茉莉花節(jié)間莖段的離體培養(yǎng)和植株再生

摘要要：【目的】通過雙瓣茉莉（Jasminum sambac）節(jié)間莖段離體培養(yǎng)獲得再生植株，填補(bǔ)通過愈傷組織獲得再生植株報(bào)道的空白。【方法】以雙瓣茉莉節(jié)間莖段為外植體，設(shè)置不同84消毒液和Tween-20濃度組合篩選適宜的外植體消毒方式，并在此基礎(chǔ)上設(shè)置9種不同的6-BA和NAA濃度組合篩選適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、分化及完整植株再生?！窘Y(jié)果】茉莉花節(jié)間莖段經(jīng)20%的84消毒液中滴加0.1 mL

Tween-20消毒12 min時(shí)，污染率低且成活率高；在MS + 1.5 mg/L 6-BA + 1.5 mg/L NAA + 30 g/L 蔗糖 + 6 g/L 瓊脂培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%。在此培養(yǎng)基生長(zhǎng)2個(gè)月后，莖段產(chǎn)生的愈傷組織開始分化形成芽和根；培養(yǎng)至第6個(gè)月，開始形成莖和葉；培養(yǎng)至第8個(gè)月，開始形成完整植株；培養(yǎng)至第12個(gè)月時(shí)，愈傷組織開始逐漸褐化，植株的生長(zhǎng)放緩，部分葉片出現(xiàn)枯焦。【結(jié)論】茉莉花節(jié)間莖段誘導(dǎo)愈傷組織可在不繼代的情況下再生為完整植株，為茉莉花遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株提供了途徑。

關(guān)鍵詞：茉莉花；莖段；愈傷組織；組培；再生；完整植株

中圖分類號(hào)：S685.16" " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " " " " " " " 文章編號(hào)：2095-5774（2024）03-0194-09

In Vitro Culture and Plant Regeneration of Internode Stem Segment of Jasminum sambac

Abstract：【Objective】 To obtain regenerated plants by in vitro culture of internode stem segment of Jasminum sambac and fill the gap in reports on the regenerated plants obtained from callus. 【Method】 The internode stem segments of J. sambac were selected as the explants and different concentrations of 84 disinfectant and Tween-20 were selected for suitable explant disinfection method. On this basis，9 combination of different concentration of 6-BA and NAA were set to screen suitabl media for callus induction，differentiation and complete plant regeneration.【Result】When 0.1 mL Tween-20 was added to 20% 84 disinfectant and internode stem segments were disinfected for 12 min，the contamination rate of the explants was low and the survival rate was high. The callus induction rate reached 100% on MS medium + 1.5 mg/L 6-BA + 1.5 mg/L NAA + 30 g/L sucrose + 6 g/L Agar. After 2 months of growth on this medium，the callus generated from stem segments could differentiate into shoots and roots. When the callus continued to grow on this medium at the 6th month，stems and leaves began to appear. When the callus continued to grow to the 8th month，the complete plants began to appear. When cultivating to the 12th month，the callus began to browning gradually，the growth of the plant slowed down，and some leaves appeared scorched. 【Conclusion】The internode stem callus could be regenerated into complete plants without secondary culture，which provided a way to obtain transgenic plants through genetic transformation of Jasminum sambac.

