昆明市飲用水源地類固醇類雌激素的背景調(diào)查

摘 要：采用衍生化法-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，對昆明市飲用水源地水體的天然雌激素雌酮（Estrone，E1）、雌二醇（17β-Estradiol，E2）、人工合成的炔雌二醇（17α-ethynylestradiol，EE2）和雌三醇（Estriol，E3）濃度進(jìn)行檢測分析。研究發(fā)現(xiàn)，E1、E2、EE2和E3的的方法檢出限分別為1.98、1.86、2.57和1.93 ng/L。昆明市主城區(qū)六個主要飲用水源地（松華壩、大河、清水海、云龍、寶象河、自衛(wèi)村水庫）的4種雌激素濃度均低于方法檢出限，表明類固醇類雌激素未檢出。

關(guān)鍵詞：類固醇類雌激素；衍生化法-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；飲用水源地

中圖分類號：X83 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-9655（2024）05-00-05

0 引言

類固醇類雌激素內(nèi)分泌干擾物（Environmental estrogen， EEs）主要包括天然雌激素雌酮（Estrone，E1）、雌二醇（17β-Estradiol，E2）、

雌三醇（Estriol， E3）和人工合成的炔雌二醇（17α-ethynylestradiol，EE2）[1]。天然雌激素屬于內(nèi)源性激素[2]，廣泛存在于自然界中生物體內(nèi)，并隨生物體排放到自然環(huán)境中。人工合成雌激素由于其生物化學(xué)性質(zhì)與天然雌激素相似，被廣泛用于藥品和醫(yī)療行業(yè)[3， 4]。水環(huán)境中的雌激素難以完全降解，Wang等人通過3天光照模擬測試了天然雌激素在一定條件下的消除情況，發(fā)現(xiàn)E1、E2、E3的消除速度分別為60.2%、89.0%、87.6%[5]。剩余的雌激素會對以魚類為代表的水生生物造成內(nèi)分泌干擾，并對生殖系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響。E1和其生物轉(zhuǎn)化后的代謝物可能會影響多種魚類的生長發(fā)育，并產(chǎn)生生殖干擾[6]。當(dāng)EE2濃度高于10 ng/L時，對斑馬魚的生殖造成干擾[7] 。

隨著分析測試技術(shù)的進(jìn)步，水環(huán)境中的雌激素被陸續(xù)檢出。例如，美國明尼蘇達(dá)州的湖水中E1和E2的濃度分別為0.05～1.5ng/L和 0.05～0.45 ng/ L[8]。

此外，梁子湖中E1、EE2和E3的濃度分別為0.48～0.77 ng/L、2.56～3.33 ng/L和1.19～1.22 ng/L[9]。與此類似，珠江中E1和E2的濃度為4.2～17.2 ng/L和2.3～8.0 ng/L[10]。這些類固醇類雌激素的環(huán)境暴露已對生態(tài)系統(tǒng)健康造成潛在威脅[1]，因此，亟待開展對水環(huán)境的類固醇類雌激素進(jìn)行濃度監(jiān)測。

目前類固醇類雌激素的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[11]，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12]，超高效液相-串聯(lián)色譜質(zhì)譜法等[13]。黃斌等采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS），通過衍生化劑N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺（N， O-bis （trimethylsilyl） trifluoroacetamide， BSTFA）獲得類固醇類衍生化產(chǎn)物，對滇池水中的雌激素內(nèi)分泌干擾物進(jìn)行了測定[14]。馮慧等通過采用超聲輔助萃取-吸附劑凈化-高效液相色譜-質(zhì)譜法對部分類固醇類內(nèi)分泌干擾物進(jìn)行了測定，四類雌激素其回收率為64.4%～75.7%[15]。

飲用水源地是重要的水源保護(hù)區(qū)，大多位于水源上游河段，受人類活動的影響較少[16]，因此可在一定程度上客觀反應(yīng)自然環(huán)境水體中雌激素的背景，為類固醇類雌激素的環(huán)境背景值提供參考依據(jù)。本研究采用衍生化-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對昆明市六個飲用水源地的水樣品進(jìn)行類固醇類雌激素的分析測定，研究飲用水源地的類固醇類雌激素的濃度，并通過測定結(jié)果對水環(huán)境中的類固醇類雌激素背景值進(jìn)行探討。

