蒜頭果ISSR-PCR反應體系建立及驗證

摘要：【目的】建立穩(wěn)定的蒜頭果ISSR-PCR反應體系，篩選出適用于蒜頭果的多態(tài)性引物，為后續(xù)蒜頭果遺傳多樣性研究及種質資源保護提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎捎脝我蛩卦囼炁cL2（5）正交試驗相結合的方法，對影響ISSR-PCR反應體系擴增效果的4個主要因素（模板DNA用量、引物濃度、dNTPs濃度、Tag DNA聚合酶）及反應循環(huán)數(shù)進行優(yōu)化， 確定最佳反應體系和條件。在此基礎上篩選出適用于蒜頭果的多態(tài)性引物，探究其最佳退火溫度，并采集云南省境 內3個野生居群10個蒜頭果樣品對優(yōu)化的反應體系進行驗證?！窘Y果】蒜頭果ISSR-PCR最佳反應體系（20.0uL）：模板 DNA 30 ng，ISSR引物0.3 umol/L，dNTPs 0.250 mmol/L，Tag DNA聚合酶1.00 U，ddH，O補足至20.0 uL。ISSR最佳反 應程序為30個循環(huán)。利用優(yōu)化后的反應體系篩選出了8條引物（UBC825、UBC826、UBC827、UBC836、UBC844、UBC861、UBC834和UBC851）的最佳退火溫度，分別為50.2、56.5、50.2、56.5、50.2、50.2、50.2和54.0°C，部分引物（如UBC827、UBC836、UBC861等）實測最佳退火溫度與軟件預測退火溫度存在明顯差異。采用優(yōu)化后的ISSR-PCR反應體系及引物對10個蒜頭果樣品進行ISSR-PCR分子標記檢測，結果顯示建立的ISSR-PCR反應體系穩(wěn)定可靠，不同采樣點的蒜頭果在遺傳上相對保守，且10個蒜頭果樣品的遺傳分化系數(shù)（G）為0.74，說明其74%的遺傳多樣性存在于居群間，且基因流（N）為0.18，遠小于1.00，說明發(fā)生遺傳漂變的概率大，易發(fā)生遺傳多樣性降低及居群分化?！窘Y論】通過優(yōu)化蒜頭果ISSR-PCR反應體系，建立可用于蒜頭果ISSR-PCR分子標記擴增的穩(wěn)定反應體系，可用于蒜頭果種 質資源保護與利用研究工作。

關鍵詞：蒜頭果；ISSR-PCR；體系優(yōu)化；驗證

中圖分類號：S792.99

文獻標志碼：A

文章編號：2095-1191（2024）03-0834-12

Establishment and verification of ISSR–PCR reaction system for Malania oleiferaZHANG Peng-yuan1， HUANG Jiu-yan1， TONG Hai-zhen1， HU Bo1， YU Xiao2，LEI Xiao-ling2， WANG Juan2*

（1College of Life Sciences， Southwest Forestry University， Kunming， Yunnan 650224， China; 2Eco-development Aca-demy， Southwest Forestry University， Kunming， Yunnan 650224， China）