Key words：Jasminum sambac；Stem；Callus；Tissue culture；Regeneration；Complete plant

茉莉花［Jasminum sambac（L）. Ait］為木犀科（Oleaceae）素馨屬（Jasminum）常綠灌木，其花具有馥郁的香氣，在花茶窨制［1］、香精提?。?］、食品藥品［3］等方面被廣泛地應(yīng)用，具有重要的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。我國(guó)茉莉花引種栽培歷史悠久，栽培形式多樣，目前栽培面積已超過1萬ha，是世界上茉莉花產(chǎn)量最多的國(guó)家，年產(chǎn)量占世界產(chǎn)量的80%以上［4-5］。茉莉花自然敗育率高，田間結(jié)實(shí)率極低［6］，其種苗的主要來源是扦插繁殖［7-10］，而長(zhǎng)期扦插繁殖會(huì)導(dǎo)致植株生長(zhǎng)退化而出現(xiàn)香氣減弱的現(xiàn)象，因此利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)茉莉花進(jìn)行復(fù)壯，成為加快茉莉花繁殖速度、提高幼苗質(zhì)量的重要手段。此外，高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)改良品種具有巨大潛力［11-15］，盡管茉莉花具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，且轉(zhuǎn)基因技術(shù)在百合、菊花等許多觀賞植物上已取得突破［16-18］，但茉莉花遺傳轉(zhuǎn)化體系尚未有報(bào)道，這成為限制茉莉花品種改良和基因工程技術(shù)發(fā)展的瓶頸，獲得茉莉花遺傳轉(zhuǎn)化體系將成為解決這一問題的關(guān)鍵方法。

目前，針對(duì)茉莉花組培快繁的研究大部分限于利用莖段、帶芽莖段進(jìn)行快繁體系建立，以及愈傷組織誘導(dǎo)和繼代保持，如甘煌燦等［19］以茉莉花莖段及花瓣為試驗(yàn)材料，發(fā)現(xiàn)莖段能較好的誘導(dǎo)出愈傷組織，同時(shí)發(fā)現(xiàn)6-BA與NAA合適的配比可以誘導(dǎo)出質(zhì)量較好且能長(zhǎng)期繼代保持的愈傷組織。莊哲煌等［20］利用茉莉花花瓣誘導(dǎo)愈傷組織，建立茉莉花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系的方法。何麗斯［21］選取當(dāng)年生半木質(zhì)化帶腋芽的莖段為外植體，成功誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)、伸長(zhǎng)生長(zhǎng)、生根。李聰聰?shù)龋?2］以雙瓣茉莉帶腋芽的莖段為外植體，建立起雙瓣茉莉組織培養(yǎng)快速繁殖的技術(shù)體系。蔡漢等［23］對(duì)雙瓣茉莉進(jìn)行了離體微繁及無糖生根技術(shù)研究。孫艷妮等［24］以WPM為基本培養(yǎng)基，比較了不同6-BA和IBA配比對(duì)茉莉花莖段芽誘導(dǎo)的影響及不同溫度條件下不同6-BA和IBA配比對(duì)茉莉花芽增殖的影響，并以1/2 WPM為培養(yǎng)基，比較了不同NAA濃度處理及不同生根方法對(duì)離體芽生根的影響。盧瑩［25］以茉莉花莖段和葉片作為外植體，以WPM為基本培養(yǎng)基，篩選出誘導(dǎo)愈傷組織的最佳消毒時(shí)間和植物激素配比以及愈傷組織繼代增殖、誘導(dǎo)分化的最佳培養(yǎng)基。盡管如此，這些研究結(jié)果仍停留在愈傷組織誘導(dǎo)根或芽，或快繁的層面，未有通過愈傷組織誘導(dǎo)獲得完整植株的報(bào)道。

由于茉莉花的遺傳轉(zhuǎn)化體系目前主要通過愈傷組織作為受體轉(zhuǎn)化外源基因，再誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的愈傷組織分化芽及根，進(jìn)而獲得完整的轉(zhuǎn)基因植株。因此通過愈傷組織誘導(dǎo)獲得植株再生成為關(guān)鍵的技術(shù)要點(diǎn)。本研究以無腋芽的節(jié)間莖段為外植體，通過培養(yǎng)基篩選及培養(yǎng)方式的探索，成功通過愈傷組織誘導(dǎo)了植株再生，為進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)基因后的愈傷組織進(jìn)行植株再生，從而獲得完整的茉莉花遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

三年生雙瓣茉莉種植于盆中（盆直徑5 cm，高10 cm），基質(zhì)為泥炭土：珍珠巖：蛭石=713（VVV）。植株放置于人工氣候室，溫度26℃/ 22℃（晝/夜），光周期為16 h / 8 h（晝/夜），濕度為70%，日常常規(guī)養(yǎng)護(hù)。