1 實驗部

1.1 儀器試劑

TQ8040氣相色譜-質(zhì)譜儀（日本島津公司）；色譜柱（XBC-5MS，30 m× 0.25 μm× 0.25 mm）；固相萃取儀；全自動定量濃縮儀（Dryvap）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)氮吹儀；十萬分之一電子天平；振蕩器；固相萃取PLS小柱；0.45 μm玻璃纖維濾紙；5 mL容量瓶；巴斯德玻璃吸管。

雌酮（固體，1 g，CAS：53-16-7，北京百靈威公司Jamp;K）、17β-雌二醇（固體，1 g，CAS：50-28-2，北京百靈威公司Jamp;K）、雌三醇（固體，1 g，CAS：50-27-1，上海梯希愛）、17α-乙炔基雌二醇（固體，1 g，CAS：57-63-6，美國SIGMA-ALDRICH）、雄烷（固體，25 mg，CAS：438-22-2，德國DR.Enrenstorfer）、雌酮-d4（固體，0.25 mg，CAS：53866-34-5）、N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺（N，O-bi（（trimethylsily））trifluoroacetamid，，BSTFA）（5 mL，98%，10%TMCS，美國SIGMA-ALDRICH，CS：25561-30-2）、甲醇（美國DiKMA）、吡啶（美國HACH）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)備

取數(shù)個5 mL容量瓶于450℃下烘烤4 h備用。分別稱取E1、E2、EE2、E3、雄烷（內(nèi)標(biāo)）、E1-d4（替代）各5 mg，用甲醇溶解E1、E2、EE2、E3、E1-d4（替代）并用5 mL容量瓶分別將其定容，用吡啶溶劑溶解雄烷（內(nèi)標(biāo)）并用5 mL容量瓶將其定容，配置成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，將上述E1、E2、EE2、E3配置為10 mg/L混合中間溶液，替代和內(nèi)標(biāo)溶液分別配置為10mg/L中間溶液，放入-20℃冰箱待用，實驗時再配置為所需濃度溶液。

1.3 樣品采集與樣品前處理

使用棕色玻璃瓶保存水樣，采樣瓶預(yù)先洗凈，置于500℃馬弗爐烘干，以去除有機(jī)物干擾。分別采集松華壩、大河、清水海、云龍、寶象河、自衛(wèi)村水庫共六個飲用水源地的壩中和壩口的表層水1 L。使用5 mL甲醇現(xiàn)場固定，避光于4℃ 以下冷藏，盡快運回實驗室，24 h內(nèi)完成萃取，7 d內(nèi)完成樣品分析。

將1 L水樣通過0.45 μm濾膜過濾，采用固相萃取法[17]進(jìn)行萃取，使用甲醇和丙酮混合溶劑洗脫，將洗脫溶劑吹干后，加入BSTFA試劑進(jìn)行衍生化反應(yīng)，使用吡啶定容，使用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對樣品進(jìn)行分析。

1.4 校準(zhǔn)溶液配置

分別取1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL、50 μL、100 μL濃度為10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至1.5 mL色譜進(jìn)樣瓶中，用高純氮氣吹干，加入BSTFA反應(yīng)，加入50 μL 濃度為10 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液，使用吡啶定容到1 mL，得到濃度為10～1000 μg/L的校準(zhǔn)曲線。

1.5 儀器分析條件

色譜柱為XBC-5MS，載氣為氦氣，CID氣為氬氣，流速1 mL/min，不分流方式進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度280℃，進(jìn)樣體積1 μL；色譜柱柱箱：起始溫度50℃，保持2 min，以20℃/min升溫至240℃，保持2 min，以12℃/min升溫至260℃，保持3 min，以3℃/min升溫至280℃，保持4 min。接口溫度300℃，EI離子源溫度250℃，電子轟擊能量70eV，溶劑延時12 min，質(zhì)譜掃描起始時間14.7 min，結(jié)束時間28 min。

2 實驗結(jié)果與討

2.1 離子色譜圖與碎片離子的選擇

采用衍生化法對4種雌激素進(jìn)行衍生化，使用吡啶定容到1 mL，各取1 μL注入GC-MS/MS分析，通過SCAN模式得到結(jié)果如圖1所示。

選擇分子離子和豐度較高的碎片離子進(jìn)行定性和定量，分別為TMS-E1產(chǎn)物離子257 m/z，前體離子342 m/z；di-TMS-E2產(chǎn)物離子285 m/z，前體離子416 m/z；di-TMS-EE2產(chǎn)物離子285 m/z，前體離子440 m/z；tri-TMS-E3產(chǎn)物離子345 m/z，前體離子504 m/z。

