHG-9140，上海一恒科學儀器有限公司）；氣浴振蕩器（THZ-92C，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；水分測定儀（HE53，上海梅特勒-托利多儀器有限公司）.

1.4 實驗方法

1.4.1 石榴原料的前處理

從陜西臨潼采購凈皮甜石榴.新鮮石榴經(jīng)過篩選、剝皮、去囊衣等獲得可食用的假種皮，然后將收集到的假種皮用手動榨汁器去汁，獲得脫汁后的濕石榴籽.將濕石榴籽水洗3～4遍，去除表面殘留的果肉.

1.4.2 水分含量對石榴籽破殼強度的影響

將石榴籽放置于40 ℃烘箱中，監(jiān)測不同烘干時長下石榴籽中水分含量的變化，并采用手動研磨和搟碎這兩種機械方式考察水分含量對石榴籽破殼強度的影響.

1.4.3 石榴籽油的提取

工藝流程：新鮮石榴→剝皮、去囊衣→收集假種皮→壓榨去汁→濕石榴籽→水洗、搓揉→烘干→粉碎→溶劑振蕩浸提→抽濾分離→真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→石榴籽油.石榴籽油提取的工藝流程圖如圖1所示.

具體步驟：參照崔俊杰［9］的溶劑振蕩法，并稍作修改.將水洗、搓揉后的濕石榴籽，置于40 ℃烘箱中烘干，冷卻后用高速粉碎機粉碎，即得石榴籽粉.稱取20 g石榴籽粉，以正己烷為浸提溶劑，按照一定料液比裝于500 mL錐形瓶中，在轉(zhuǎn)速200 rpm，40 ℃的氣浴搖床中振蕩浸提2 h.結(jié)束后，用抽濾瓶抽濾，分離溶劑混合物與殘渣，用正己烷洗滌濾渣2～3次，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸餾，回收溶劑，得到石榴籽油.石榴籽油出油率計算公式（1）如下：

Y=M1-M2M3×100%

（1）

式（1）中：Y為石榴籽油出油率，%；M1為石榴籽油和茄形燒瓶的質(zhì)量，g；M2為茄形燒瓶的質(zhì)量，g；M3為石榴籽粉的質(zhì)量，g；

1.4.4 水分含量對石榴籽油理化品質(zhì)的影響

將經(jīng)過溶劑振蕩法提取得到石榴籽油，研究水分含量對所得石榴籽油理化品質(zhì)的影響.

（1）酸價

參照美國油脂檢測標準AOCS Ca 5a-40，酸價以游離脂肪酸面積百分比乘以1.99來計算.試驗重復3次，結(jié)果以mg KOH/g表示.

（2）過氧化值

參照GB5009.227-2016中的方法對過氧化值進行測定［10］.試驗重復3次，結(jié)果以mmol/kg表示.

1.4.5 石榴籽油中脂類伴隨物測定

（1）石榴籽油樣品處理

準確稱取6 mg石榴籽油于1 mL容量瓶中，記錄讀數(shù)M，以甲醇和氯仿混合溶液（1∶1）為溶劑，定容至1 mL，倒轉(zhuǎn)并搖動容量瓶，使樣品充分溶解，隨后將樣品溶液轉(zhuǎn)移至色譜瓶中待進樣分析.

（2）高效液相色譜分析

采用安捷倫液相色譜系統(tǒng)，裝載Phenomenex C18反向液相色譜柱00G-4375-E0（250×4.6 mm），進樣量10 μL，柱溫30 ℃，紫外檢測器，檢測波長：205 nm和296 nm，流動相：甲醇/異丙醇/甲酸（V/V/V：9/1/0.001），流速1 mL/min，等度洗脫.

采用外標法進行定量，根據(jù)各標準品的標準曲線，將樣品對應組分的峰面積值代入相應的標準曲線方程，得出1 mL樣品瓶中活性成分的具體含量，計算其與添加樣品的實際質(zhì)量的比值，公式（2）如下：

活性成分含量（mg/g）=m×1 000M

（2）

式（2）中：m為經(jīng)標準方程計算后所得1 mL樣品瓶中活性成分的具體含量，mg；M為制樣時容量瓶中加入樣品的實際質(zhì)量，mg；1 000為mg到g的單位換算.

1.4.6 石榴籽油中甘油酯組成測定

參照李琳琳［11］的方法，并稍作修改.采用配備RID-20A（Refractive index detector，RID，示差折光檢測器）的高效液相色譜儀（島津LC-16，日本）對石榴籽油中甘油酯組成進行檢測分析，具體操作如下：

（1）樣品的制備

取低溫凍藏的石榴籽油，待其回溫后，分別用移液槍吸取20 μL的石榴籽油與1 mL流動相于離心管中，混合均勻，加入一定量無水硫酸鈉，混勻充分去除水分.以10 000 rpm高速離心2 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜后置于色譜瓶中，待進樣檢測.

（2）檢測

色譜柱型號為EXL-127-2546U，填料ACE Excel 5 SIL，尺寸250 mm×4.6 mm.流動相：正己烷/異丙醇/甲酸（V/V/V：18/1/0.003），柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，等度洗脫.