1.2外植體消毒方式篩選

參照盧瑩［25］方法，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。選取茉莉花剛抽生的幼嫩健康的節(jié)間莖段為外植體材料，在含有適量洗衣粉的水中浸泡30 min；隨后使用純水沖洗10 min，泡入無菌水中備用；移入超凈工作臺(tái)內(nèi)，用75%乙醇表面滅菌處理30 s，無菌水沖洗3～5次；隨后用添加了Tween-20的84消毒液，消毒12 min；所用84消毒液的主要成分為次氯酸鈉，有效氯含量 5.5%～6.5%，使用濃度為10%、20%、30%；Tween-20的添加用量為0.1、0.2、0.3 mL；最后用無菌水沖洗3～5次，直至無泡沫。消毒后接種于MS + 2.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA 培養(yǎng)基中（含 30 g/L 蔗糖和 6 g/L 瓊脂，pH為5.8）［19］。莖段切成1 cm的長(zhǎng)度，每個(gè)處理接種10個(gè)外植體，重復(fù)10次。置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，光強(qiáng)1 500 lx，光周期為16 h / 8 h （晝/夜）。30 d

后統(tǒng)計(jì)外植體的污染率和成活率。

污染率（%）= 污染外植體數(shù)/外植體總數(shù) × 100%

成活率（%）=成活外植體數(shù)/外植體總數(shù) × 100%

1.3 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

以 MS + 30 g/L蔗糖+ 6 g/L瓊脂（pH=5.8）為基本培養(yǎng)基，添加6-BA和NAA兩種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，6-BA和NAA各設(shè)置3個(gè)濃度，其中6-BA濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg/L，NAA濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/L。使用上述篩選的適宜莖段的消毒方式進(jìn)行消毒，然后接種設(shè)置的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。每個(gè)處理接種10個(gè)外植體，重復(fù)10次。置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，光強(qiáng)1 500 lx，光周期為16 h / 8 h（晝/夜）。接種30 d后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)目，篩選最適宜愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方。

1.4 不定芽、不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)

將表面滅菌處理后的茉莉花莖段置于滅菌濾紙上吸去多余的水分，切除莖段上的芽點(diǎn)，切成1 cm左右的長(zhǎng)度，接種于組培瓶?jī)?nèi)，每瓶接種20～25個(gè)莖段，共接種20瓶，每個(gè)處理共接種450個(gè)莖段，放置于上述已篩選出的最佳培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，光強(qiáng)1 500 lx，光周期為16 h / 8 h（晝/夜）。整個(gè)組織培養(yǎng)過程中不進(jìn)行轉(zhuǎn)接。

1.5 愈傷組織誘導(dǎo)率、芽及根分化率的計(jì)算

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù) × 100%

芽分化率（%）=分化芽的外植體數(shù)/外植體總數(shù) × 100%

根分化率（%）=分化根的外植體數(shù)/外植體總數(shù) × 100%

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用 Microsoft Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用 IBM SPSS Statistics 26.0軟件的單因素 ANOVA 進(jìn)行顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式下茉莉花莖段外植體的污染率與成活率比較

茉莉花莖段外植體經(jīng)不同的消毒方式消毒后，接種到培養(yǎng)基上，30 d后統(tǒng)計(jì)其污染率與成活率（如表1所示）。結(jié)果顯示，在20% 84消毒液中滴加0.3 mL Tween-20處理時(shí)間為12 min 時(shí)，污染率在9個(gè)處理中最低，僅為8.2%，其成活率為82.4%；而在20% 84消毒液中滴加0.1 mL Tween-20消毒處理時(shí)間為12 min 時(shí)，污染率為8.6%，但其成活率最高，為89.3%。綜合考慮經(jīng)濟(jì)效益以及污染率、成活率，最終選擇20% 84消毒液中滴加0.1 mL Tween-20處理時(shí)間為12 min 的消毒方式，污染率低且成活率高。

2.2不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基下茉莉莖段愈傷組織誘導(dǎo)率比較

通過比較不同培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率可以得出，在6號(hào)培養(yǎng)基（MS + 2.0 mg/L 6-BA + 1 mg/L

NAA + 30 g/L 蔗糖+ 6 g/L 瓊脂）上培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)率最低，僅為15.6%；在8號(hào)培養(yǎng)基（MS +