2.2 校準(zhǔn)曲線與檢出限

通過將不含分析物的空白水樣配制成系列濃度梯度的樣品溶液分析得到4種分析物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限如表1所示。檢出限的計算方式為S/N＞3倍濃度下的低濃度連續(xù)7次進(jìn)樣后的標(biāo)準(zhǔn)偏差和t值的乘積。

通過測定，該檢測方法線性擬合度良好，決定系數(shù)均在0.999以上，4種雌激素的檢出限為1.82～2.57 ng/L，適宜樣品的痕量分析。

2.3 飲用水源地測定結(jié)果

使用衍生化-固相萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對六個飲用水源地水樣進(jìn)行測試，測試結(jié)果如表2所示，低于檢出限的以ND表示。

通過對飲用水源地的分析測定，發(fā)現(xiàn)在未受污染的水體中天然雌激素含量均低于檢出限，同時未發(fā)現(xiàn)人工合成雌激素。替代回收率范圍在63.1%～100%，回收率效果良好。

2.4 類固醇類雌激素的生態(tài)風(fēng)險

類固醇類雌激素作為一種內(nèi)分泌環(huán)境污染物，其在水環(huán)境的含量和分布一直備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，雌酮含量＞20 ng/L會對斑馬魚的精子質(zhì)量和數(shù)量造成影響[18]，雌二醇當(dāng)量濃度在640～1200 ng/L時可能會給魚類帶來高風(fēng)險[19]，水體中雌三醇由于易被光照降解[20]，因此很少在水體中檢出。本研究表明，昆明市飲用水源地水體中的4種雌激素濃度均低于各自方法檢出限1.86～1.98 ng/L，且遠(yuǎn)低于上述文獻(xiàn)的生物毒性濃度。今后應(yīng)定期對昆明市飲用水源地開展類固醇類雌激素含量監(jiān)測，為類固醇類雌激素污染風(fēng)險提供參考信息。

3 結(jié)論

本研究通過衍生化-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對昆明市主城區(qū)六個主要飲用水源地中的雌酮（Estrone，E1）、雌二醇（17β-Estradiol，E2）、雌三醇（Estriol，E3）和人工合成的炔雌二醇（17α-ethynylestradiol，EE2）共4種雌激素含量進(jìn)行分析測定。結(jié)果表明，E1、E2、EE2、E3的方法檢出限分別為1.98 ng/L、1.86 ng/L、

2.57 ng/L、1.93 ng/L，松華壩、大河、清水海、云龍、寶象河、自衛(wèi)村水庫六個主要飲用水源地中的4種類固醇類雌激素均未檢出。后期應(yīng)該對昆明市飲用水源地的雌激素含量進(jìn)行持續(xù)關(guān)注，若發(fā)現(xiàn)類固醇類雌激素濃度高于檢出限時，可能存在外來污染源。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫雯雯. 洱海和滇池魚類中兩類典型環(huán)境激素生物效應(yīng)研究[D]. 昆明：昆明理工大學(xué)， 2015.

[2] 段云麗.分子印跡固相微萃取纖維涂層萃取分析水體中多種環(huán)境雌激素[D].昆明：昆明理工大學(xué)，2023.

[3] 曹媛媛.乙炔雌二醇/醋酸環(huán)丙孕酮對肥胖型多囊卵巢綜合征患者內(nèi)分泌和代謝的影響[J].中國校醫(yī)，2020，34（4）：294-295.

[4] 彭昌瓊.探討雌激素在治療萎縮性陰道炎患者中的應(yīng)用價值[J].中國保健營養(yǎng)，2012，22（20）：4611-4612.

[5] Xinghao Wang. Phototransformation of estrogens mediated by Mn（III）， not by reactive oxygen species， in the presence of humic acids[J]. Chemosphere， 2018（201）： 224-233.

[6] Make A，Tapper，et al. Conversion of Estrone to 17β‐Estradiol： A Potential Confounding Factor in Assessing Risks of Environmental Estrogens to Fish[J]. Environmental Toxicology and Chemistry， 2020， 39（10）： 2028-2040.

