畜禽產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)方法的優(yōu)化

摘 要：由于《動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)-高效液相色譜法》中的前處理方法步驟繁雜，為了提高檢測(cè)效率，對(duì)前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，并探究不同提取方式、凈化方式對(duì)畜禽產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留量的影響。選用不同固相萃取柱，通過優(yōu)化提取方式、洗脫液體積及比例來處理雞肉樣品，并用高效液相色譜法檢測(cè)雞肉中氟喹諾酮類藥物的殘留量，從而探索出最佳的前處理方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳提取方法為1次渦旋提取，即先用3 mL提取液過安捷倫C18固相萃取柱，再用磷酸溶液/三乙胺-乙腈（70＋30）進(jìn)行洗脫。該提取方法的前處理時(shí)間短、回收率高，可用來對(duì)畜禽產(chǎn)品中殘留的氟喹諾酮類藥物進(jìn)行檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：動(dòng)物性食品；氟喹諾酮；回收率；高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：S859.84 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：1674-7909（2024）6-101-4

DOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2024.06.022

0 引言

氟喹諾酮類藥物是奎諾酮類藥物加氟改造后的衍生物。氟喹諾酮類藥物通過與DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ產(chǎn)生反應(yīng)，從而生成一種新物質(zhì)，能有效抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶的作用，并對(duì)DNA的正常形態(tài)和功能產(chǎn)生影響，阻礙DNA的正常復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)運(yùn)與重組，最終加速細(xì)菌死亡，從而快速殺死細(xì)菌［1］。在畜牧、家禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中，使用較多的氟喹諾酮類藥物有環(huán)丙沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、沙拉沙星、諾氟沙星、氧氟沙星等，具有吸收好、組織濃度高、半衰期長、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。

目前，對(duì)動(dòng)物性食品中的氟喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定法有微生物法［2］、高效液相色譜法［3］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［4］。《動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)-高效液相色譜法》（農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告14-2008）［5］中的樣品前處理操作步驟較多，且回收率不高。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)畜禽產(chǎn)品中的氟喹諾酮類藥物的最大化檢出，同時(shí)提高檢測(cè)效率，對(duì)樣品處理的提取方式、洗脫液體積和比例、固相萃取柱進(jìn)行優(yōu)化。通過對(duì)比優(yōu)化前后的氟喹諾酮類藥物的回收率，從而探索出對(duì)畜禽產(chǎn)品中氟喹諾酮的殘留量用時(shí)少、回收率高的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：不含氟喹諾酮類藥物的雞肉（購自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)）；供試藥劑：甲醇中鹽酸環(huán)丙沙星（批號(hào)GSB05-3337-2016）、甲磺酸達(dá)氟沙星［批號(hào)GBW（E）100475］、甲醇中恩諾沙星（批號(hào)GSB05-3336-2016）、甲醇中沙拉沙星［批號(hào)GBW（E）083590標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)］，供試試劑：乙腈、甲醇（色譜純）、磷酸、三乙胺、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀（分析純）。

1.2 試驗(yàn)器材

試驗(yàn)用到的器材有微孔濾膜（0.45 μm）、不同品牌的C18固相萃取柱（100 mg/mL）、Agilent1220液相色譜儀（配有熒光檢測(cè)器，安捷倫品牌儀器）、離心機(jī)（TG16G，購自天津廣豐科技有限公司）、振蕩器（XW-80A，購自上海精科實(shí)業(yè)有限公司）、電子分析天平（CP214，購自奧豪斯儀器有限公司）、組織勻漿機(jī)（RCD-1A，購自金壇區(qū)白塔新寶儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

參照《動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)-高效液相色譜法》（農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告14-2008）（以下簡(jiǎn)稱“標(biāo)準(zhǔn)”）中的方法進(jìn)行測(cè)定，色譜柱：C18 250 mm×4.6 mm（i.d），粒徑為5 μm；檢測(cè)波長：激發(fā)波長為280 nm、發(fā)射波長為450 nm；流速為1 mL/min、柱溫為28 ℃、進(jìn)樣量為20 μL；流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸三乙胺溶液-乙腈（82＋18，v/v）。使用前，用微孔濾膜進(jìn)行過濾，并超聲排氣泡。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

準(zhǔn)確量取適量的環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星和沙拉沙星的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動(dòng)相稀釋成濃度為0.005 μg/mL、0.010 μg/mL、0.050 μg/mL、0.100 μg/mL、0.300 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液，分別吸取20 μL進(jìn)樣，建立回歸方程。

1.3.3 樣品提取和凈化

樣品提取過程如下：準(zhǔn)確稱取2.00 g±0.05 g試料，并用10.0 mL磷酸鹽緩沖溶液提取，離心，轉(zhuǎn)移上清液后待用；再用10.0 mL磷酸鹽緩沖溶液重復(fù)提取一次，合并2次上清液。

樣品凈化過程如下：依次用甲醇（2.0 mL）、磷酸鹽緩沖溶液（2.0 mL）對(duì)固相萃取柱進(jìn)行預(yù)洗；取5.0 mL上清液過柱，再用1.0 mL水淋洗后擠干；用1.0 mL流動(dòng)相洗脫后擠干，收集洗脫液，并用高效液相色譜儀對(duì)濾膜過濾后的洗脫液進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 不同提取方式對(duì)雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留量的影響試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)中前處理的2次勻漿和振蕩改為用20 mL一次渦旋提取，并對(duì)雞肉中環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行計(jì)算。

1.3.5 不同洗脫液體積對(duì)雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留量的影響試驗(yàn)

分別用2 mL、3 mL、4 mL、5 mL洗脫液對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，樣品擠干后收集洗脫液。經(jīng)微孔濾膜過濾后作為試樣溶液，并用高效液相色譜儀對(duì)試樣溶液進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 不同比例的洗脫液對(duì)雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留量的影響試驗(yàn)