Abstract：[Objective]The purpose of the study was to establish a stable ISSR-PCR reaction system for Malania oleifera and to screen appropriate polymorphic primers for M. oleifera， so as to provide a reference basis for the subsequent study on the genetic diversity of M. oleifera and the conservation of germplasm resources. 【Method]Single factor test combined with L2s （54） orthogonal test was applied to optimize the four main factors （template DNA amount， primer con- centration， dNTPs concentration， Tag DNA polymerase） and the number of reaction cycles affecting the amplification ef- fect of the ISSR-PCR reaction system and to determine the optimal reaction conditions. On this basis， the polymorphic primers suitable for M. oleifera were screened， the optimal annealing temperature was explored， and the optimized reac- tion system was verified by collecting ten M. oleifera samples from three wild populations in Yunnan. 【Result】The opti- mal ISSR-PCR reaction system for M. oleifera （in 20 uL reaction system）：30 ng of DNA， 0.3 umol/L of primer， 0.250 mmol/L of dNTPs， 1.00 U of Tag DNA polymerase， and ddH2O replenished to 20.0 uL. The optimal reaction program for ISSR was 30 cycles. The optimal annealing temperature of eight primers （UBC825， UBC826， UBC827， UBC836，UBC844， UBC861， UBC834 and UBC851） was screened out using the optimized reaction system at 50.2， 56.5， 50.2， 56.5， 50.2， 50.2， 50.2 and 54.0 ℃， respectively. The measured optimal annealing temperatures of some primers （such as UBC827， UBC836， UBC861） differed greatly from the predicted annealing temperatures of the software. Ten M. oleifera samples were tested for ISSR-PCR molecular markers using the optimized ISSR-PCR reaction system and primers. The re- sults showed that the established ISSR-PCR reaction system was stable and reliable， and the samples of M. oleifera from different sampling sites were relatively conserved genetically. Additionally， the coefficient of genetic differentiation （Gsa） of the ten M. oleifera samples was 0.74， indicating that 74% of the genetic diversity occurred among the populations， and the gene flow （Nm） was 0.18， which was much less than 1.00， indicating that there was a high probability of genetic drift， which made it prone to the decrease of genetic diversity and the differentiation of the populations. 【Conclusion】By optimizing the ISSR-PCR reaction system of M. oleifera， a stable reaction system for M. oleifera ISSR-PCR molecular markers has been established， which can be used in the research work of M. oleifera germplasm resources conservation and utilization.

Key words： Malania oleifera; ISSR-PCR; system optimization; verification

Foundation items： Yunnan Major Science and Technology Project （202002AA100007） ; Yunnan Biology Highquality Engineering Project （503190106） ; \"Yunling Industrial Technology Leading Talents\" Project of Yunnan Ten Thousand Talents Plan（2018-212）