1.5 mg/L 6-BA + 1.5 mg/L NAA + 30 g/L 蔗糖+ 6 g/L 瓊脂）上茉莉花莖段的誘導(dǎo)率都能達(dá)到99.6%（如表2所示），顯著高于其他處理，且誘導(dǎo)出的愈傷組織類似于胚性愈傷組織。

2.3 愈傷組織的誘導(dǎo)及芽和根的分化

以不帶腋芽的茉莉花莖段為外植體，接種至MS + 30 g/L蔗糖+ 1.5 mg/L NAA + 1.5 mg/L 6-BA + 6 g/L瓊脂（pH = 5.8）培養(yǎng)基中，30 d后所有莖段兩端均產(chǎn)生大量翠綠飽滿的愈傷組織，誘導(dǎo)率為100%（圖1）。

在此培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月時(shí)，發(fā)現(xiàn)有20個(gè)莖段的愈傷組織分化開始形成芽，分化率為4.4%（圖2A，B），有40個(gè)莖段的愈傷組織開始分化出根，分化率為8.9%（圖2C，D）。

2.4" 芽的生長(zhǎng)及葉的出現(xiàn)

茉莉花莖段愈傷組織在原培養(yǎng)基上不繼代繼續(xù)培養(yǎng)至第6個(gè)月時(shí)，此時(shí)更多愈傷組織分化出芽和根，芽和根的分化率分別為8.0%和11.6%。有些芽開始出現(xiàn)葉的雛形，部分分化了芽的愈傷組織產(chǎn)生了根（圖3）。

2.5" 完整植株的形成

茉莉花莖段培養(yǎng)至8個(gè)月后，分化出更多的芽和根，芽和根的分化率分別為10.7%和12.2%。短莖上的葉片展開（圖4A）；部分芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)為莖，莖上生節(jié)，節(jié)上長(zhǎng)葉（圖4B）；同時(shí)莖逐漸長(zhǎng)粗，葉片逐漸長(zhǎng)大展開（圖4C）；分化形成的芽上也開始分化出根，形成完整的植株（圖4 D-F）。

2.6" 植株的衰老

茉莉花莖段繼續(xù)培養(yǎng)至12個(gè)月時(shí)，芽和根繼續(xù)分化，芽和根的分化率分別達(dá)到11.6%和13.8%。此時(shí)部分愈傷組織開始出現(xiàn)褐化，一些植株的葉片也出現(xiàn)黃化（圖5）。

3討論與小結(jié)

茉莉花是一種木本植物，由于木本植物生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)且次生代謝物較多，生命活動(dòng)更復(fù)雜，因此建立再生體系較為困難，再生條件的穩(wěn)定性和普適性差［26-27］。在木本植物的組織培養(yǎng)中，外植體的消毒是決定組培成功的關(guān)鍵因素之一［28］。消毒效果差，則污染率高，無法提供足夠的材料進(jìn)行下一步的組培研究；但是消毒處理過重，則會(huì)導(dǎo)致材料的生命力減弱甚至死亡。在前人的研究中，施用于茉莉花外植體的消毒劑主要包括氯化汞、次氯酸鈉、84消毒液［19-20，29］。然而，氯化汞目前處于國(guó)家管控，不方便使用；次氯酸鈉或84消毒液被多次報(bào)道應(yīng)用于茉莉花外植體的消毒［19-21，24］，且發(fā)現(xiàn)與表面活性劑進(jìn)行組合其消毒效果極好［25，29］，但未曾探索過表面活性劑使用濃度對(duì)外植體消毒的影響。本研究在使用前人報(bào)道的應(yīng)用頻率最高的84消毒液的基礎(chǔ)上，設(shè)置了不同的84消毒液濃度、Tween-20用量，發(fā)現(xiàn)采用20% 84消毒液中添加0.1 mL Tween-20處理12 min的消毒方式，成活率最高可以達(dá)到89.3%，高于僅使用消毒液的效果［19-20，30］，這與盧瑩［25］、張?jiān)碌龋?9］在茉莉花中的研究結(jié)果一致，也與鄒永梅等［31］對(duì)萬壽菊外植體的消毒探索，以及張瑞越等［32］對(duì)油菜種子的消毒研究中發(fā)現(xiàn)的結(jié)論一致。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)外植體成活率并未隨著Tween-20使用量的增加而增加，說明Tween-20只是起到清潔外植體表面，去除表面的污垢、油脂和雜質(zhì)［33］的作用，其使用量并不會(huì)直接影響外植體的成活率。