[7] Jianghuan Hua，Jian Han，Xianfeng Wang， et al. Thebinary mixtures of megestrol acetae and 17α-ethynylestradiol adversely affect zebrafishreproduction[J]. Environmental Pollytion， 2016 （213）：776-784.

[8] Writer J H， Barber L B， Brown G K， et al. Anthropogenic tracers， endocrine disrupting chemicals， and endocrine disruption in Minnesota Lakes[J]. Science of the Total Environment， 2010，409（1）：100-111.

[9] 賀小敏，施敏芳，葉蕓.梁子湖水體中環(huán)境激素的分布及生態(tài)風(fēng)險評價[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2023，46（1）.

[10] Wang C， Zhao Y， Liu S， et al. Contamination， distribution， and risk assessment of antibiotics in the urban surface water of the Pearl River in Guangzhou， South China[J]. Environ Monit Assess， 2021.

[11] 羅慶，孫麗娜，楊悅鎖，等.固相萃取-衍生化-氣相色譜-質(zhì)譜法測定水中類固醇類雌激素[J].理化檢驗（化學(xué)分冊）， 2015，51（10）.

[12] 孫嘥琳.固相萃取-高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法用于地表水中類固醇激素測定[J].環(huán)境監(jiān)控與預(yù)警， 2018，10（5）.

[13] 劉宇塵，周劍，王敏，等.同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋中3種類固醇激素[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2021，12（24）.

[14] 黃斌，潘學(xué)軍，劉晶靚，等.類固醇類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物羥基衍生化研究[J].分析化學(xué)， 2009，37（11）.

[15] 馮慧，徐欣，彭鵬，等.環(huán)境固體樣品中多種甾體激素的同步檢測方法及條件優(yōu)化[J].中國環(huán)境監(jiān)測，2023，39（2）：214-224.

[16] 張桂娟，何斌，蘇雅莉，等.飲用水源保護(hù)區(qū)地方法規(guī)建設(shè)現(xiàn)狀與法律保護(hù)對策分析[J].環(huán)境保護(hù)科學(xué)，2023.

[17] 黃斌，潘學(xué)軍，萬幸，等.固相萃取-衍生化-氣相色譜/質(zhì)譜測定水中類固醇類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[J].分析化學(xué)，2011，390（4）.

[18] Moreira Y R， Peruci D M， Alberto A W， et al. Chronic estrone exposure affects spermatogenesis and sperm quality in zebrafish （Danio rerio）[J].Environmental Toxicology andPharmacology，2023（98）.

[19] Kai Lei， Chun-Ye Lin， Ying Zhu， et al. Estrogens in municipal wastewater and receiving waters in the Beijing-Tianjin-Hebei region， China：Occurrence and risk assessment of mixtures[J]. Journal of Hazardous Materials， 2020（389）：121891.

[20] Chen Y，Zhang K，Zuo Y.Direct and indirect photodegradation of estriol in the presence of humic acid， nitrate and iron complexes in water solutions[J].Science of the Total Environment，2013，463-464802-809.

Background Investigation on Steroid Estrogens in the Drinking Water Sources in Kunming

Li Rui， BIAN Shi-wen， YAN Kun， XU Xiao-feng， WEI Tian-yu， LI Shi-gang， ZHOU Yuan

（Kunming Ecological and Environmental Monitoring Station of DDEY，" Kunming Yunnan 650228，China）

Abstract： In this paper， derivatization and gas chromatography-tandem mass spectrometry were used to test the concentrations of natural Estrone （E1）， estradiol （17β-Estradiol， E2）， Estriol （E3） and synthetic ethinyl estradiol （17α-ethynylestradiol， EE2） in the drinking water sources of Kunming. The detection limits of E1， E2， EE2 and E3 were 1.98， 1.86， 2.57 and 1.93ng/L， respectively. The concentrations of four estrogens in the six main drinking water sources （Songhuba， Dahe， Qingshuihai， Yunlong， Baoxianghe， Ziweicun Reservoir） in the main urban area of Kunming were all lower than the detection limits， indicating that steroid estrogens were not detected.

Key words： steroid estrogens; derivatization and gas chromatography-tandem mass spectrometry; drinking water source

作者簡介：李銳（1991-），男，工程師，研究方向為環(huán)境監(jiān)測與分析。

通信作者：周圓。