0 引言

【研究意義】蒜頭果（Malania oleifera）是我國特 有的鐵青樹科（Olacaceae）蒜頭果屬（Malania）常綠 闊葉樹種（梁月芳等，2003；黃曉露等，2022a），也是 國家珍貴用材樹種、國家Ⅱ級重點保護植物及云南 省極小種群重點拯救和保護對象（王菖莉等，2019）。 蒜頭果是開發(fā)利用神經酸的重要潛在資源植物 （Wang et al.，2021），具有極高的開發(fā)利用價值，但現(xiàn) 有野生蒜頭果分布范圍極為狹窄，其自然分布范圍 僅限于我國云南省的富寧、廣南及廣西的百色右江 區(qū)、巴馬、鳳山等地（梁月芳，2001；楊玉玲等，2020）， 且蒜頭果種群數(shù)量小，開發(fā)利用難度大。根據(jù)2019 年統(tǒng)計數(shù)據(jù)，我國僅存蒜頭果植株總數(shù)約22630株 （李洪果等，2019），在現(xiàn)有蒜頭果種群數(shù)量及生境條 件下，有效地開展蒜頭果種質資源保護與良種選育 工作是開發(fā)與利用蒜頭果種質資源的先決條件。分 子標記技術可在DNA水平上檢測物種的遺傳多樣 性，且具有不受環(huán)境因素影響的特點，近年來被廣泛 應用于植物品種鑒定（孫淑霞等，2011）、遺傳改良 （熊梅，2021）、分子輔助選擇育種（郭瑩等，2023）及 遺傳多樣性分析（劉倬宇，2023）等研究中。開發(fā)建立穩(wěn)定的蒜頭果ISSR-PCR分子標記體系并進行驗 證，從遺傳角度探究造成蒜頭果瀕危的內在原因并 制定相應保護策略對蒜頭果種質資源保護與利用具 有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，蒜頭果的研究 工作主要集中在形態(tài)學及生理生化分析（楊玉玲等， 2020;Wang et al.，2021;黃曉露等，2022b）、微生物資源研究（王毅等，2018；王一凡等，2019；Pan et al.， 2021，2022）、神經酸檢測、制備及功能研究等領域 （周琴芬等，2016；賴福兵，2018；王四海等，2018；付 一笑等，2020；谷穎卓等，2020）。但蒜頭果種群的擴繁工作始終存在人工栽培成活率低的問題（呂仕洪 等，2009，2016），要實現(xiàn)蒜頭果種質資源的可持續(xù) 開發(fā)與利用尚需開展更加全面、深入的研究。近年 來，蒜頭果全基因組序列（Xu et al.，2019）、葉綠體基因組序列（Liu et al.，2019）及線粒體基因組序列（Luo et al.，2020）均相繼被測定，基因組序列也已完成染色體水平的組裝（Yang et al.，2023），為開展蒜 頭果遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析、種質資源保護與 利用等打下良好的前期基礎。在蒜頭果分子標記研 究方面，僅賴家業(yè)等（2006）對蒜頭果DNA提取方法及隨機擴增多態(tài)性DNA標記（RAPD）反應體系進行 優(yōu)化研究。除此之外，尚未發(fā)現(xiàn)其他分子標記反應 體系優(yōu)化與應用的相關報道。簡單序列重復（ISSR）是一種基于PCR技術的分子標記方法，其具有操作 簡單、快速及高效的優(yōu)點（王建波，2002；劉小英等， 2021），被廣泛應用于咖啡（閆林，2019）、香蕉（盧家 仕，2020）、白鶴芋（郭甜馨等，2022）、鐵線蓮（王鑫 等，2022）、野生毛花獼猴桃（王培育等，2023）及紫云 英（張夢等，2023）等不同植物的遺傳多樣性研究中。ISSR分子標記PCR反應體系不同組分濃度、擴增程 序等因素對擴增效果影響顯著?，F(xiàn)有研究結果也表明，不同物種的最佳ISSR-PCR反應體系差異顯著，如任風鳴等（2014）對影響金錢草ISSR-PCR擴增效果的模板DNA量、引物濃度、dNTP濃度等因素進行優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)各因素影響程度排序為引物gt;TaqDNA聚合酶gt;模板 DNAgt;Mg2+gt;dNTPs，在峨眉金線 蓮（謝孔平等，2022）中也得到了類似的結果。覃創(chuàng) 羿等（2023）研究發(fā)現(xiàn)，影響夜來香ISSR-PCR擴增效果的因素排序為模板DNAgt;dNTPsgt;Mg2tgt;Tag DNA 聚合酶gt;引物。因此，針對不同物種建立ISSR-PCR 反應體系是開展遺傳多樣性研究的關鍵步驟。為確保所構建反應體系的準確性及可靠性，在建立分子 標記體系時，常會使用少量樣品從條帶質量、多態(tài)性 及鑒定效果等方面對所構建的ISSR-PCR反應體系 進行驗證及效果評估。如寧琳等（2017）采用8條 ISSR引物及9份不同種質番石榴樣品對建立的 ISSR-PCR反應體系進行驗證，并從條帶多態(tài)性及重 復性方面進行評估；吳望蕊等（2021）利用7條引物 對8個不同產地的朝鮮淫羊藿DNA進行ISSR-PCR 擴增，并對獲得的分子標記條帶進行質量分析；郭曉 亮等（2022）以建立的ISSR-PCR反應體系成功鑒定 了7個不同來源重齒毛當歸的真?zhèn)?，表明該方法?樣適用于物種的真?zhèn)舞b定。【本研究切入點】目前鮮 見有關蒜頭果ISSR-PCR反應體系優(yōu)化的相關研究報道，亦未發(fā)現(xiàn)采用ISSR分子標記對蒜頭果遺傳多 樣性開展研究的報道。【擬解決的關鍵問題】采用單 因素試驗和正交試驗相結合的方法，對蒜頭果ISSR-PCR反應體系中的模板DNA用量、Taq DNA聚合酶用量、dNTPs濃度等多個影響ISSR-PCR擴增效果的因素進行分析，建立與優(yōu)化蒜頭果ISSR-PCR反應體 系并對該體系進行初步驗證，為蒜頭果的遺傳多樣 性研究及種質資源保護與利用提供科學參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