外植體的選擇是影響植物再生體系建立的重要條件之一，不同部位的外植體在組織培養(yǎng)中具有不同的再生潛力。在茉莉花的組織培養(yǎng)及快繁中，盡管有報(bào)道過以茉莉花種子獲得的下胚軸為外植體，直接通過不定芽途徑建立高效再生體系［34］，

但茉莉花的種子極難獲得。因此，目前主要使用的外植體包括花瓣、帶芽的莖段、節(jié)間莖段、葉片［19-25，29］，相比莖段，花瓣作為外植體取材與消毒比較難控制同時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)更為困難［20］，葉片長(zhǎng)出的愈傷組織易褐化，產(chǎn)生愈傷組織的能力也不如莖段［25］，因此莖段是目前使用最多的一種外植體。本研究基于前人的研究結(jié)果選擇了節(jié)間莖段作為外植體，相比帶芽的莖段材料更易獲得、材料數(shù)量更多，且結(jié)合適宜的消毒方式，成活率最高可達(dá)89.3%，能較好的在將來的實(shí)踐中廣泛應(yīng)用。

本研究以MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基培養(yǎng)外植體可縮短愈傷組織形成的時(shí)間，與甘煌燦等［19］、趙玉宏［34］的研究結(jié)果一致，與李聰聰?shù)龋?2］、孫艷妮等［24］、張?jiān)碌龋?9］的研究結(jié)果有所差異。本試驗(yàn)選擇了細(xì)胞分裂素6-BA和植物生長(zhǎng)素NAA這2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，并通過設(shè)置不同濃度6-BA和NAA，篩選出最適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS + 30 g/L蔗糖+ 1.5 mg/L NAA +1.5 mg/L 6-BA + 6 g/L瓊脂），與張曉軍［30］、趙玉宏［34］發(fā)現(xiàn)的6-BA和NAA配合使用誘導(dǎo)效率較高一致；與甘煌燦等［19］的研究結(jié)果有所差異。

前人研究表明，組培過程中需要不停繼代以保持愈傷組織或不定芽的活性［35-36］，本研究前期也曾持續(xù)繼代以保持芽的活性，但隨著換瓶次數(shù)的增加，愈傷組織、芽或根會(huì)逐漸褐化或停止生長(zhǎng)。因此，本研究首次嘗試不繼代的培養(yǎng)方式從莖段愈傷組織獲得完整再生植株，這與趙玉宏［34］的研究結(jié)果有所差異，具體原因還需要進(jìn)一步研究。

培養(yǎng)12個(gè)月后，長(zhǎng)期不繼代瓶?jī)?nèi)空間有限、植株數(shù)量過多、營(yíng)養(yǎng)不足，導(dǎo)致一些植株出現(xiàn)了葉片枯黃、愈傷組織褐化的情況。因此可在第8個(gè)月已有完整植株形成時(shí)進(jìn)行繼代或移栽處理，或減少單個(gè)組培瓶里接種的外植體數(shù)量。

綜上所述，本研究以茉莉花節(jié)間莖段為外植體，在前人研究的基礎(chǔ)上優(yōu)化了外植體消毒方式，篩選了適宜的培養(yǎng)基，并通過長(zhǎng)期（8個(gè)月）持續(xù)不繼代的培養(yǎng)方式從莖段愈傷組織獲得完整再生植株。這個(gè)結(jié)果相較前人僅停留在愈傷組織誘導(dǎo)根或芽，或是快繁的研究是一個(gè)突破，為后期通過轉(zhuǎn)化的茉莉花愈傷組織獲得再生植株打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，對(duì)突破茉莉花遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的瓶頸有重要意義。

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