（3）定性與定量

各組分的出峰用標準品進行定性，通過外標法對各組分進行定量.甘油酯組分出峰時間順序依次為：甘油三酯（TAG）、游離脂肪酸（FFA）、1，3-甘油二酯（1，3-DAG）、1，2-甘油二酯（1，2-DAG）、1-甘油單酯（1-MAG）、2-甘油單酯（2-MAG）.

1.4.7 石榴籽油中甘油三酯分子種類測定

參考崔俊杰［9］的方法，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測石榴籽油中TAG的分子種類及含量.制樣：稱取50 mg油樣溶解于5 mL正己烷中，渦旋混勻后，取出10 μL，加入一定量的C17∶1/C17∶1/C17∶1 TAG內(nèi)標，用等比例的氯仿甲醇溶液定容至1 mL.隨后用濾膜過濾，儲存?zhèn)溆?

1.4.8 數(shù)據(jù)處理

定性與定量：應用色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，參考標準品的保留時間進行定性，按照外標法進行定量.采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA），數(shù)據(jù)表示為均值±標準差，小寫字母表示同一方法不同處理參數(shù)的顯著性差異（Plt;0.05）.各實驗均重復三次進行測定.

2 結(jié)果與討論

2.1 石榴籽烘干過程中水分含量對石榴籽破殼強度的影響

對于不同水分含量下的破殼強度，可用果實硬度計測定果實種子的硬度來間接反映，如汪小飛等［12］采用硬度計分析了國內(nèi)36個石榴品種的籽粒硬度，硬度在2.9～4.6 kg·cm-2，品種間籽粒硬度差異顯著.本文采用研磨和搟碎兩種機械方式考察水分含量對石榴籽破殼強度的影響，結(jié)果如表1和表2所示.為避免高溫對石榴籽油中脂肪酸及脂類伴隨物的影響，實驗過程中統(tǒng)一采用40 ℃進行烘干.隨著烘干時間的延長，石榴籽水分含量顯著降低，通常烘干6～7 h左右，才能將石榴籽徹底烘干至5 wt%以下.

由表1可知，當以研磨方式考察石榴籽破殼強度，發(fā)現(xiàn)在水分含量20 wt%～25 wt%時，石榴籽較好研磨.水分含量高于25 wt%時，石榴籽較滑且外殼較堅韌，很難研裂；水分含量低于20 wt%時，石榴籽外殼硬度明顯增大，僅個別籽粒比較飽滿的可以采用碾壓的方式破殼，但當多數(shù)石榴籽匯聚，強度增大，難以研磨或碾壓.由表2可知，當以搟碎的方式考察石榴籽破殼強度，發(fā)現(xiàn)在水分含量15 wt%～25 wt%時，石榴籽較好搟碎.水分含量較高時（gt;30 wt%），外殼硬度不大，但石榴籽較滑，難以對準石榴籽進行施力；隨著石榴籽繼續(xù)烘干，硬度增大；同時水分的散失，使外殼濕度下降，水分含量越低（lt;10 wt%）時，外殼越堅硬，破殼的難度越大.整體來講無論是研磨還是搟碎處理石榴籽，在水分含量20 wt%～25 wt%時較容易破殼，在水分含量低于5 wt%時，石榴籽的硬度較大，難以破殼.石榴籽的硬度隨水分含量的降低而變大，這可能與其殼體組織結(jié)構(gòu)有關.

2.2 石榴籽油的提取

不同料液比下測定石榴籽油出油率的結(jié)果如圖2所示.由圖2可知，在其他提取條件相同的情況下，隨著料液比的增加，石榴籽油出油率呈現(xiàn)先增加后緩慢降低的趨勢.當料液比從1∶3增加到1∶4時，石榴籽油的出油率顯著增大，達16.55%，繼續(xù)增加料液比，石榴籽油出油率不會顯著變化，說明在1∶4料液比下石榴籽粉中的油脂即能充分溶解到正己烷溶劑中.當料液比增大至1∶7時，石榴籽油出油率降為16.02%.考慮到料液比增加，不僅使出油率降低，而且造成試劑損耗，延長蒸發(fā)回收的時間，因此選擇1∶4作為最優(yōu)料液比.

Kalamara等［13］使用直接超聲輔助法提取石榴籽油，提取10 min，石榴籽油產(chǎn)率介于15.66%至18.16%之間.Goula等 ［14］使用攪拌法提取4 h，石榴籽油提取率為9.5%.Abbasi等［15］用索氏提取法和超臨界二氧化碳法提取2 h，石榴籽油提取率分別為17.94%和15.72%.本研究采用的溶劑振蕩提取法，在最佳料液比下獲得的出油率（16.55%）與上述索氏提取、超臨界流體萃取、攪拌法提取、超聲波輔助提取以及水酶法等方法的出油率接近.