用于蒜頭果ISSR-PCR反應體系建立的供試蒜 頭果樣品采自西南林業(yè)大學蒜頭果種植圃，反應體 系驗證的蒜頭果樣品分別采集自云南省富寧縣者桑 鄉(xiāng)（ZSWY）、富寧縣板侖鄉(xiāng)（MDCWH）及文山州廣南縣董堡鄉(xiāng)（DBX）（圖1）。主要試劑：植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型，DP305）購自天根生 化科技（北京）有限公司；EasyTaq DNA Polymerase （AS111-11）、瓊脂糖（GS201）及其他試劑均購自北 京全式金生物技術股份有限公司。主要儀器設備：DS-11+微量紫外可見分光度計（美國DeNoVIX公 司）、ABI Veriti PCR儀（美國ABI公司）、NuGenius核 酸成像儀（英國Syngene公司）和超純水儀（德國ELGA公司）。

1.2試驗方法

1.2.1基因組DNA提取及檢測

以植物基因組DNA提取試劑盒提取蒜頭果葉片基因組DNA，分別采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳和DS-11+微量紫外可見分光度計檢測DNA質量和濃度，僅條帶明亮清晰且OD260280介于1.8～1.9的樣品可用于后續(xù)研究。

1.2.2 ISSR反應體系設計及優(yōu)化

參考田艷伶等（2015）的研究方案設計單因素試驗及正交試驗，所 用引物均選自加拿大哥倫比亞大學（University of British Columbia，UBC）公布的UBC系列引物?；?于實驗室現(xiàn)有成熟PCR反應體系20uL：1×EasyTaq Buffer，DNA模板50 ng，UBC引物0.2 umol/L，0.200 mmol/L dNTPs，Taq DNA聚合酶1.00 U。擴增程序： 94℃預變性5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min， 進行30個循環(huán)，72℃10min，4℃保存。根據(jù)前期 預試驗設計不同模板DNA濃度、引物濃度、dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶量及不同循環(huán)數(shù)，以UBC860引物對上述5個因素開展單因素試驗（表1），初步篩 選出適合開展ISSR分子標記的反應體系各組分范圍。

根據(jù)單因素試驗結果，初步確定正交試驗L2s （54）的因素和水平，如表2所示。為了保證結果的穩(wěn) 定性和可重復性，每個試驗組設3個重復，依據(jù)ISSR一PCR的擴增效率、擴增特異性、條帶清晰度、背景質 量等擴增質量因素計分。計分范圍1～25分，分數(shù)越 高，表示擴增效果越好。經3次重復試驗后分別對 每個擴增條件進行計分并取平均值。對所得評分采 用直觀量化分析評價法、極差法及方差分析法進行 分析，綜合評估出最佳的ISSR-PCR反應體系。

1.2.3引物退火溫度預測及實際最佳退火溫度確定

采用Tm Calculator軟件（https：//www.genscript. com.cn/tools/oligo-primer-calculation）對初步篩選的8條UBC引物（表3）進行最佳退火溫度預測。以優(yōu)化后的蒜頭果ISSR-PCR反應體系對各引物在8個 退火溫度（50.2、50.8、52.0、54.0、56.5、58.5、59.7和60.3℃）下的擴增效果進行檢測，確定各引物的最佳 退火溫度。