將原方法中的洗脫液［磷酸溶液/三乙胺-乙腈（82＋18，v/v）］的比例濃度改為90+10、85+15、81+19、75+25、70+30、65+35、60+40，并測(cè)量雞肉中環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.7 不同固相萃取柱對(duì)雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留量的影響試驗(yàn)

用不同品牌、同樣規(guī)格的固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行萃取。取5 mL樣品上清液，并用3 mL洗脫液對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測(cè)定喹諾酮類藥物殘留量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分析

達(dá)氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星對(duì)應(yīng)的色譜分離效果如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限見表1。

2.2 不同優(yōu)化處理結(jié)果分析

2.2.1 提取方式優(yōu)化對(duì)雞肉中氟喹諾酮類藥物回收率的影響

把標(biāo)準(zhǔn)前處理中的2次勻漿和振蕩改為用20 mL一次渦旋提取，測(cè)得的雞肉中環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表2。由表2可知，4種氟喹諾酮類藥物一次提取的回收率為61.9%～75.2%，通過計(jì)算平均添加回收率，達(dá)到該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的60%～100%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.53%～3.41%，表明該方法能滿足雞肉中氟喹諾酮類藥物的檢測(cè)要求。

2.2.2 洗脫液體積優(yōu)化對(duì)雞肉中氟喹諾酮類藥物回收率的影響

不同體積的洗脫液過柱用時(shí)和測(cè)得雞肉中環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星的回收率見表3。由表3可知，4 mL、5 mL洗脫液的過柱用時(shí)較長，均在5 min以上，且易造成堵塞；用2 mL洗脫液過柱時(shí)的回收率稍偏低；用3 mL洗脫液過柱時(shí)，用時(shí)合理，且回收率較好。

2.2.3 洗脫液比例優(yōu)化對(duì)雞肉中氟喹諾酮類藥物回收率的影響

用不同比例的磷酸溶液/三乙胺-乙腈溶液來洗脫，測(cè)得的雞肉添加回收率見表4。由表4可知，當(dāng)乙腈比例太低時(shí)，回收偏低；當(dāng)乙腈比例太高時(shí)，回收同樣偏低。而標(biāo)準(zhǔn)中流動(dòng)相磷酸溶液/三乙胺-乙腈（82＋18，v/v）洗脫柱也不是最理想的，用磷酸溶液/三乙胺-乙腈（70＋30，v/v）洗脫的回收率最高，這與胡永萍等［6］的研究相吻合。

2.2.4 固相萃取柱優(yōu)化對(duì)雞肉中氟喹諾酮類藥物回收率的影響

用不同品牌同樣規(guī)格的固相萃取柱進(jìn)行試驗(yàn)，回收率見表5。由表5可知，安捷倫固相萃取柱的回收率最高，其余的固相萃取柱的回收率都較低，甚至達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的60%～100%。在實(shí)際試驗(yàn)中，常用國產(chǎn)固相萃取柱，這是因?yàn)閲a(chǎn)固相萃取柱的價(jià)格便宜，又能滿足試驗(yàn)要求，性價(jià)比高。但在該試驗(yàn)中，A-1、A-2、A-3、A-4、B-1的收率均達(dá)不到試驗(yàn)要求，而安捷倫固相萃取柱（原Varian C18）的回收效果更好，回收效率達(dá)到要求。

3 結(jié)束語

在使用標(biāo)準(zhǔn)中的檢測(cè)方法對(duì)氟喹諾酮類藥物的殘留量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由圖譜可知，藥物分離度高、峰形好，但回收率偏低，且操作煩瑣，使用的器材較多，用時(shí)較長。在對(duì)樣品進(jìn)行處理時(shí)，對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，通過改變洗脫液的比例、濃度，得到的回收率不同，用磷酸溶液/三乙胺-乙腈（70＋30，v/v）洗脫的回收率最好，回收率提高近15個(gè)百分點(diǎn)。通過將前處理過程中的勻漿和振蕩方式改為劇烈渦旋方式，對(duì)回收率的影響不大，且無明顯規(guī)律改變，但可節(jié)省18 min。用3 mL過柱時(shí)，用時(shí)少，且回收率也好；用2.0 mL流動(dòng)相洗脫時(shí)的回收率更高。在過柱時(shí)，安捷倫C18柱（原Varian C18）的回收率滿足要求，而用其他幾種固相萃取柱在過柱時(shí)，回收率都達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的60%～100%。

參考文獻(xiàn)：

［1］OPPEGARD L M，SCHWANZ H A，TOWLE T R，et al.Fluoroquinolones stimulate the DNA cleavage activity of topoisomerase Ⅳ by promoting the binding of Mg（2+） to the second metal binding site［J］.2016（3）：569-575.

［2］SCHNEIDER J M，DONOGHUE J D.Multiresidue analysis of fluoroquinolone antibiotics in chicken tissue using liquid chromatography-fluorescence-multiple mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography B，2002（1）：83-92.

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［4］李維鋮，姬長云，張靜潔，等.高效液相色譜法檢測(cè)雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留量前處理方法的優(yōu)化［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014（05）：14-18.

［5］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)高效液相色譜法：農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-14-2008［S］.2008.

［6］胡永萍，徐克功，余舒寧，等.高效液相色譜熒光法測(cè)定雞肉及雞蛋中4種喹諾酮類藥物殘留量的研究［J］.畜牧與獸醫(yī)，2017（11）：47-51.

作者簡(jiǎn)介：崔旭東（1987—），男，碩士，農(nóng)藝師，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)及農(nóng)業(yè)品牌建設(shè)。