2.3 石榴籽烘干過程中水分含量對石榴籽油理化品質(zhì)的影響

在水分含量20～25 wt%時，石榴籽較容易破殼，為進一步確定這種以控制石榴籽水分含量來降低提油強度的可行性，分析了不同水分含量對石榴籽油理化品質(zhì)的影響，結(jié)果如表3所示.在水分含量20 wt%～25 wt%時，油脂的過氧化值和酸價范圍分別為0.55～1.33 mmol/kg和5.01～6.25 mg KOH/g.整體上，隨著石榴籽水分含量從31.97 wt%降低到4.27 wt%，石榴籽油的過氧化值和酸價顯著降低（Plt;0.05）.這可能是石榴籽油中殘留的水分導致油脂發(fā)生了水解性腐敗.孫麗琴等［16］研究了不同存放條件對大豆油酸價和過氧化值的影響，發(fā)現(xiàn)混入水分的油樣，會在油脂中脂解酶的分解作用下，進行水解性酸敗反應，積累游離脂肪酸，從而加速油脂的酸敗.

綜上，石榴籽在水分含量為20 wt%～25 wt%時易破殼，便于提取油脂，但較高的水分會使石榴籽油加速酸敗，造成酸價與過氧化值過高，理化品質(zhì)較差；在水分含量3.80 wt%～4.90 wt%時，破殼難度較大但理化品質(zhì)較好.考慮到理化品質(zhì)是石榴籽油研究與應用的基礎，研究中要把石榴籽水分含量烘干至5 wt%以下.

2.4 石榴籽油中脂類伴隨物分析

石榴籽油中脂類伴隨物組分如表4所示.從表中可以看出，石榴籽油生育酚主要是γ-生育酚（1 738.23 mg/kg），約占生育酚總量的94.23%，此外還測出少量的δ-生育酚和α-生育酚.β-谷甾醇是石榴籽油中最豐富的植物甾醇，含量為3 316.59 mg/kg.

角鯊烯是一種高度不飽和的脂肪族烴類物質(zhì)，在植物油中含量較少.這里我們分析出石榴籽油中角鯊烯含量達880.39 mg/kg.明顯高于劉慧敏［17］的研究成果報道的芝麻油（80.29 mg/kg）、玉米油（87.73 mg/kg）、花生油（103.09 mg/kg）、米糠油（241.77 mg/kg）、菜籽油（42.50 mg/kg）、

葵花籽油（52.39 mg/kg）、大豆油（29.55 mg/kg）等10種常見植物油中角鯊烯的含量，進一步說明石榴籽油是富含生物活性成分的油脂.

2.5 石榴籽油中甘油酯組成

石榴籽油的甘油酯組成液相色譜圖如圖3所示，各組分出峰時間及含量如表5所示.由表5可知，石榴籽油中甘油酯主要是TAG，占石榴籽油甘油酯組成的97%～98%，DAG不超過2%，油脂中不含MAG，這與大多數(shù)植物油脂的甘油酯組成一致.

2.6 石榴籽油中甘油三酯分子種類

油脂的生理功能不僅與其骨架結(jié)構(gòu)有關，而且與骨架上脂肪酸的種類和位置的分布相關.石榴籽油中TAG分子種類如表6所示.石榴籽油主要由11種TAG分子組成，其中含量最多的是PiPiPi，占62.30%，其次是PiPiL和PiPiO，分別占比11.60%和11.51%，此外石榴籽油中還含有一些以棕櫚酸、硬脂酸、油酸以及亞油酸等脂肪酸與石榴酸或其異構(gòu)體組成的TAG分子，含量通常低于1.50%.

3 結(jié)論

（1）石榴籽烘干過程中，當水分含量20 wt%～25 wt%時，采用研磨或搟碎方式較容易破殼，隨著水分含量的降低，石榴籽的硬度增大，破殼強度也將增大；進一步分析發(fā)現(xiàn)隨著水分含量的降低，石榴籽油的酸價和過氧化值呈顯著降低的趨勢；當石榴籽水分含量從25.75 wt%降至4.27 wt%，油脂中酸價從6.25 mg KOH/g降低到1.35 mg KOH/g，過氧化值從1.33 mmol/kg降低到0.23 mmol/kg.

（2）通過優(yōu)化料液比（石榴籽粉/正己烷），確定了溶劑振蕩提取法的最佳料液比為1∶4，在200 rpm，40 ℃下，振蕩浸提2 h，通過減壓蒸餾，測得石榴籽油平均出油率為16.55%.對石榴籽油中活性成分進行表征，發(fā)現(xiàn)石榴籽油中含有豐富的脂類伴隨物，生育酚總量達1 844.69 mg/kg，其中γ-生育酚占94.32%（1738.23 mg/kg）.另外測得β-谷甾醇含量為3 316.59 mg/kg，角鯊烯含量為880.39 mg/kg.

（3）對石榴籽油的甘油酯組成分析，發(fā)現(xiàn)石榴籽油中TAG占97%～98%，DAG不超過2%，不含MAG；進一步分析其TAG分子種類，發(fā)現(xiàn)石榴籽油主要由11種TAG分子組成，其中PiPiPi含量最多，占62.30%，其次是PiPiL和PiPiO，分別占11.60%和11.51%，其他TAG分子種類含量通常在1.5%左右.綜上，本文為石榴籽油的進一步研究及其開發(fā)利用提供理論參考依據(jù).

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【責任編輯：陳 佳】