1.2.4優(yōu)化后的蒜頭果ISSR-PCR反應體系驗證

為驗證所構建及優(yōu)化的蒜頭果ISSR-PCR反應體系，采用優(yōu)化后的ISSR-PCR反應體系對3個不同地 理居群共10個樣品進行擴增并獲得0，1矩陣，以 PopGen 32分析計算Nei's基因多樣性指數(shù)（Nei's gene diversity，H’）、Shannon’s信息多樣性指數(shù) （Shannon's information index，I）、多態(tài)性百分率（Percentage of polymorphic bands，PPB）、Nei's基因 分化系數(shù)（Coefficient of gene differentiation，Gg）和 基因流（Estimate of gene flow from Ga，Nm）等指標，以NTSYS-pc 2.10e計算遺傳相似性系數(shù)，并以非加權組平均法（UPGMA）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2結果與分析

2.1蒜頭果DNA提取質量檢測結果

提取的蒜頭果葉片基因組DNA用1.2%瓊脂糖 凝膠電泳進行檢測，結果如圖2所示。所提取的蒜 頭果葉片DNA樣品條帶清晰且無拖尾、彌散等現(xiàn)象，DNA樣品OD260280介于1.8～1.9，表明提取的蒜頭果葉片DNA質量較好，可用于后續(xù)試驗。

2.2蒜頭果ISSR-PCR反應體系的單因素試驗

2.2.1模板DNA用量對蒜頭果ISSR-PCR擴增效果的影響

如圖3所示，從數(shù)量、清晰度、明亮度及 背景來看，6個模板DNA用量擴增獲得的條帶均無明顯差異，表明在蒜頭果ISSR-PCR反應體系中，模板DNA用量對擴增反應的影響相對較小。出于節(jié)約DNA用量的目的，在20uL反應體系中，選擇10～50 ng DNA模板用量進行正交試驗。

2.2.2dNTPs濃度對蒜頭果ISSR-PCR擴增效果的影響

不同dNTPs濃度對ISSR-PCR擴增效果的影響如圖4所示。低濃度dNTPs（0.075～0.100mmol/L）下PCR擴增條帶數(shù)量較少且清晰度較低，中等濃度范圍（0.150～0.300mmol/L）內隨dNTPs濃度越高，條帶數(shù)量和清晰度越高。當dNTPs濃度增加至0.350mmol/L后，條帶數(shù)量開始減少，清晰度也變差。綜合考慮，后續(xù)研究選取0.200～0.400mmol/L中的5個 濃度開展正交試驗。

2.2.3引物濃度對蒜頭果ISSR-PCR擴增效果的影響

由圖5可知，不同濃度引物對ISSR-PCR的影響 呈濃度越高，條帶數(shù)量越多，條帶越清晰的趨勢。綜 合評估條帶數(shù)量、清晰度等因素后，選取0.3～0.7 umol/L中的5個濃度梯度開展正交試驗。

2.2.4 Taq DNA聚合酶用量對蒜頭果ISSR-PCR擴增效果的影響

如圖6可知，當Taq DNA聚合酶用量為0.10～0.25U時，擴增獲得的條帶數(shù)量少且不清晰。隨著TagDNA聚合酶用量的增加，擴增條帶數(shù)量及亮度達到峰值，但同時抹帶情況也顯得較為突 出。當Taq DNA聚合酶用量達1.50U后，擴增條帶情況差異不明顯。綜合考慮各因素，選取0.25～2.00U 范圍中的5個TaqDNA聚合酶用量進行后續(xù)正交試驗。

2.2.5反應循環(huán)數(shù)對ISSR-PCR擴增效果的影響

PCR反應循環(huán)數(shù)對PCR擴增特異性及擴增效率均明顯影響。分別對20、25、30和35個循環(huán)進行檢測，結果如圖7所示。循環(huán)數(shù)僅為20～25個循環(huán)時由于擴增產物太少，不能有效獲得擴增條帶。隨著循環(huán)數(shù)增加，30個循環(huán)時擴增條帶最多、最清晰，35個循環(huán)時條帶數(shù)量明顯減少。根據(jù)上述試驗結果，后續(xù)正交試驗反應循環(huán)數(shù)均為30個循環(huán)。

2.3蒜頭果ISSR-PCR反應體系正交試驗的直觀量化分析結果

采用L23（5）正交試驗設計對25個正交組合進行ISSR-PCR及擴增產物電泳檢測，結果如圖8所示。盡管選取的各因素和水平在單因素試驗中的結果多數(shù)在可接受范圍內，但不同組合的正交試驗組合擴增效果存在明顯差異。A2B1C2D3、A2B2C3D4和A5B5C4D3組合擴增效果較好，而A1B1C1D1、A2B4C5D1和A3B2C4D1組合擴增效果較差。采用直觀法對正交試驗結果進行打分并計算出極差。極差反映了各因素對反應體系的影響，R值越大，影響就越顯著。由表4可知，在蒜頭果ISSR-PCR反應體系中，各因素對擴增效果的影響程度排序為：TaqDNA聚合酶用量gt;dNTPsgt;DNAgt;引物，最大k值對應的水平即為該因素在ISSR-PCR反應體系中的最佳濃度水平，得分最高的組合為A2B1C2D3。

2.4蒜頭果ISSR-PCR反應體系正交試驗的方差分析及多重比較結果

采用方差分析法和Duncan's多重比對法對正交試驗結果進行分析，結果（表5）顯示，除引物濃度因素影響不顯著（Pgt;0.05，下同）外，其他各因素對蒜頭果ISSR-PCR反應影響均為極顯著（Plt;0.001）。從F值可知，各因素對擴增效果的影響程度排序為Taq DNA聚合酶用量gt;dNTPs 濃度gt;模板DNA用量gt;引物濃度，與上述極差分析結果（表4）一致。以 Duncan's 法對不同組合進行多重比較可知，A2B1C2D3、A2B2C3D4 和 A5B5C4D3結果最好且無顯著性差異。綜合考慮直觀量化分析、方差分析及瓊脂糖凝膠電泳結果，后續(xù)研究選取A2B1C2D3組合作為優(yōu)化后的蒜頭果ISSR-PCR反應體系，即在20μL PCR反應體系中加入30ng DNA模板，0.3 umol/L引物，0.250 mmol/L dNTPs，1.00 U TagDNA聚合酶。

2.5退火溫度對ISSR-PCR擴增效果的影響

利用優(yōu)化后的蒜頭果ISSR-PCR反應體系對初步篩選出的8條ISSR-PCR分子標記引物進行最佳退火溫度檢測，結果顯示，不同退火溫度對ISSR-PCR擴增效果存在明顯影響，如UBC827引物擴增結果如圖9所示。此外，部分引物實測最佳退火溫度與軟件預測退火溫度存在明顯差異，如 UBC861引物預測退火溫度與實測最佳退火溫度差值為8.9 °℃（表 6）。所測引物的最佳退火溫度范圍為50.2～56.5°℃。

2.6優(yōu)化后的蒜頭果ISSR-PCR反應體系驗證結果

利用優(yōu)化后的ISSR-PCR反應體系，以UBC827引物對野外采集的3個野生居群共10株蒜頭果葉片樣品進行ISSR-PCR檢測，結果如圖10所示。從10個樣品中擴增獲得清晰、明亮且背景干凈的條帶，擴增效果理想。

以篩選的5條引物（UBC825、UBC826、UBC827、UBC834、UBC844）對3個野生居群的10個樣品進行ISSR-PCR驗證，將獲得的ISSR-PCR條帶轉化為0，1矩陣后計算遺傳相似性系數(shù)和遺傳多樣性相關指標，并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。由遺傳多樣性相關指標（表7）可知，以5條引物驗證10個蒜頭 果樣品的遺傳多樣性時，Ga為0.74，表明其74%的遺傳多樣性存在于居群間，且Nm為0.18，遠小于1.00， 說明發(fā)生遺傳漂變的概率大，易發(fā)生遺傳多樣性降 低及居群分化?；谶z傳相似性系數(shù)（表8）進行聚 類分析，結果（圖11）顯示，在遺傳相似性系數(shù)為0.93 時，10個蒜頭果樣品被分為兩大簇，其中，板侖鄉(xiāng)樣 品與董堡鄉(xiāng)樣品親緣關系較近被劃分為一個大簇， 者桑鄉(xiāng)樣品被劃分為另一個大簇；在遺傳相似性系 數(shù)為0.94時，10個蒜頭果樣品可被清晰的分為三大 簇，表明建立的蒜頭果ISSR-PCR體系可較好地區(qū)分 不同自然分布點的蒜頭果樣品。

3討論

隨著蒜頭果應用價值的日益凸顯，有效開展蒜頭果的種質資源保護與遺傳多樣性研究已成為當前蒜頭果研究工作的重要方向（李洪果等，2019）。建立蒜頭果分子標記PCR反應體系將為這些研究工作的開展打下良好的前期基礎。ISSR分子標記技術因兼具SSR、RAPD、RFLP及AFLP等分子標記的優(yōu)點而被廣泛應用于植物遺傳多樣性評價、種質資源鑒定、功能基因挖掘及定位等領域（朱巖芳等，2010）。在ISSR-PCR反應體系中，DNA聚合酶、引物、模板DNA等組分均會影響其反應穩(wěn)定性和擴增效果，且不同物種的最佳反應體系存在明顯差異（趙麗華和李強，2021）。因此，需針對特定物種建立ISSR-PCR最佳反應體系。本研究采用單因素試驗與正交試驗相結合的方法，確定了各因素對蒜頭果ISSR-PCR反應體系擴增效果的影響程度排序為：Taq DNA聚合酶用量gt;dNTPs濃度gt;模板DNA用量gt;引物濃度，與羅湘等（2021）的龍珠果ISSR-PCR反應體系組分影響程度排序基本一致，但與趙春梅等（2012）的甜瓜 ISSR-PCR反應體系組分影響程度排序完全相反。可見，建立各物種特異的ISSR-PCR反應體系對開展其種質資源保護和遺傳多樣性研究具有重要的意義。

對于常規(guī)PCR擴增，常以軟件預測或經驗公式計算引物退火溫度。本研究對篩選出的引物開展退火溫度梯度試驗，結果顯示實測最佳退火溫度與軟件預測退火溫度存在較大差異，如UBC861預測退火溫度與實測最佳退火溫度相差8.9 °C，且部分引物退火溫度間僅相差2.0 C即可明顯影響ISSR-PCR擴增條帶的數(shù)量及清晰度，表明對所用ISSR-PCR引物進行退火溫度梯度試驗，并根據(jù)試驗結果確定引物的最佳退火溫度，是開展ISSR-PCR分子標記研究不可忽視的關鍵環(huán)節(jié)。

本研究采用優(yōu)化的蒜頭果ISSR-PCR反應體系可獲得清晰、穩(wěn)定的ISSR擴增條帶，根據(jù)有無條帶構建0，1矩陣，再計算遺傳相關指數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)，與同為珍稀瀕危木本植物的毛柄小勾兒茶（B.wibomi）（許鳳華等，2006）、白木香（A.sinensis）（何夢玲等，2022）相比，所采集的3個野生居群10個蒜頭果樣品遺傳多樣性低且發(fā)生遺傳漂變可能性大。此外，地理位置相近的云南富寧縣板侖鄉(xiāng)樣品（MDCWH）與云南文山州廣南縣董河堡鄉(xiāng)樣品（DBX）樣品的遺傳距離也較近。但由于本研究所用蒜頭果樣品和引物數(shù)量均較少，后續(xù)應加大樣本和引物數(shù)量，利用建立的ISSR-PCR反應體系對蒜頭果種質開展深入的遺傳多樣性分析。

4結論

通過優(yōu)化蒜頭果ISSR-PCR反應體系，建立可用于蒜頭果ISSR-PCR分子標記擴增的穩(wěn)定反應體系，可用于蒜頭果種質資源保護與利用研究工作。

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（責任編輯陳燕）